Введение к работе
Актуальность проблемы
В последние годы все большую клиническую актуальность приобретает проблема нарушений в составе симбиотических ассоциаций, представляющих нормальную микрофлору кожных покровов человека. Дисбаланс нормального микробиоценоза является одним из ведущих этиологических факторов развития гнойно-воспалительных заболеваний в дерматологической практике (Ростовщикова М.В., 2011). Все более широкое применение в профилактике и лечении кожных заболеваний находят биопрепараты – пробиотики, которые содержат живые культуры нормальной микрофлоры человека и/или вещества микробного происхождения (в т.ч. метаболиты), оказывающие благоприятные эффекты на физиологические функции и биохимические реакции организма хозяина через оптимизацию его микроэкологического статуса (Бондаренко В.М., 2007; Шендеров Б.А., 2011).
Антагонистическая активность пробиотических штаммов играет ведущую роль при их отборе в качестве производственно перспективных микроорганизмов. Механизм осуществления данного свойства связан с продукцией этими бактериями органических кислот, в первую очередь молочной и уксусной, аминокислот, антибиотикоподобных веществ – бактериоцинов, витаминов и микроэлементов (Онищенко Г.Г. и др., 2002; Светоч Э.А., 2011; Бондаренко В.М., 2012). Бактериоцины и кислоты подавляют рост патогенных микробов, оказывая противовоспалительное действие. Пептиды способствуют повышению местного иммунитета кожи и слизистых открытых полостей. Углеводы, аминокислоты и витамины питают кожу и усиливают обменные процессы, стимулируют репарацию тканей, оказывают смягчающее действие. В связи с этим представляется актуальным создание лечебно-профилактических средств, содержащих комплексный набор продуктов жизнедеятельности пробиотических микроорганизмов для осуществления заместительной терапии с последующим восстановлением нарушенного бактериоценоза и оптимизацией микроэкологии кожных покровов (Алешкин В.А., 2006; Поспелова В.В., 2007).
Согласно ряду предварительных исследований, проведенных в МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, наиболее перспективными пробиотическими продуцентами биологически активных веществ являются штаммы лактобацилл, входящие в трехкомпонентный консорциум препарата «Ацилакт» (Поспелова В.В., 2009; Амерханова А.М., 2010; Алешкин А.В., 2011). Разработка метаболитного пробиотика на его основе позволит с одной стороны оптимизировать технологически трудоемкий процесс получения стандартизированного биопрепарата, а с другой – удовлетворить все более возрастающую потребность российского фармацевтического рынка в пробиотических средствах для наружного применения.
Цель исследования
Разработать пробиотическое средство наружного применения на основе супернатанта лактобацилл с подтвержденными комплексом доклинических исследований безопасностью и эффективностью использования в дерматологической практике.
Задачи исследования
-
Используя комплексную фенотипическую и молекулярно-генетическую оценку производственных микроорганизмов отобрать перспективные штаммы лактобацилл как основу для создания пробиотического средства наружного применения.
-
Исследовать спектр биологически активных веществ (пептидов, амино- и других органических кислот) и других факторов (профиль бактерицидной активности), обусловливающих пробиотический эффект супернатанта и ультрафильтрата культуральной жидкости лактобацилл.
-
Подтвердить безопасность супернатанта и ультрафильтрата культуральной жидкости лактобацилл в экспериментах по острой и хронической токсичности на лабораторных животных.
-
Сконструировать рецептуру и отработать пилотную технологию крема (космецевтического средства) на основе супернатанта культуральной жидкости лактобацилл.
-
Оценить эффективность применения наружного пробиотического средства (крема) в опытах с экспериментально инфицированными и естественно травмированными млекопитающими.
Научная новизна
Впервые создана рецептура и отработана пилотная технология получения крема из супернатанта культуральной жидкости лактобацилл.
Исследован спектр биологически активных веществ и других факторов, обуславливающих пробиотический эффект сконструированного метаболитного средства для наружного применения.
Сформирован на базе существующих методов оценки безопасности и эффективности бактериальных препаратов и адаптирован для метаболитного пробиотика в форме крема необходимый комплекс доклинических контрольно-испытательных мероприятий.
Практическая значимость
На созданную рецептуру и пилотную технологию крема из супернатанта культуральной жидкости лактобацилл разработана нормативная документация в виде технических условий и технологической инструкции (ТУ 9197-01-01966727-2012 крем «Вералактин»).
Впервые предложена и апробирована новая область клинического использования пробиотиков в качестве местного дерматологического средства. Полученные результаты по бактерицидной активности метаболитного пробиотика в экспериментах, проведенных in vitro и in vivo, позволяют рассчитывать на эффективность разработанного средства для наружного применения при патологических состояниях кожных покровов, вызванных стафилококком и другими возбудителями инфекционно-воспалительных заболеваний.
Внедрение в практику
Разработанный метаболитный пробиотик на основе супернатанта консорциума штаммов лактобацилл послужил основой для патента РФ на изобретение № 2393214 «Иммунобиологическое противоаллергическое средство (варианты), штамм Lactobacillus acidophilus NKJC, штамм Lactobacillus acidophilus JCH, Lactobacillus acidophilus KAA» и заявки на изобретение № 2012112390 «Способ получения лектинов, обладающих противокандидной активностью».
Нормативно-техническая документация на крем «Вералактин», сертифицированна в установленном порядке и передана для пилотного выпуска и отработки полномасштабного технологического процесса на биотехнологическое производство.
Положение, выносимое на защиту
Поликомпонентный метаболитный пробиотик на основе супернатанта штаммов лактобацилл представляет собой безопасное и эффективное бактерицидное средство для местного применения при гнойно-воспалительных заболеваниях кожных покровов.
Апробация работы
Диссертация апробирована на заседании секции Ученого Совета «Медицинская биотехнология» ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, протокол №6 от 20 декабря 2012 г.
Результаты диссертационной работы были представлены, доложены и обсуждены на российских и международных конференциях: Национальной российской конференции «Прошлое, настоящее и будущее отечественной косметологии, косметики и пластической хирургии», Москва, 20-21 сентября 2006 г.; Международном конгрессе «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты» г. Санкт-Петербург, 15-16 мая 2007 г.; IDF International symposium «Lactose and its Derivatives», Moscow, 14-17 may 2007; Международной научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии в опытах на обезьянах», г. Сочи-Адлер, 19-22 сентября 2007 г.; Межрегиональной научно-практической конференции «Современные представления об иммунокоррекции», г. Пенза, 2-3 октября 2008 г.; Научно-практической конференции, посвященной 50-летию детского инфекционного отделения МОНИКИ, г. Москва, 8 октября 2008 г; Научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», г. Москва, 11-12 ноября 2008 г; Юбилейной научно-практической конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии», г.Ростов-на-Дону, 23-24 сентября 2009 г.; Научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов НИО Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности», п. Оболенск, 31 мая - 2 июня 2011 г.; Международной научной конференции «Достижения и перспективы развития биотехнологии», г. Саранск, 3-5 октября 2012 г; 9-я Северо-Западной научной гастроэнтерологической сессии «Санкт-Петербург – Гастросессия-2012», г. Санкт-Петербург, 22-23 ноября 2012 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 29 печатных работ, в том числе 5 статей – в рецензируемых изданиях, 5 статей – в других изданиях, 16 работ – в материалах конференций, 1 патент на изобретение РФ, 1 методические указания, 1 заявка на изобретение РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 126 страницах основного машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, 4 главы собственных исследований, заключение, выводы, список использованной литературы, который содержит 192 источника (128 отечественных и 64 зарубежных). Работа иллюстрирована 13 рисунками и 17 таблицами.
