Введение к работе
Актуальность темы. Хитозан является продуктом деацетилирования хитина, который относится к числу наиболее распространенных в природе органических соединений. Хитин является структурным полисахаридом экзоскелета ракообразных (крабы, креветки, криль). Хитин имеется также в кутикуле насекомых, клеточных стенках некоторых грибов и бактерий.
Хитозан в настоящее время используется в различных областях народного хозяйства. Особого внимания заслуживает применение его в ветеринарии и медицине. Установлено, что хитозан является слабым аллергеном, обладает достаточно низкой токсичностью и пирогенностью (Скрябин К.Г., Вихорева Г.А., Варламов В.П., 2002; Быкова В.М., Немцев С.В., 2002; Allan G.G., Peyron M., 1989).
Хитозан способен образовывать гели в слабокислых растворах (рН 5-6). Кроме того, он может создавать пленку на коже и раневых поверхностях, а также на слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта, обладает высокой адсорбционной емкостью, способен выводить токсичные вещества, стимулирует клеточный и гуморальный иммунитет (Албулов А.И., Самуйленко А.Я., Шинкарев С.М., Фролова М.А., 2001; Червинец В.М., Бондаренко В.М., Комаров Б.А, 2002; Muzzarelli R.A.A., 1998). Эти свойства хитозана могут быть использованы для создания средств лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний у сельскохозяйственных животных, приносящих большой экономический ущерб.
В процессе выделения хитозан подвергается воздействию химических реагентов (щелочей и кислот) при очень жестких условиях. В результате получают полимеры с широким молекулярно-массовым распределением, трудно поддающимися стандартизации. В зависимости от содержания в составе препарата фракций с различными молекулярными массами хитозан может проявлять в той или иной степени сорбционные, иммуномодулирующие, бактериостатические, фунгистатические, противовоспалительные и другие свойства (Ильин Л.А., Андрианова И.Е., Глушков В.А., 2003; Червинец В.М., Албулов А.И., Червинец Ю.В, 2006). Качества хитозана с неконтролируемой полидисперсностью малопредсказуемы и плохо поддаются стандартизации (Гамзазаде А.И., 1999; Варламов В.П., Ильина А.В., 2003; Szumilewicz J., Meller W.,2002).
В то же время для медицины, ветеринарии, пищевой биотехнологии необходим хитозан с определенными характеристиками и свойствами, которые в значительной степени определяются степенью чистоты продукта, его молекулярной массой, степенью деацетилирования и токсичностью.
Цели и задачи исследований. Целью настоящей работы явились разработка способа фракционирования хитозана и получение образцов с заданными молекулярными массами и узким молекулярно-массовым распределением, а также изучение биологических свойств полученных фракций. В соответствии с этим были поставлены задачи:
-
Разработать способ фракционирования хитозана.
-
Получить и охарактеризовать отдельные фракции хитозана.
-
Определить острую токсичность полученных фракций.
-
Изучить воздействие хитозана на организм молодняка КРС при энтеральном введении.
-
Исследовать адъювантные свойства хитозана на лабораторных животных.
-
Изучить влияние парентерального введения хитозана на иммунобиологическую реактивность молодняка сельскохозяйственных животных.
Научная новизна работы. Определены оптимальные параметры фракционирования и на их основе разработан способ получения фракций хитозана. Показано, что для разделения хитозана на фракции наилучшим образом подходят ультрафильтрационные мембраны на основе ацетата целлюлозы, в то же время при применении полисульфоновых мембран и мембран на основе сополимера акриловой кислоты и винилового спирта разделение хитозана практически не происходит, что связано с особенностями материалов данных мембран. Получены фракции хитозана с низким значением индекса полидисперсности и молекулярной массой пика в заданном диапазоне.
-
Показано, что фракции хитозана с молекулярной массой <5, 5-10, 10-20, 20-50, 50-100, 100-150, 150-300 и более 300 кДа обладают низкой токсичностью, которая повышается с увеличением молекулярной массы.
-
Установлено, что использование хитозана с низким индексом полидисперсности позволяет усиливать его биологическое действие, что выражается в увеличении привесов молодняка КРС, по сравнению с применением полифракционных препаратов.
-
В опытах на мышах показано, что использование фракционированного хитозана в качестве адъюванта обеспечивает выработку антител к бычьему сывороточному альбумину (БСА) на уровне или выше известных масляных и минеральных адъювантов.
-
Показано, что подкожное введение фракционированного хитозана молодняку КРС во время вакцинации против пастереллеза стимулирует антителообразование и положительно влияет на показатели клеточного иммунитета.
Практическая значимость работы.
-
Разработан способ получения фракций хитозана с низким значением индекса полидисперсности и молекулярной массой пика в заданном диапазоне. Наработаны опытные партии низкомолекулярных фракций хитозана для использования в качестве иммуномодуляторов и адъювантов.
-
Показано, что применение хитозана с низким значением индекса полидисперсноти позволяет усилить его биологические свойства, что дает возможность получать больший экономический эффект от применения этого препарата.
-
Показана возможность и перспективность использования хитозана в качестве адъюванта при вакцинации.
-
Выявлен стимулирующий эффект фракционированного хитозана на клеточный и гуморальный иммунитет при подкожном введении молодняку КРС, что дает возможность использовать этот препарат в качестве иммуномодулятора.
Апробация результатов. Основные результаты проведенных исследований были доложены:
на пятой международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарно-биологических препаратов» (Щелково, 2003);
на международной научно-практической конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарно-биологических препаратов» (Щелково, 2004);
на международной конференции «Ветеринарная медицина 2005: современное состояние и проблемы обеспечения благополучия животноводства» (г. Ялта, 2005);
на международной научно-практической конференции «Перспективы и проблемы развития промышленной биотехнологии в рамках единого экономического пространства стран содружества» (Минск - Нарочь, май 2005);
на седьмой международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарно-биологических препаратов» (Щелково, 2005);
на восьмой Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Казань, 2006);
на заседании секции «Ветеринарная биотехнология» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (Щелково, 2008).
Публикации. По теме диссертации и материалам проведенных исследований опубликовано 15 статей в сборниках международных научно-практических конференций и симпозиумов, отечественных специализированных журналах, в том числе 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, методической части, раздела с обсуждением экспериментальных результатов, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и 12 рисунков. Список использованной литературы включает 232 источника, из которых 110 отечественных.
