Введение к работе
1.1 Актуальность темы
Вирусная геморрагическая болезнь кроликов (ВГБК) - остропротекающая высококонтагиозная болезнь, характеризующаяся явлениями геморрагического диатеза во всех органах, в особенности в легких и печени. Заболеваемость при ВГБК может достигать 70-80 %, а летальность - 90-100 % [2].
Возбудителем заболевания является вирус семейства Caliciviridae рода Lagovirus. Геном вируса геморрагической болезни кроликов (ГБК) представлен линейной одноцепочечной инфекционной плюс-РНК [6].
Большой экономический ущерб от ВГБК обусловлен массовой и внезапной гибелью почти всего поголовья невакцинированных животных. В ряде европейских стран и в Австралии вирус ГБК постоянно циркулирует в популяциях диких кроликов, в связи с чем полная ликвидация болезни в настоящее время невозможна.
На территорию нашей страны ВГБК была занесена в 1987 г. Благодаря разработке отечественными исследователями вакцинных препаратов [4] и проведению массовых профилактических мероприятий, к 2000 г. заболевание удалось практически полностью ликвидировать [2]. Однако за последние несколько лет число вспышек болезни в Российской Федерации резко увеличилось. С 2007 по 2012 гг. вспышки ВГБК были отмечены в 30 регионах России.
Поскольку клинические признаки болезни, как правило, отсутствуют, а патологоанатомическая картина зачастую бывает нечеткой, лабораторные методы играют основную роль при постановке диагноза. Необходимость разработки тест-систем на основе метода ПЦР для диагностики ВГБК связана, прежде всего, с ограниченностью применения серологических тестов при различных формах течения болезни. Несмотря на сложную эпизоотическую обстановку и большой экономический ущерб от данного заболевания, в России не разработано средств генодиагностики ВГБК.
Для определения эффективности диагностических тест-систем и вакцинных препаратов, применяемых на территории России, представляется актуальным изучение генетического разнообразия и биологических свойств изолятов вируса ГБК, выделенных в нашей стране. Определение молекулярно-генетических характеристик полевых изолятов вируса ГБК, выделенных при вспышках болезни в Российской Федерации, является необходимым аспектом в изучении молекулярной эпизоотологии и эволюции вируса.
1.2 Степень разработанности проблемы
Для лабораторной диагностики ВГБК зарубежными исследователями предложены системы ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией, «гнездовой» вариант ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ), а также различные серологические тесты [5, 6]. В России разработаны серологические средства лабораторной диагностики ВГБК на основе ИФА, РГА, РДСК [1], однако средств выявления генома возбудителя болезни в нашей стране не было предложено. Отечественными учеными определены биологические свойства изолятов, циркулировавших в нашей стране до 1998 года [2].
В ходе проведенных исследований разработаны «Тест-система для выявления генома вируса геморрагической болезни кроликов методом ОТ-ПЦР» и «Тест-система для выявления генома вируса геморрагической болезни кроликов (ГБК) методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени». Определена возможность использования данных тест-систем для лабораторной диагностики ВГБК. Изучены биологические свойства и молекулярно-генетические характеристики изолятов вируса ГБК, выделенных на территории России с 2003 по 2012 гг.
1.3 Цели и задачи исследований
Цель настоящего исследования - разработка и валидация эффективных средств идентификации вируса геморрагической болезни кроликов на основе ПЦР, а также изучение биологических и молекулярно-генетических свойств изолятов вируса, выделенных на территории Российской Федерации в период с 2003 по 2012 гг.
В соответствии с целью работы поставлены следующие задачи:
1. Разработать тест-систему на основе ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией для выявления генома вируса геморрагической болезни кроликов.
2. Разработать тест-систему на основе ОТ-ПЦР в режиме реального времени для выявления генома вируса геморрагической болезни кроликов.
3. Определить характеристики разработанных тест-систем и возможность их использования для лабораторной диагностики вирусной геморрагической болезни кроликов.
4. Изучить биологические и молекулярно-генетические свойства изолятов вируса геморрагической болезни кроликов, выделенных на территории России с 2003 по 2012 гг.
5. Изучить молекулярно-генетические характеристики производственных штаммов Воронежский-87, Белгородский-03 и Манихино-09 вируса геморрагической болезни кроликов.
1.4 Научная новизна исследований
Впервые в России разработаны средства лабораторной диагностики ВГБК на основе ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ, характеризующиеся высокими показателями чувствительности и специфичности. Научная новизна и приоритетность выполненных исследований подтверждена патентом Российской Федерации на изобретение № 2416648 «Олигонуклеотидные праймеры, способ и тест-система для выявления генома вирусной геморрагической болезни кроликов методом ОТ-ПЦР». Бюл. № 11 от 20.04.2011 г.
Впервые определены нуклеотидные последовательности генов VP60 и VP10 девяти полевых изолятов вируса ГБК, выделенных в различных регионах России в 2003-2012 гг., а также производственных штаммов Воронежский-87, Белгородский-03, Манихино-09.
Изучены биологические свойства девяти изолятов вируса ГБК, выделенных на территории России с 2003 по 2012 гг., проведен молекулярно-генетический анализ их родства и установлена генетическая гетерогенность исследованных изолятов.
1.5 Практическая значимость работы
Разработаны «Тест-система для выявления генома вируса геморрагической болезни кроликов методом ОТ-ПЦР» и «Тест-система для выявления генома вируса геморрагической болезни кроликов (ГБК) методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени» для лабораторной диагностики ВГБК.
Нуклеотидные и соответствующие им аминокислотные последовательности гена VP60 восьми штаммов и изолятов, выделенных на территории России с 2003 по 2012 гг., депонированы в международный банк данных GenBank (JN851735.1, JN851733.1, JN851731.1, JN851729.1, JN851734.1, JN851732.1, JN851730.1, HQ917923.1).
Разработаны:
- «Методические рекомендации по выявлению РНК возбудителя вирусной геморрагической болезни кроликов методом полимеразной цепной реакции», утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН Смирновым А.М. 24.12.2009 г.
- «Методические рекомендации по выявлению РНК вируса геморрагической болезни кроликов методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН Смирновым А.М. 24.11.2010 г.
Получен патент на изобретение № 2416648 «Олигонуклеотидные праймеры, способ и тест-система для выявления генома вирусной геморрагической болезни кроликов методом ОТ-ПЦР». Бюл. № 11 от 20.04.2011 г.
Получено свидетельство о государственной регистрации «Тест-системы для выявления генома вируса геморрагической болезни кроликов методом ОТ-ПЦР» № ПВР-1-5.0/02617 от 30.08.2010 г.
1.6 Соответствие диссертации паспорту научной специальности
В соответствии с формулой специальности 03.01.06 Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) – область науки об использовании живых организмов, культур клеток и биологических процессов в производстве с целью получения полезных продуктов для народного хозяйства, медицины и ветеринарии, целенаправленно улучшающих воздействие на окружающую среду и формирование экологически доброкачественной среды обитания человека и животных. В диссертационной работе проведены исследования по созданию тест-систем на основе ПЦР и ее модификаций, позволяющие проводить лабораторную диагностику ВГБК. Для данных тест-систем разработаны рекомбинантные конструкции, используемые в качестве положительного и внутреннего контрольных образцов. При создании данных конструкций использованы методы молекулярного клонирования ДНК в прокариотический вектор и in vitro транскрипция РНК.
Проведено нуклеотидное секвенирование генов VP60 и VP10 трех штаммов ВГБК, депонированных в музее микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, и девяти изолятов, выделенных на территории России с 2003 по 2012 гг. На основании нуклеотидной последовательности генов VP60 и VP10 исследованы молекулярно-генетические характеристики данных штаммов и изолятов.
Результаты научного исследования соответствуют пунктам паспорта специальности – 1, 9, 11.
1.7 Апробация результатов работы
Результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (г. Щелково, 2009 г.), конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины» (г. Покров, 2009 г.), Международной научно-практической конференции «Задачи ветеринарной науки в реализации доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации» (г. Покров, 2011 г.), Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы клеточного пушного звероводства и кролиководства России» (пос. Родники, Московская область, 2012 г.), конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии в ветеринарной медицине» (г. Покров, 2012 г.), а также на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИВВиМ Россельхозакадемии в период с 2009 по 2012 гг.
1.8 Публикации научных исследований
По теме диссертационной работы опубликовано 10 научных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации, и получен один патент на изобретение.
1.9 Основные положения, выносимые на защиту
1. «Тест-система для выявления генома вируса геморрагической болезни кроликов методом ОТ-ПЦР», характеризующаяся высокой чувствительностью и специфичностью.
2. «Тест-система для выявления генома вируса геморрагической болезни кроликов (ГБК) методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени», характеризующаяся высокой чувствительностью и специфичностью.
3. Результаты изучения генетической гетерогенности девяти изолятов вируса ГБК, выделенных с 2003 по 2012 гг. на территории России, и производственных штаммов Воронежский-87, Белгородский-03, Манихино-09.
4. Результаты изучения биологических и молекулярно-генетических свойств девяти изолятов вируса ГБК, выделенных на территории России с 2003 по 2012 гг.
1.10 Структура и объем диссертации
