Содержание к диссертации
Введение 6
Глава 1. Обзор литературы 12
Источники лакказы в природе 13
Базидиальные грибы как источники ферментов 18
Лигнолитический ферментативный комплекс грибов белой 21 гнили
Особенности роста в глубинной культуре и синтеза оксидаз 24 грибами рода Trametes
Влияние различных факторов на оксидазную активность 28
1.6. Области применения лакказы 34
Глава 2. Объекты и методы исследований 41
Глава 3. Выбор штамма-продуцента лаккказы 49
Определение фенолоксидазной активности штаммов на ага-ризованных средах по методу Бавендамма 49
Сравнение продуктивности штаммов-продуцентов в глубинной культуре в колбах на качалке 54
Сравнение отобранных штаммов в условиях глубинного культивирования в ферментационном аппарате. Выбор промышленного штамма-продуцента 65
Глава 4. Подбор компонентов полусинтетической питательной среды
для получения высокой оксидазной активности Т. hirsuta 56 71
Изучение влияния количества сульфата меди на оксидазную активность 71
Изучение влияния источников углерода на оксидазную активность 72
Изучение влияния источников азота на оксидазную актив ность на средах с сахарозой 76
4.4. Изучение влияния источников фосфора на оксидазную ак
тивность на средах с сахарозой 78
Глава 5. Подбор компонентов и оптимизация состава комплексной пи
тательной среды для получения высокой оксидазной активности Т. Ыг- 83
suta 56
Изучение влияния основного сырья на оксидазную активность 83
Изучение влияния источников азота на оксидазную активность на средах с мукой 86
Изучение влияния источников фосфора на оксидазную активность на средах с мукой 88
Изучение влияния ростовых факторов на оксидазную активность на средах с мукой 90
Оптимизация состава промышленной питательной среды 93
Изучение влияния количества сульфата меди на оксидазную активность на средах с мукой 99
Изучение влияния индукторов на оксидазную активность на 101 средах с мукой
Глава 6. Изучение влияния условий культивирования на оксидазную активность Т. hirsuta 56 и оптимизация режимных параметров процесса 104 ферментации
Влияние рН на оксидазную активность Т. hirsuta 104
Влияние температуры на оксидазную активность Т. hirsuta
Влияние интенсивности перемешивания на оксидазную активность Т. hirsuta 56 120
Влияние аэрации на оксидазную активность Т. hirsuta 56 127
Сравнение оксидазной активности Т. hirsuta 56 на исходной среде и средах после оптимизации состава и условий культивирования 130
6.6. Изучение оксидазной активности T.hirsuta 56 при проведе
нии многоциклических процессов 132
Глава 7. Разработка технологии производства лакказы, проведение
опытно-промышленных испытаний и характеристика получаемого фер
мента 134
7.1. Определение критериев масштабирования, разработка про
мышленной технологии и опытно-промышленного регла
мента на производство ферментного препарата лакказы 134
7.2. Опытно-промышленные испытания технологического про-
цесса 136
Биохимические характеристики препарата лакказы 13 8
Технико-экономическая оценка 138 ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ 143 Список литературы 145
Приложение 1. Опытно-промышленный регламент на производство ферментного препарата технической лакказы ОПР 02068798-01-06 Приложение 2. Акт проведения испытаний на производственной базе ООО «Фирма «Макофарм»
Приложение 3. Акты наработки опытных образцов фермента Приложение 4. Акт наработки опытно-промышленной партии ферментного препарата технической лакказы
Приложение 5. Акты проведения испытаний культуральной среды ферментного препарата лакказы в качестве сырья для получения чистого препарата лакказы для тонкого органического синтеза Приложение 6. Акты проведения испытаний ферментного препарата лакказы в качестве биосвязующего в производстве древесноволокнистых плит Приложение 7. Диплом НТТМ
Приложение 8. Диплом за участие в конкурсе научно-исследовательских работ аспирантов в рамках комплексного проекта ЖС-КП 4/002
Введение к работе
Производство ферментных препаратов является одним из ведущих направлений в развитии биотехнологии во всем мире. Ферментные препараты находят широкое применение в самых различных отраслях пищевой и легкой промышленностях, в косметологии, в производстве синтетических моющих средств, в медицине, в аналитических исследованиях, сельском хозяйстве, охране окружающей среды и ряде других областей. В связи с этим возникает задача получения значительных количеств ферментных препаратов с использованием достаточно простых технологических операций.
Лакказа (и-дифенол:кислород оксидоредуктаза, КФ 1.10.3.2) относится к классу оксидаз, восстанавливающих молекулярный кислород непосредственно до воды без образования в качестве промежуточного продукта перекиси водорода или каких либо других кислородных интермедиатов. Голубые лак-казы из базидиальных грибов являются высокопотенциальными ферментами и обладают широкой субстратной специфичностью по отношению к различным органическим и неорганическим соединениям, что делает возможным их использование совместно с медиаторами, являющимися одновременно их первичными субстратами. Применение лакказы перспективно во многих областях промышленности: целлюлозо-бумажной (делигнификации бумажной пульпы); текстильной (экологически чистое отбеливание тканей); тонком органическом синтезе (например, синтез электропроводящих полимеров); пищевой (удаление следов кислорода в продуктах питания для увеличения срока хранения); косметической (краска для волос, отбеливающая зубная паста); производстве современных экологически чистых древесно-волокнистых плит (в качестве биосвязующего агента); производстве моющих средств (отбеливающий агент); для биодеградация ксенобиотиков, в том числе отравляющих веществ; энергетике (кислородный электрод биотопливного элемента); синтезе лекарственных препаратов (например, антибиотиков); в биосенсорах (например, анализ фенольных соединений, включая лигнины, в сточных водах промышленных предприятий, определение антиоксидантного статуса
вин); иммуноферментном анализе (в качестве фермента-маркера). В связи с этим работа по созданию технологии производства лакказы является актуальной.
Особый интерес представляют фенолоксидазы, синтезируемые экологической группой дереворазрушающих грибов, вызывающих белую гниль древесины, относящихся к классу Basidiomycetes. Наибольшее значение из них имеют грибы рода Trametes (Coriolus) (сем. Polyporaceae).
В связи с этим разработка технологии производства лакказы является актуальной задачей биотехнологии. Разработка стадии культивирования является важнейшей частью биотехнологического процесса. Однако наиболее важные этапы, такие как изучение оксидазной активности различных штаммов - потенциальных продуцентов лакказы и выбор штамма-продуцента, выбор и оптимизация компонентов питательной среды, изучение влияния технологических параметров на синтез целевого продукта и выбор оптимальных режимов культивирования в настоящее время недостаточно изучены.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы была разработка технологии биосинтеза фермента лакказы грибами рода Trametes.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Провести скрининг коллекционных штаммов грибов рода Trametes в глубинной культуре и на агаризованных средах и выбрать наиболее перспективный в качестве продуцента лакказы штамм;
Изучить влияние компонентов полусинтетической питательной среды на оксидазную активность (ОА);.
Сравнить ОА штамма на комплексных средах из числа возобновляемого сельскохозяйственного сырья и подобрать дополнительные компоненты питательной среды. Изучить влияние индукторов на ОА штамма-продуцента;
Оптимизировать по О А в качестве критерия оптимизации состав питательной среды с применением математических методов планирования эксперимента;
В условиях культивирования в ферментационном аппарате изучить влия-
ниє на синтез оксидаз рН, температуры, перемешивания и аэрации и определить оптимальные режимы культивирования;
6. На основании полученных результатов разработать технологический процесс стадии культивирования процесса производства лакказы. Научная новизна работы
На агаризованой среде и в условиях глубинного культивирования впервые проведен скрининг 20 штаммов грибов рода Trametes - потенциальных продуцентов высокопотенциальных лакказ, относящихся к 4 видам: T.versicolor, T.pubescens, T.ochracea, T.hirsuta. Показано, что штаммовая вариабельность ОА в рамках одного вида рода Trametes превышает видовые различия по этому показателю. Диапазон ОА составил 0,00 - 0,90 Еоа. Показано, что результаты первичного отбора штаммов, проведенного на основании реакции Бавендамма, зависят от состава питательной среды и субстрата фермента и не совпадают с результатами, полученными в глубинной культуре.
Показано, что наиболее эффективными для синтеза оксидаз являются сахароза, глюкоза, фруктоза и мальтоза. Продуктивность по ОА существенно повышается в присутствии кукурузного экстракта и дрожжевого ав-толизата. Источники азота и фосфора в меньшей степени влияют на ОА. Установлено, что содержание 0,03 мМ Си2+ в пересчете на CuS04 в среде достаточно для максимального синтеза лакказы штаммом. Определено сельскохозяйственное возобновляемое сырье, обеспечивающее высокую ОА (пшеничная мука).
Определен режим рН-статирования (4,0) для достижения максимальной активности и продуктивности по оксидазам. Показано, что оптимальная температура для достижения высокой ОА (32 С) не соответствует наиболее благоприятной для роста и накопления биомассы (28-30 С). Подобран режим перемешивания и аэрации, обеспечивающий достаточную массопередачу кислорода при отсутствии травмирования мицелия и определен соответствующий объемный коэффициент массопередачи кислорода.
Установлена критическая линейная скорость мешалки (3,0-3,2 м-с ), при превышении которой происходит механическое воздействие на мицелий гриба, приводящее к снижению ОА.
Показано, что основным ферментом, продуцируемым штаммом T.hirsuta 56 на разработанной среде является высокопотенциальная (780±20 мВ) лакказа.
Практическая ценность работы
На основании проведенных исследований выбран штамм Т. hirsuta 56 для промышленного использования в качестве продуцента лакказы. Проведено более 70 ферментации в аппарате объемом 30 л. О А штамма-продуцента за счет оптимизации среды и условий культивирования повышена более, чем в 40 раз. Разработана технология глубинного культивирования штамма-продуцента с получением высокоактивной культуральной жидкости, на основании которой создан проект опытно-промышленного регламента на производство технического препарата лакказы. Проведены технологические испытания на производственной базе ООО «Фирма «Макофарм»» (п. Лотоши-но), показавшие практическую реализуемость и эффективность разработанной технологии. Проведены испытания наработанных образцов и опытной партии технического ферментного препарата в качестве биосвязующего в производстве древесно-волокнистых плит (ЗАО ВНИИДРЕВ) и в тонком органическом синтезе (Институте биохимии им А.Н. Баха РАН), которые подтвердили соответствие полученных препаратов необходимым для производства требованиям. Предварительная технико-экономическая оценка с учетом стадии концентрирования показала, что при годовом объеме производства культуральной среды 4400 м , что составляет потребность одного предприятия при переводе всего производства древесно-волокнистых плит на использование биосвязующих, себестоимость получаемой продукции будет составлять 1339,2 рубля за 1 кг или 13,39 рубля за 1000 ME.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывались на 1-м (14-18 октября 2002 г.) и 2-м (10-14 ноября 2003 г.) Междуна-
родных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва; VI (20-24 мая 2002 г.) и VII (14-18 апреля 2003 г.) Междунар. симпозиумах «Техника и технология экологически чистых производств», Москва; 7-ой (14-18 апреля 2003 г.) и 8-ой (17-21 мая 2004 г.) Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биотехнология - наука XXI века», Пущино; V междунар. конфер. «Инженерная защита окружающей среды», Москва, 14 - 15 апреля 2003 г.; 2 Междунар. конфер. «Наука-Бизнес-Образование», 10-13 мая 2005, Пущино.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ и подано 3 заявки на патенты РФ.
Структура и объем работы. Диссертационная работа включает: введение, обзор данных литературы, описание объектов, материалов и методов исследования, 5 глав, в которых изложены результаты экспериментов и их обсуждение, выводы, список цитируемой литературы, содержащий 198 наименований и 8 приложений. Материал изложен на 144 страницах, содержит 73 рисунка и 13 таблиц.
Экспериментальная часть работы и обработка результатов выполнены автором самостоятельно. Выделение чистых лакказ и определение их биохимических характеристик проведены совместно с проф., д.х.н. А.И. Ярополо-вым, к.х.н. СВ. Шлеевым и к.х.н. О.В. Морозовой. В обсуждении результатов принимали участие к.б.н. Е.С. Горшина, д.т.н., проф. В.В. Бирюков. Вклад соискателя в работу является определяющим.
Работа выполнена в рамках государственного контракта с Минпромнауки РФ №43.073.1.1.2505 «Биокаталитические технологии для химического синтеза, аналитических систем и медицины» от 31.01.2002), а также в рамках государственного контракта с Минпромнауки РФ № 02.467.11.3004 от 30 марта 2005 «ЖС-КП.4/002. Разработка и подготовка промышленного освоения технических ферментных препаратов для целлюлозно-бумажной и текстильной промышленности, биосвязующих и биологически совместимых
пластиков, отвечающих современному мировому уровню развития биотехнологии и промышленной микробиологии»
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ Глава 1. Обзор литературы
Производство ферментных препаратов является одним из ведущих направлений в развитии биотехнологии во всем мире. Ферментные препараты находят широкое применение в самых различных отраслях пищевой и легкой промышленностей, в косметологии, в производстве синтетических моющих средств, в медицине, в аналитических исследованиях, сельском хозяйстве, охране окружающей среды и ряде других областей. В связи с этим возникает задача получения значительных количеств ферментных препаратов с использованием достаточно простых технологических операций.
Лакказа - медьсодержащий фермент класса оксидредуктаз (КФ 1.10.3.2 п-дифенол: кислород оксидоредуктаза), катализирующий окисление широкого круга органических и неорганических субстратов молекулярным кислородом с сопутствующим восстановлением последнего непосредственно до воды, минуя стадию образования пероксида водорода. Лакказа обладает широкой субстратной специфичностью по отношению к различным органическим и неорганическим соединениям, являющимися донорами электронов в ферментативной реакции.
В традиционном понимании, лакказы представяют собой многоядерные медь-содержащие оксидазы и имеют характерную полосу поглощения, близкую к 610 нм, поэтому в литературе их относят к «голубым оксидазам». Другими представителями группы голубых оксидаз являются аскорбатоксидаза, встречающаяся в тканях растений, и церулоплазмин в плазме крови животных [Baldrian, 2006]. Типичные лакказы содержат медь трех типов, один из которых придает им характерный голубой цвет.
В природе функцию этого фермента связывают с деградацией лигнина. Утрата этого фермента микробной культурой приводит к полной потере ее способности окислять фенольные подструктуры лигнина. В присутствии
соответствующих редокс-медиаторов лакказа может окислить нефенольные субстраты, что значительно расширяет субстратную специфичность этого фермента. Каталитические и электрокаталитические свойства лакказы дают возможность ее широкого использования в различных сферах.
Приблизительно до середины 80-х изучение лакказ проводили в фундаментальных аспектах (биохимические характеристики, механизм внутримолекулярного переноса электронов внутри молекулы фермента, субстратная специфичность и др.). Однако в начале 90-х годов были открыты медиаторы (усилители) лакказной реакции, что дало толчок в области прикладных исследований использования этих ферментов. Медиаторы являются первичными субстратами лакказы и могут в дальнейших реакциях окислять другие соединения. Таким образом, использование медиаторов позволяет расширить спектр субстратов лакказ.
В связи с активным расширением практического применения фермента лакказы в различных областях деятельности человека возникает острая необходимость его получения в промышленных масштабах. По имеющимся данным разработкой промышленного производства лакказы на основе генноинженерного штамма занималась фирма NOVO NORDISK. В настоящее время лакказа вместе с медиаторами выпускается фирмой Novozymes в виде комплексного препарата DeniLite I и II, предназначенных для обесцвечивания джинсовой ткани. Технология производства неизвестна.
1.1. Источники лакказы в природе
Лакказа была открыта и изучена еще в конце 19-го века. В 1883 году Hikorokuro Yoschida описал этот фермент в соке лакового дерева {Rhus vermiciferd), употребляемом в Японии для лакирования различных изделий. Через несколько лет, в 1886 году, Bertrand обнаружил лаккказу в грибах. Однако широкое изучение лакказ началось только в связи с рассмотрением их роли в
деградации древесины дереворазрушающими грибами белой гнили [Baldrian, 2006].
Растительные лакказы принимают участие в свободно-радикальном
механизме образования полимера лигнина, тогда как грибные лакказы играют
большую роль в морфогенезе, процессах взаимоействия между грибом-
патогеном и хозяином, защите от стресса и биодеградации лигнина [Baldrian,
2006]. Есть данные о присутствии лакказ в бактериях, однако некоторые
авторы ставят под сомнение возможность существования лакказ у прокариот
[Baldrian, 2006]. Одгнако лакказо-подобные белки, являющиеся
представителями многоядерных медных белков, были описаны для разных видов бактерий (грамм-положительных и грамм-отрицательных) [Claus, 2003].
Фенолоксидазная активность обнаружена у лихенизированных амкомицетов, принадлежащих к разным группам: эпигейные и эпифитные лишайники Peltigerales (лакказа и тирозиназа), Lecanorales (только лаккказа) [Заварзина, Заварзин, 2006].
Наиболее широко распространена лакказа среди грибов. Однако среди низших грибов {Zygomycetes и Chytridiomycetes) лакказы пока не обнаружены.
Известно, что лакказу или лакказо-подобные ферменты продуцируют фитопатогенные аскомицеты, такие роды как Ophiostoma, Melanocarpus, Neurospora, Podospora, Monocillium, Gaeumannomyces и др. и почвенные аскомицеты - Aspergillus, Curvularia, Penicilium; дереворазрушающие аскомицетов - Trichoderma, Bothryosphaeria, Xylaria [Baldrian, 2006]; эндофитного гриба Monotospora sp. [Wang et al., 2005]; Cyathus bulleri [Salony et al., 2006].
Лакказы были обнаружены среди базидиомицетных дрожжей, однако в аскомицетных дрожжах они отсутствуют [Baldrian, 2006].
Лакказы обнаружены у штаммов гифомицета Chalara paradoxa, выделенных из отстойников сточных вод оливковых маслобоен [Robles et al., 2000].
Для дейтеромицетов Pestalotiopsis sp. и Fusarium proliferatum показана высокая активность лакказы [Anderson et al., 2005; Нао et al., 2006].
Широко изучается как продуцент лакказы гриб, вызывающий белую гниль Phanerochaete sordida YK-624 и Phanerochaete chrysosporium [Gao et al., 2005; Tamagawa et al., 2005; Tamagawa et al., 2006].
Лакказа - фермент, широко распространенный среди дереворазрушающих грибов. Присутствие этого фермента обнаружено у многих десятков видов базидиомицетов [Белова и др., 2007]. Среди физиологических групп грибов лакказа является типичной для дереворазрушающих базидиомицетов, разрушающих лигнин, так называемых грибов белой гнили, хотя иденттфицирована она и в грибах бурой гнили {Coniophora puteana, Laetiporus sulphureus). Фрагменты гена лакказы обнаружены в таких грибах как Amanita, Cortinarius, Hebeloma, Lactarius, Paxillus, Piloderma, Russula, Xerocomus Tylospora [Baldrian, 2006].
Лакказа обнаружена в микоризных и сапротрофных грибах, таких как Agaricus [Kaluskar et al., 1999], Armillariella mellea [Xiao et al., 2002], Cerrena тахта, Cerrena unicolor, Chaetomium, Coprinus, Coriolopsis, Coriolus, hirsutus, Coriolus maxima, Coriolus zonatus, Daedalea quecina, Fomes fomentarius, Ganjderma lucidum, Lentinula edodes, Marasmius, Pycnoporus cinnabarinus, Schizophyllum commune, Trametes galica, T. multicolor, T.ochracea, T.pubescens, T.sanguinea, T, versicolor, T.villosa, Marasmius, Tricholoma, Volvariela, Cantarellus cibarius, Lactarius piperatus, Russula delica [Baldrian, 2006].
Скрининг культур из Коллекции Ботанического института им. Комарова РАН - ЛЕ(БИН) позволил обнаружить лакказную активноость у 230 штаммов, 35 наиболее активных из которых относились к семействам Strophariaceae и
Tricholomataceae (Agaricales), Crepidotaceae (Cortinariales), Lentinellaceae (Hericiales), Coriolaceae, Lentinaceae, Polyporaceae (Poriales) и Steccherinaceae (Stereales) [Белова и др., 2007]. Авторы отмечают высокую лакказную активность (оксидазную активность по сирингалдазину) для Lenzites betulina, Oudemansiella mucida, Polyporus squamosus.
Многие авторы изучали возможность использовать биологические объекты для получения лакказы с целью последующего выделения или использования в составе культуральной жидкости. В качестве продуцента лакказы наиболее часто предлагают использовать такие виды как Panus tigrinus 8/18 [Черных и др., 2005], Panus tigrinus CBS 577 [Fenice et al, 2003], Coriolopsis gallica [Carbajo et al., 2002], Coriolopsis polyzona [Cabana et al., 2006], Pleurotus ostreatus [Rodrigues etn al., 2003], Pleurotus pulmonarius [De Soura et al., 2002; de Souza et al., 2004], Phlebia floridensis [Arora, Rampal, 2002], Steccherinum ochraceum, Polyporus squamosus, [Белова и др., 2007], Cerrena maxima [Королева и др., 2001], Funalia trogii [Kahraman, Yesilada, 2001] и другие.
Хорошим продуцентом лакказы является дикариотический штамм Pycnoporus cinnabarinus 1-937 (Alves et al., 2004), от которого получен монокариотический штамм Pycnoporus cinnabarinus ss3, обладающий по мнению авторов способностью к сверх высокой продукции лакказы [Lomascolo et al., 2003; Heproel et al,m 2000; Otterbein et al., 2000].
Наиболее высокая продукция лаккказы отмечают у генетически модифицированных штаммов, например, у Aspergillus niger, Aspergillus oryzae и Yarrowia lipolytica с геном лаказы Pycnoporus cinnabarinus [Record et al., 2002; Sigoillot et al., 2004; Madzak et al, 2005].
Наиболее часто в качестве продуцентов лакказы разные авторы предлагают использовать грибы рода Trametes: Trametes gallica [Dong et al., 2005], Trametes gibbosa (авторы выбирают в числе трех наиболее активных штаммов из 230
испытанных) [Белова и др., 2007], Trametes versicolor [Pedroza et al., 2007; Ryan et al., 2007], Trametes versicolor ATCC 20869 [Thiruchelvam et al., 2007], Trametes versicolor (CBS 100.29) [Lorenzo et al., 2002 ], Coriolus versicolor [Kahraman, Yesilada, 2001], субтропические штаммы грибов рода Trametes из Зимбабве: Tcingulata, Т. elegans and Т. pocas [Tekere et al., 2001], Trametes modesta [Nyanhongo et al, 2002], Trametes trogii [Trupkin et al., 2003].
Как выдающиеся продуценты лаккказы авторы описывают Trametes multicolor MB 49 [Hess et al, 2002], Trametes hirsuta 072 [Ребриков и др., 2006] , Trametespubescens MB 89 [Galhaup et al.,2001].
Для грибов рода Trametes (Т.versicolor) показано, что продукция экстрацеллюлярнои лакказы составляет у них 95-98 % от общего количества лакказ (внутри- и внеклеточных) [Schlosser et al., 1997 цит. по Baldrian, 2006].
Известные способы получения лакказы
Известны способы получения очищенных препаратов лакказы [патент США № 5403723, 1995], и в составе других ферментных препаратов [патент РФ№ 2021371, 1994; патент РФ№ 92016316, 1996]. Однако они сложны, многоэтапны, так как включают в себя комбинацию разных методов очистки: высаливание, многоступенчатая хроматография на различных носителях и требуют для своего исполнения сложного и дорогостоящего аппаратурного и реактивного обеспечения.
Так же известен способ получения лакказы из растений [Патент РФ№ 103031,1998]. Однако известно, что окислително-восстановительный потенциал растительных лакказ ниже, чем у грибных, что не позволяет эффективно использовать их в промышленности.
Наиболее близким к предложенному способу является способ получения лакказы, изложенный в патенте РФ № 2021371 [патент РФ № 2021371, 1994]. В этом способе предусматривается культивирование штамма гриба белой гнили
Partus tigrinus 8/18 на синтетической среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора, минеральные соли и микроэлементы, при этом в качестве источника углерода - мальтозу, в среду дополнительно вносят твин-80 и марганец сернокислый в количестве 60-90мг/л, а в процессе культивирования осуществляют температурный сдвиг. Максимальное содержание лигнолитических ферментов достигается к 10-12сут культивирования и составляет 8-12ед/мл. Ферменты выделяют из фильтрата культуральной жидкости путем концентрирования ультрафильтрацией или высаливанием. Однако этот способ имеет низкую продуктивность по выходу фермента.
Среди штаммов, предлагаемых в качестве продуцентов лакказы наиболее интересен штамм базидиального гриба Coriolus hirsutus (Wulf ex Fr.) Quel -продуцента лакказы [патент РФ № 2126448, 1995]. Штамм имеет высокую каталитическую активность лакказы (550 К^с"1 по пирокатехину и 320 К^с"1 по гидрохинону), но его продуктивность не достаточна.
Таким образом, ни один известный способ получения лакказы, в том числе, в составе лигнолитического комплекса грибов, не дает возможности его промышленного применения для получения ферментного препарата лакказы.
1.2. Базидиальные грибы как источники ферментов
С развитием биотехнологии базидиомицеты становятся доступным источником ферментов различных классов.
Способность базидиомицетов синтезировать внеклеточные ферменты, характеризующиеся высокой активностью и стабильностью, дает возможность использовать их ферментные комплексы для практических целей [Королева и др., 2002].
В настоящее время во всем мире ведется интенсивная разработка технологий на основе базидиальных лигнинолитических грибов и их ферментов как для обработки лигниноцеллюлозных материалов, так и для утилизации
лигнинсодержащих отходов, накапливающихся в природе в огромных количествах.
Дереворазрушающие базидиомицеты отличаются высоким содержанием окислительно-восстановительных ферментов, в первую очередь пероксидазы, Мп-пероксидазы, тирозиназы и лакказы. Высшие базидиомицеты по составу лигнолитических ферментов объединяют в следующие группы [Hatakka,1994 цит. по Решетниковой, 1997]: в первую группу вошли грибы, обладающие лакказой, лигнин- и марганецпераксидазой Phellinus ріпі, Trametes hirsuta, Bjerkandera adusta, Phanerochaete chrysosporium.
Вторая группа представлена грибами Lentinula edodes, Partus tigrinus, P. chrysosporium, Dichomitus squalens, обладающих Mn-пероксидазной и лакказной активностью.
Третья группа характеризуется лигнинпероксидазной и лакказной активностью - грибы Trametes versicolor, Phlebia radiate, Pleurotus ostreatus.
Грибы, составляющие четвертую группу определены как Pleurotus ostreatus, P. eringii, В. adusta и для них характерна лакказа, арилалкогольоксидаза и другие ароматические оксидазы.
Разнообразное сочетание ферментативных комплексов у лигнинразрушающих грибов связано в первую очередь с экологическими особенностями грибов, трофической специализацией и является следствием длительной эволюции растений и грибов [Решетникова, 1997].
Представители различных таксономических и экологических групп обладают сходным составом ферментов. Однако уровень активности внеклеточных ферментов имеет существенную штаммовую и видовую вариабельность. По оксидоредуктазам отмечена вариабельность как среди штаммов одного вида, так и среди видов каждой группы [Решетникова, 1997].
Ниже приведены использованные нами штаммы с наиболее часто употребляемыми синонимами и дана их экологическая характеристика.
T.hirsuta (Wulfen) Pilat (CABI) Syn.: Trametes hirsuta (Wilfen.: Fr.) Pilat [Бондарцева, 1998], С. hirsutus (Wulf. ex Fr.) Quel. [Бондарцев, 1953], Polyporus hirsutus Wulf. ex Fr., Boletus hirsutus Wulf., Polystictus hirsutus Fr., Hansenia hirsuta Karst, Coriolus nigromarginatus (Schw.) Murr., Trametes hirsuta Pil. Сапрофит на лиственных породах, чаще сапрофит на осине, тополе, ольхе, вишне. Вызывает белую гниль. Свежие плодовые тела иногда имеют анисовый запах. Способен расти в течение всего года. Образует многочисленные формы.
T.ochracea (Pers.)Gilb. & Ryvarden (CABI) Syn.: T.ochracea (Pers.)Gilb. et Ryvarden [Бондарцева, 1998], С. zonatus (Nees) ex Quel. [Бондарцев, 1953], Boletus zonatus Nees, Polyporus zonatus Nees ex Fr., Polystictus zonatus Fr., Hansenia Zonata Karst., Polyporus versicolor Fr. var. zonatus (Fr.) Jrst, Trametes zonata Pil., Polyporus hirsutus Rostk., Coriolus Lloydii Murr. Сапрофит на лиственных, как исключение на хвойных породах. Вызывает белую гниль. Растет во вторую половину вегетационого периода до морозов. Образует множество форм.
T.pubescens (Schumach.) Pilat (CABI) Syn.: T.pubescens (Schumach.:Fr.) Pilat [Бондарцева, 1998], C.pubescens (Schum. ex Fr.)Quel. [Бондарцев, 1953], Polyporus pubescens Schum. ex Fr., Boletus pubescens Schum., Leptoporus pubescens Pat., Hansenia pubescens Karst., Trametes pubescens Pil., Polyporus vetulinus Fr., Coriolus vetulinus Quel., Polystictus vetulinus Cke, Hansenia vetulina Karst. Сапрофит на лиственных породах. Вызывает белую гниль. Растет во вторую половину вегетационного периода.
Т.versicolor (L.) Lloyd (CABI) Syn.: Т.versicolor (L.:Fr.) Pilat [Бондарцева, 1998], C.versicolor (L.et Fr.) Quel. [Бондарцев, 1953], Polyporus versicolor L.ex Fr., Boletus versicolor L., Polystictus versicolor Fr., Hansenia versicolor Karst., Trametes
versicolor Pil., Polyporus sterioides Rostk., Polyporus radiatus Rostk., Polyporus apophysatus Rostk., Polyporus zonatus Rostk., Polyporus nigricans Lasch. Сапрофит на лиственных породах и, как исключение, на ели, вызывает белую гниль. Растет с середины лета до заморозков.
В обзоре литературы виды приведены в авторской синонимике.
1.3. Лигнолитический ферментативный комплекс грибов белой гнили
Внеклеточные лигнинолитические ферментные комплексы грибов белой
гнили включают следующие типы окислительно-восстановительных ферментов:
I. гем-содержащие ферменты, П. флавинсодержащие ферменты, III.
целлобиозодегидрогеназа, IV. медьсодержащие ферменты.
Помимо лигнинразрушающих ферментов эти грибы образуют также системы гидролаз, гемицеллюлозы и целлюлозу.
I. Гем-содержащие ферменты, среди которых принято особо выделять лигнинпероксидазы (LiP) и марганецпероксидазы (МпР). Основная функция этих ферментов - прямое, как у LiP или опосредованное медиатором (вератролом у LiP и ионами Мп у МпР) одноэлектронное окисление ароматических субстратов до соответствующих радикалов и двухэлектронное восстановление перекиси водорода до воды [Болобова и др., 2002].
Лигнинпероксидаза - гемсодержащий фермент с молекулярной массой 39-42 кДа, являющийся донором Н202, и катализирующий одноэлектронное окисление различных соединений (предпочтительно нефенольных) за счет кислорода перекиси водорода, с восстановлением ее до воды.
Лигнинпероксидаза обнаружена лишь у немногих базидиальных грибов: Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor, Trametes hirsuta, Panus tigrinus, Coriolopsis occidentalis (Решетникова, 1997).
Мп-зависимая пероксидаза - гемсодержащий фермент, окисляющий
фенольные соединения в присутствии перекиси водорода. Проявляет активность в среде, содержащей Мп, имеет молекулярную массу 46 кДа [Решетникова, 1997].
Мп-зависимая пероксидаза окисляет лигнин путем присоединения к нему не гидроксил-радикалов, а ионов Мп3+, которые при этом восстанавливаются до Мп . Регенерация Мп осуществляется сопряженной реакцией разложения перекиси водорода. При отсутствии в среде Н2О2 Мп-зависимая пероксидаза способна продуцировать пероксид водорода. Мп-зависимая пероксидаза отмечена у таких грибов как Trametes versicolor, Phlebia radiate, Dischomitus squalens и др. [Решетникова, 1997].
П. Флавинсодержащие ферменты, осуществляющие, в основном двух-электронное восстановление молекулы кислорода до перекиси водорода и одновременно двухэлектронное окисление ОН-группы, соответствующих субстратов, до карбонильных групп. Среди них - глюкозооксидазы, пиранозо-2-оксидазы, метанол-оксидазы, арилалкогольоксидазы.
Глюкозооксидаза - флавинсодержащая оксидаза с молекулярной массой 80 кДа, катализирующая окисление глюкозы, восстанавливая при этом кислород до перекиси водорода. Глюкозооксидаза выявлена у грибов Partus tigrinus, P. Chrysosporium [Решетникова, 1997].
Оксидаза ароматических спиртов, катализирует окисление низших первичных и ароматических спиртов до соответствующих альдегидов и пероксида водорода [Решетникова, 1997].
Арилалкогольоксидаза (вератрил-алкоголь оксидаза), внеклеточная флавин-оксидаза с молекулярной массой 72,5-78кДа, катализирует окисление ароматических спиртов до альдегидов, восстанавливая кислород до перекиси водорода. Арилалкогольоксидаза отмечена у грибов, вызывающих белую гниль древесины: Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor [Решетникова,
1997].
Метанолоксидаза (МеО), внеклеточный флавин-содержащий фермент с молекулярной массой 75кДа, катализирует окисление метанола до формальдегида, восстанавливая кислород до перекиси водорода. Выделена и охарактеризована у Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor, Partus tigrinus [Леонтьевский, 2002].
III. Целлобиозодегидрогеназа, флавин- и гем-содержащая внеклеточная
оксидоредуктаза грибов с молекулярной массой 90-97кДа, катализирует
окисление целлобиозы до целлобионо-лактона, восстанавливая различные
элктронно-донорные субстраты (Ог до Н2Ог, Fe до Fe , Мп до Мп , хиноны
до фенолов и др.)
Целлобиозодегидрогеназа (ЦЦ) была выделена у Partus tigrinus, P. chrysosporium и других грибов белой гиили, а также у грибов бурой и мягкой гнили древесины [Леонтьевский, 2002].
IV. Медьсодержащие ферменты. Катехолоксидаза и лакказа —
медьсодержащие ферменты, катализирующие включение кислорода в молекулу
субстрата [Болобова и др., 2002].
Катехолоксидаза участвует в гидроксилировании монофенолов до дифенолов и окислении дифенолов в ортохиноны. Она широко распространена среди микроорганизмов и имеет названия, соответствующие катализируемому субстрату: монофенолоксидаза, полифенолоксидаза, фенолаза, крезолаза, тирозиназа и т. п.
^ч. ОН qh Q
Наиболее активными продуцентами фермента лакказы среди высших базидиальных грибов белой гнили являются грибы рода Trametes (пор.
Aphyllophorales, сем. Poriaseae). По данным Бабицкой и Щербы [Бабицкая, Щерба, 1987] Trametes hirsuta в наибольшей степени обладает лакказной активностью.
1.4. Особенности роста в глубинной культуре и синтеза оксидаз
грибами рода Trametes
Глубинное культивирование базидиомицетов имеет ряд очевидных преимуществ перед поверхностным, так как позволяет значительно сократить производственные площади за счет компактности установки, исключить тяжелый непроизводительный ручной труд, улучшить гигиену труда, упрощает механизацию и автоматизацию производства, делает возможным переход на непрерывный способ культивирования.
При глубинном культивировании создаются благоприятные условия для доступа кислорода и питательных веществ ко всем клеткам мицелия, обеспечиваются благоприятные условия для роста и накопления продуктов метаболизма, сокращается количество твердых отходов.
Процесс глубинного культивирования обеспечивает короткие сроки культивирования, асептичность условий, увеличивает количество получаемого продукта, высокую культуру производства. Глубинное культивирование базидиальных грибов является наиболее перспективным для целей получения ферментных препаратов [Грачева, 2000].
Грибы рода Trametes обладают высокой для базидиальных грибов скоростью роста в условиях глубинного культивирования. Эти грибы способны расти на легко доступных питательных средах, например на отварах или гидролизатах отходов растительного сырья [Грачева, 2000].
В подавляющем большинстве случаев при глубинном культивировании базидиальных грибов рост мицелия происходит в виде пеллет - сферических
скоплений мицелия, не обнаруживающих клеточной дифференциации [Капич и др., 1985, Starka, 1955, Низковская, 1972].
Форма роста у одного и того же вида может заметно изменяться под влиянием рН и состава питательной среды, степени аэрации и скорости перемешивания [Иванушкина, Мирчинк, 1983; Burkholder, Sinnot, 1945; Yoshida etal., 1967; Righelato, 1975; Dijkstra, 1976; Габинская, 1976; Бухало, 1988].
В литературе есть указания на то, что у некоторых грибов существует два оптимума рН для роста мицелия, второй из которых иногда находится в щелочной области [Низковская, Милова, 1965 б, а, Кириленко, Захарченко, 1983,Беккер, 1963, Бухало, 1988].
Как показали Л.Г. Дудченко с соавторами [1988] на примере C.hirsutus и С. versicolor оптимумы рН для проявления активности разных ферментов не совпадают и зависят от сроков культивирования.
Изучены трофические потребности базидиальных грибов и, в том числе, Trametes [Капич, 1981; Маслова, 1969, 1972; Пашенова, 1988; Fries, 1955; Ginterova, 1973; Ghosh, 1977].
Грибы рода Trametes, как и другие дереворазрушающие грибы, изучаются как продуценты ферментов [Гаврилова, Григорьева, 1983; Гаврилова, Гусарова, 1986; Гаврилова, Королева, 2002; Гаврилова и др., 2002; Денисова, 1984; Денисова, Алехина, 1987; Денисова и др., 1983, 1985; Дудченко, Трутнева, 1985 а; Землянухина и др., 2002; Золотарев и др., 1990; Кадималиев и др. 2002,2002а; Лир, 1961; Маттисон и др., 1965, 1966, 1966а; Мельничук и др., 1983; Низковская и др. 1980; Никитина и др.2002; Озолиня и др., 1988; Семичаевский, 1984, 1985; Семичаевский, Касьянова, 1988; Семичаевский и др., 1985; Скоробогатько и др., 1993; Федорова, 1974; Arora, Sandhu, 1984; Birkinshaw and Findlay, 1940; Bumpus, 1985; Cohen, Gabriele, 1982; Das, Chatterjee and Roy, 1979;
Evans, Palmer, 1974, 1983; Kamaya, Higuchi, 1984 a, 1984; Kawai, 1969, 1970 a, 1973; Kent, Kirk, 1981; Leatham, 1983; Leonowicz et al., 1984; Levernoche, 1983; Lobarzewski, 1981 a,b; Starka, 1962].
Процесс культивирования может вестись на различных субстратах [Маслова, 1972; Морозова и др., 1985]: картофельном соке [Вечер и др., 1978; Паромчик и др., 1985] и других с/х отходах [Капич, 1983], гидролизатах древесины [Гусарова и др., 1982, 1983; Емельянова, 1989; Тихонова и др., 1985] молочной сыворотке [Залашко, Залашко, 1976; Капич, Стахеев, 1983; Капич и др., 1987; Морозова и др., 1990; Таратунина, 1988; Таратунина, Тарасова, 1985; Таратунина и др., 1987, 1988], на мелассе [Langpaulova, 1986] с применением биостимуляторов [Дворнина и др., 1991].
Coriolus hirsutus БИН-070 культивировали на среде со свекловичной мелассой и кукурузным экстрактом и минеральными солями (РВ - 2,5 г/л). Инокулят вносили в количестве 10 % от объема среды. Отмечено, что культура лучше растет в условиях самостоятельного регулирования рН. Начальное значение рН составляло 5,7. Температура культивирования - 26 С, уровень аэрации 1 л воздуха/1 л среды/мин. За 22 час культивирования достигнуто накопление биомассы 1,21 г/л. Максимальная удельная скорость роста культуры составила 0,32 ч", экономический коэффициент потребления субстрата - 0,92 [Алексеев, Степанов, 1987].
Изучению особенностей глубинного культивирования посвящены работы многих авторов [Atacador-Ramos et al., 1961; Duvnjak, Tamburasev, 1978; Eddy, 1986; Gabriel, 1967; Kossen, Metz, 1976; Litchfield, 196] На продолжительность ростовых фаз существенно влияет состав питательной среды, способ выращивания посевного материала, его количество, и возраст [Бухало, 1988; Соломко и др., 1981,1988].
В 1966 году Н.А. Маттисон с сотрудниками обнаружил внеклеточные оксидазы, образуемые грибами рода Coriolus, при этом С. vaporarius был одним из наиболее активных.
Изучению оксидаз грибов рода Coriolus, связаному в первую очередь с их лигнолитической способностью, посвящены работы многих авторов [Низковская и др., 1984, Rosenberg, 1980, Kent, 1981, Evans, Palmer, 1983, Leatham, Kent, 1983]. В особенности хорошо изучены наиболее распространенные виды (С. versicolor и С. zonatus) при росте на соломе, древесине [Низковская и др., 1984, Бабицкая, Стахеев, 1981, Targonski, 1983, Muller,Trosch, 1986] и, даже, на буром угле [Cochen, Gabriele, 1982; Leontievsky, Golovleva at al, 1997].
В.Д. Семичаевским и A.H. Касьяновой [1988] изучены ферментативные системы высших базидиомицетов и, в том числе, С. zonatus, С. versicolor и С. hirsutus. Авторы делают вывод о том, что внеклеточные фенолоксидазы грибов белой гнили проявляют высокую устойчивость к инактивации и низкую избирательную способность по отношению к фенольным субстратам.
Наиболее подробно в литературе описаны окислительные ферменты базидиомицета С. versicolor. Лир [Лир, 1961] у T.versicolor установил присутствие глюкозооксидазы и специфичной ксилозооксидазы. Хорошо изучены пероксидазы C.versicolor [Lobarzewski, 1981, Lobarzewski, Krywuta, 1981].
По данным В.П. Гавриловой и Н.К. Григорьевой [1983] для всех штаммов грибов, изученных этими авторами, характерно два пика активности внеклеточных оксидаз. Внеклеточная пероксидаза синтезируется на более раннем этапе роста грибов, чем лакказа. Максимальное содержание внеклеточных ферментов для исследованных штаммов соответствовало концу стационарной фазы роста и началу фазы отмирания.
М.М. Афанасьева [1984] изучила динамику образования лакказы и пероксидазы в глубинной и твердофазной культуре четырех дереворазрушающих грибов и пришла к выводу, что С. hirsutus обладает способностью разрушать преимущественно лигнин в более ранние сроки, причем, при твердофазном способе интенсивнее, чем при глубинном.
Изучено образование лакказы грибами Polyporus versicolor и Trametes hirsuta на средах, содержащих фенольные соединения [Arora, Sandhu, 1984, Sandru, Arora, 1984]. С. versicolor образует лакказы В и А и два гемсодержащих белка, один из которых пероксидазного типа, второй отнесен к цитохрому В [Evans, Palmer, 1984].
Продолжительность культивирования в ферментере базидиомицетов рода Trametes (Т. hirsuta) - продуцентов лакказы, до 2-5 суток [Гаврилова, Королева, 2002].
1.5 Влияние различных факторов на оксидазную активность
Многие авторы проводят скининг штаммов и первичный отбор продуцентов лакказы методом тестирования на твердых средах, содержащих вещества, подвергающиеся окислению лакказой с изменением цвета [Kiiskinen et al., 2004; Chairattanamanokorn et al., 2006; Белова и др., 2007]. Авторы [Белова и др., 2007] отмечают наличие высокой ОА при слабом росте мицелия у Lentinellus ursinus F.robustus и Steccherinum ochraceum. Тогда как для вда рода Trametes - T.gibbosa высокой ОА соответствовал хороший рост гриба.
Среди источников углерода наиболее эффективными для синтеза лакказы Trametes versicolor некоторые авторы считают целлобиозу и манит, в то время как на глюкозе была отмечена максимальная активность марганец пероксидазы и пероксидазы [Mikiashvili et al., 2005]. В то же время другие авторы лучшим источником углерода для Trametes versicolor считают мальт экстракт [Arora, Rampal, 2002].
Для Armilliria mellea показано, что целлобиоза и раффиноза были лучими источниками углерода, чем мальтоза, сорбоза и галактоза [Xiao et al., 2002], для Pestalotiopsis sp. - глюкозы [Hao et al, 2006]. Для получения высокой лакказной активности Agaricus sp. использована лимитированная по азоту среда с глицерином, глюкозой, фруктозой маннитом, арабинозой, мальтозой, сахарозой, целлюлозой, целлобиозой.
Для получения лакказы предлагают использовать такие отходы как пшеничные отруби и отходы сахарного тростника (багассу) [Verma et al., 2002], сточные воды оливковых маслобоен [Fenice et al., 2003].
J.L. Dong с соавторами [Dong et al., 2005], исследовав продукцию лакказы штаммом Trametes gallica на 12 различных средах, показали, что органические источники азота, такие как триптон и пептон увеличивают лаккакзную активность. Смесь аминокислот и лигнина также увеличивает продукцию лакказы. Для Armilliria mellea также показано, что органические источники азота больше подходят для синтеза лакказы, чем неорганические [Xiao et al., 2002].
Для получения лакказы и марганецпероксидазы Partus tigrinus (P. tigrinus) CBS 577 на сточных водах оливкового производства, разведенных в 2 раза эффективно было добавление 0,5 % сахарозы и 0,1 % дрожжевого экстракта [Fenice et al., 2003].
В качестве индуктора лакказы часто приводят двухвалентную медь в виде сульфата. Причем, указываемое оптимальное количество этого элемента значительно варьирует. Так, в разных работах использую 0.5-1 mM Cu(II) для Trametes multicolor MB 49 [Hess et al., 2002], 0.5 mM Cu(2+) [Tong et al., 207], 1.5-2.0 мм (для Т. pubescens) [Galhaup et al., 2001], 5 мкМ Cu2+ до инокултрования Rhizoctonia praticola 93A [Janusz et al.,2006], 0.2 mM для Fomes sclerodermeus
[Papynutti et al., 2003], 0.5-1 mM для Trametes multicolor MB 49 [Hess et al., 2002], 2,0 mM [Hao et al., 2006], 1 mM для Armilliria mellea [Xiao et al., 2002], 0.2 mM для Fomes sclerodermeus, причем добавление меди угнетало активность марганец пероксидазы [Papynutti et al., 2003].
Показано, что внесение 20 мМ и более Си(2+) ингибирует лакказную активность [Lorenzo et al., 2005] Внесение меди в среду стимулировало продукцию лакказы Trametes trogii. Однако этот эффект наблюдался на средах с низким уровнем азота [Trupkin et al., 2003]. Медь для максимального эффекта должна была быть добавлена в течение экспоненциальной фазы роста [Galhaup etal.,2001].
В качестве потенциальных индукторов были проверены более 30 низкомолекулярных соединений [Леонтьевский А.А., 2002]. Одновременное внесение индукторов, специфичных для марганецлигнинпероксидазы и лакказы, повышало выход обоих ферментов. Были найдены нефенольные индукторы лакказы: анисовый спирт, вератровая кислота и др. Повышение концентрации меди до 0,5-2,0 мМ вызывало слабую индукцию лакказы, однако наибольший эффект достигался при одновременном внесении меди и специфического индуктора.
Активность лакказы увеличивает внесение в питательную среды индукторов: 2,4-диметилфенола [Черных и др., 2005]. Выход фермента при этом повышается в 10 раз, вератрилового спирта, феруловой и вератриловой кислот. [Kaluskar et al., 1999]. Для P. pulmonarius (Fr.) лучшими индукторами синтеза лакказы были феруловая кислота, и ванилин, в присутствии которых лакказная активность увеличивалась в 10 раз. [de Souza et al., 2004]. Использование гваякола в качестве индуктора лакказной активности Trametes versicolor позволило увеличить лакказную активность на 780 % без
ингибирования роста [Ryan et al., 2007], гваякола и сирингалдазина для Coriolus hirsutus, Coriolopsis fulvocinerea, Cerrena maxima [Горбатова и др., 2006], 2,5-ксилидина (1 mM) [Janusz et al;,2006], 6 тМ о-толуидина [Tong et al., 207], o-толуидина и сирингалдазина [Xiao et al., 2001], 50 и 100 мкМ таниновой кислоты для Coriolopsis gallica [Carbajo et al., 2002]. Феруловая кислота известна как наиболее эффективный индуктор синтеза лакказы монокариотичеаким штаммом Pycnoporus cinnabarinus ss3. [Lomascolo et al., 2003].
Добавление 25 г/л этанола увеличивает лакказную активность (экспрессию гена лакказы) Pycnoporus cinnabarinus [Alves et al., 2004]; В присутствии 35 г/л этанола активность и продуктивность лаказы была в 155 и 65 раз выше по сравнению с не индуцированным вариантом. При добавлении к чистой лакказе того же штамма лакказная активность была ингибирована. [Lomascolo et al., 2003].
Хотя лакказа синтезируется в отсутствие Mn , лакказная активность Trametes species, T.cingulata, Т. elegans и Т. pocas была выше при добавлении в
среду Mn [Tekere et al., 2001]. В то же время есть указания на ингибирующую роль Мп2+ на синтез лакказы [Xiao et al., 2001].
Изучено влияние добавления в среду при глубинном культивровании нерастворимых лигноцеллюлозных материалов (виноградных косточек, виноградных гребней и ячменных отрубей) на лакказную активность. Показано, что отруби давали наиболее высокую активность- 639 U/1, которая в 10 раз превышала активность без добавок [Lorenzo et al., 2002]. Для получения высокой лакказной активности Agaricus sp. В 2-6 раз
активность увеличивалась в присутствии соломы, ксилана, ксилозы, лигносульфоната [Kaluskar et al., 1999].
Соотношение компонентов среды для максимального синтеза лакказы должно быть оптимизировано [Trupkin et al., 2003]. Гао с соавторами указывают, что оптимальным соотношением углерода к азоту в среде является 100:8 [Gao et al., 2005].
Некоторые авторы указывают на необходимость для получения высокой лакказной активности лимитирования азотом [Tamagawa et al., 2006; Gao et al., 2005].
Однако другие авторы, считают, напротив, что высокое содержание органического азота в среде приводит к хорошему росту культуры и синтезу лакказы [Xiao et al., 2001], в том числе для Trametes species, T.cingulata, Т. elegans и Т. pocas [Tekere et al., 2001]. Для получения высокой лакказной активности Trametes versicolor были найдены оптимальное соотношение - по 10 г/л глюкозы и пептона [Ryan et al., 2007].
Оптмимзированный состав среды для получения лакказы Trametes modesta включает 7,34 г/л пшеничных отрубей, 0,87 г/л глюкозы, 2,9 г/л дрожжевого экстракта, 0,25 г/л хлодида аммония, начальный рН 6,95 и температура 30С [Nyanhongo et al., 2002]
Гесс с соавторами [Hess et al., 2002] указывают, что при культивировании Trametes multicolor MB 49 в ферментационном аппарате с механическим перемешиванием происходило снижение активности и масштабирование процесса синтеза лакказы даже до лабораторного уровня не удавалось.
Показано, что максимальой активности культура Pleurotus pulmonarius достигает при исчерпании азота и углерода в среде [de Souza et al., 2004]
Для Phanerochaete chtysosporium показано, что при появлении опушенности пеллет культура переходит к вторичному метаболизму и начинается активный синтез ферментов, в том числе лакказы [Gao et al., 2005]
Продукция лакказы по данным разных авторов составляет 6,810 U/1 (268 mg, 25,4 U/mg белка по гваяколу на среде с глюкозой и 7,870 U/1 (310 mg) на среде с целлобиозой [Tong et al., 2007], 4000 nkat/1 [Janusz et al.,2006], 923,7 U/л [Xiao et al., 2001], 13,5 U/мл за 16 дней культивирования или 270 U/мл за 28 дней [Papynutti et al., 2003а; Papynutti et al, 2003b], 65 U/ml [Galhaup et al., 2001], 32.7 U/мл [Hao et al., 2006], 4,022 U на мг белка [Salony et al., 2006], 85 U/мл [Hess et al., 2002].
Alves с соавторами разработали систему экспрессии гена лакказы Pycnoporus cinnabarinus, позволяющую считать индустриально пригодным продукцию лакказы 3,9-4,7 nkat / мл (1-1,2 г/л лакказы) [Alves et al., 2004]. Активность 19000-29000 U/л/сутки (до 1-1,5 г/л лаказы) авторы считают промышленным суперпродуцентом [Lomascolo et al., 2003, Heproel et al,m 2000]. Хотя другие авторы указывают продукцию рекомбинантного штамма 80 мг/л [Sigoillot et al., 2004].
Поскольку разные авторы приводят лакказную активность при измерении по разным субстратам, в разных условиях и в разных единицах, а также полученную за разное время, продуктивность предлагаемого процесса производства лакказы с помощью этих методов и штаммов оценить затруднительно.
Кинетические параметры были определены для Trametes versicolor АТСС 20869 в ферментере с магнитной мешалкой. Максимальная удельная скорость роста составляла в среднем 0,94 ±0,23 сут'1, и 0.15 ± 0.04 сут"1 соответственно. Максимальное удельное потребление глюкозы и аммония были
3,37 ± 1,16 и 0,15 ± 0,04 сут"1 соответственно. Максимальное удельное потребление кислорода была 1,63 ±0,36 сут"1 [Thiruchelvam et al., 2007]
Для многих дереворазрушающих грибов оптимум роста и активности лигнинолитичеких ферментов находится при кислых значениях рН среды. [Степанова и др., 1979]. Даниляк с соавторами [1989], отмечает, что оптимальной для проявления активности лигнолитических ферментов у высших базидиомицетов является область рН 3,5-5,0.
Королевой О.В. с соавторами [Koroleva OV., et al., 2000; Королеа и др, 2000] были определены оптимальные условия для синтеза лакказы С. hirsutus 072: температура 28С, количество посевного материала 15%.
Введение в состав культуральной жидкости стационарной культуры 0,1-0,2%) твина-80, иммобилизация мицелия, температурный сдвиг привели к получению нескольких вариантов условий культивирования, отвечающих высокому выходу ферментов [Леонтьевский, 2002].
АР Tavares с соавторами для Trametes versicolor показал, что скорость перемешивания играет меньшую роль по сравнению с начальной концентрацией глюкозы и рН [Tavares et al., 2006]
Дополнительное введение в среду перфторана как агента, переносящего кислород, и иммобилизация гриба на поликапроамидном волокне существенно увеличивают активность секретируемой в среду лакказы. [Черных и др., 2005; Chairattanamanokorn et al., 2006].
1.6. Характеристики и области применения лакказы Основной трудностью в работе с лакказами является то, что затруднительно определять лакказу по воздействию на субстрат ввиду ее очень широкой субстратной специфичности, которая варьирует от одной лакказы к другой, а спектр субстратов перекрывается со спектром субстратов тирозиназы. Хотя лакказу называют дифенол оксидазой, монофенолы, такие, как 2,6-
диметоксифенол или гваякол, часто оказываются лучшими субстратами для лакказы, чем дифенолы, такие как пирокатехин или гидрохинон [Baldrian, 2006]. Некоторые авторы, ссылаясь на статью JM Harkin (Harkin et al., 1974), рассматривают сирингалдазин как исключительный субстрат лакказы в условиях, когда пероксид водорода, способный также окислять сирингалдазин, устранен из сферы реакции. Лакказа окисляет также полифенолы, метокси-замещенные фенолы и ароматические диамины, но не окисляет тирозин, как это делает тирозиназа [Baldrian, 2006].
Грибные лакказы являются как экстрацеллюлярными ферментами, так и интрацеллюлярными. [Baldrian, 2006].
Исследованию физико-химических характеристик и субстратной специфичности лакказы посвящены работы [Горбатова и др.,2000; Королева и др.,2001; Koroleva et al., 2002, 1998; Скорбогатько, 2000; Скоробогатько и др., 1998; Смирнов и др., 2001, Yaropolov et al., 1994; Koroleva et al., 200; Koroleva et al., 1999]
Многие авторы отмечают высокое генетическое сходство лакказ из базидиальных грибов [Tong et al., 2007]. К настоящему времени описаны характеристики около 100 лакказ. На основании этих данных сделаны обобщения.
Молекулярная масса лакказ составляет от 43 до 383 Ша, в среднем - 60-70 KDa [Baldrian, 2006], изоэлектрическая точка находится в кислой области около рН 4,0, [Baldrian, 2006], температурный оптимум 25 -80 С, в среднем -55[Baldrian, 2006], рН оптимум - 3,0-8,0, в среднем 4,0-6,0 в зависимости от субстрата (для гидрохинона и пирокатехина он составляет 3,6-4,0 и 3,5-6,2 [Shleev et al., 2004; Baldrian, 2006].
Лакказы являются гликопротеинами с содержанием углеводной части 10-25 %, однако встречаются лакказы и с содержанием более 30 % (Shleev et al., 2004) и даже 80 % Сахаров [Baldrian, 2006].
Ключевыми характеристиками лакказ являются стандартные окислительно-восстановительные потенциалы трех медных центров фермента (ТІ, Т2 и ТЗ). Потенциал ТІ центра определен для многих лакказ и варьирует от 430 мВ до 780 мВ, в то время как потенциалы Т2 центра определены только для низкопотенциальной растительной лакказы R. vernisifera (390 мВ) и высокопотенциальной грибной лакказы T.hirsuta (400 мВ), а потенциал ТЗ центра для лакказ R. vernisifera (460 мВ) и Т. versicolor (785 мВ) [Reinhammar, 1971,1972; Shleev et al., 2005a].
Непосредственно лакказы окисляют только те соединения, потенциал ионизации которых не превышает редокс-потенциал иона меди ТІ центра фермента [Хи, 1997]. Так как этот потенциал заметно ниже, чем у пероксидаз, круг их субстратов уже.
Исходя из потенциала ТІ центра все медьсодержащие оксидазы делят на три группы - высоко, средне и низко потенциальные ферменты [Eggert et al., 1998; Shleev et al., 2005b; Ferapontova et al., 2005]. К низко потенциальным лакказам относят ферменты, потенциал ТІ центра которых ниже 430 мВ (Rhus vernicifera) [Reinhammar, 1972], к средне редокспотенциальным лакказы с потенциалами 470-710 мВ, а к высоко потенциальным те, потенциал которых выше 710 мВ [Garzillo et al., 2001 Shleev et al., 2005b Xu et al., 1999 Reinhammar, 1972].
Лакказы грибов рода Trametes являются высокопотенциальным [Baldrian, 2006].
Основными субстратами, по которым определяют активность лаказы являются: гваякол [Tong et al., 2007; Dong et al., 2005], ABTS [Tong et al., 2007;
Xiao et al, 2001], 2,6-диметоксифенол [Tong et al., 2007], сирингалдазин [Tong et al., 2007].
Возможности применения лакказы рассмотрены в обзорной статье А.И. Ярополова с соавторами [1994].
Одним из примеров использования лакказно-медиаторной системы является делигнификация и обесцвечивание бумажной пульпы, вторичной переработки мукулатуры и детоксикация промышленных отходов. Принцип функционирования таких систем состоит в ферментативном окислении медиаторов лакказ с образованием продуктов с высокими редокс потенциалами. Последние могут взаимодействовать с карбогидратами, лигнином или другими экотоксикантами (красители, пестициды и др.) и проводить их деструкцию. Например, известно использование лакказы для обработки целлюлозно-бумажной пульпы, ее делигнификации и отбеливания [Sigoillot et al., 2004; Pedroza et al., 2007; патент РФ № 2001125920].
Препараты грибных оксидаз и их иммобилизованные формы эффективны при очистке сточных вод гидролизно-дрожжевого производства, содержащих фенольные соединения, при облагораживании шлихты и удалении лигнинсодержащих примесей в обработке текстиля [Королева и др., 2002]
Известно использование лакказы в текстильной промышленности для обработки льна, обесцвечивания и окрашивания хлопковых тканей [Патент РФ № 96103261, 1998; патент РФ № 94008821,1995; патент США № 6805718, 2004; патент РФ № 2000119782, 2002; патент РФ № 2148111, 2000; патент РФ № 96107218,1998].
Известно использование лакказы в органическом синтезе [Патент РФ № 2001125922,2005; патент США № 6190891, 2001];
в косметической промышленности в качестве агента для окрашивания волос [Патент Франции № 2112549, 2002; патент РФ № 2203028, 2003; патент
РФ № 2001128771, 2003; патент № 224501, 2004; патент РФ № 2193392, 2002; патент РФ № 22005339,2003; патент РФ № 2000121095, 2002];
для производства отбеливающей зубной пасты,
в производстве моющих средств [Патент США № 6815410,2004];
в иммуноферментном анализе в качестве фермента-маркера [Скоробогатько и др., 1993, 1994, 1995; Skorobogat'ko et al., 1994 Джафарова и др., 1995; Bauer et al., 1999; Kuznetsov et al., 2001].
Грибы белой гнили, благодаря наличию у них активных оксидаз, способны трансформировать многие органические соединения. [Leonowicz et. al., 1984; Kamaya, Higuchi, 1984; Orsler, Holland, 1982; Kamaya, Higuichi, 1984].
В современных условиях, когда особое значение приобретает проблема охраны окружающей среды, большое внимание уделяется способности дереворазрушающих грибов разрушать такие вещества как ДДТ, 2,3,7,8-тетрахлоробензо-п-диоксин, линдан и бензопирен до ССЬ [Bumpus et al., 1985, Leontievsky et al., 2000]. Во многих случаях вопрос о том, разрушаются ли токсические вещества полностью или подвергаются биотрансформации в какие-либо иные соединения, не всегда ясен [Скрябин, Головлева. 1976].
Известно использование лакказы для биодеградация ксенобиотиков [патент США № 6395534, 2002], в том числе фенольных отходов [Ryan et al., 2007], 2,4-дтихлорфенола и пентахлорфенола [Fahr et al., 1999], гербицидов (атразина) [Горбатова др., 2006; Королева и др., 2002; Васильченко и др., 2002; Korolevaetal., 2001];
для создания антимикробных композиций [патент США № 6592867, 2003];
Активные ферментные комплексы дереворазрушающих грибов могут быть использованы в промышленности для обесцвечивания сточных вод. [Dias et al., 2004; Carbajo et al, 2002]. Так, например, для обесцвечивания стоков,
содержащих мелассу [Ohmomo et al., 1985]; гидролизного производства [Гаврилова и Гусарова 1986; патент РФ № 2001128771, 2003; Marco-Urrea et al., 2006]. Озолиня с соавторами [Озолиня и др., 1988] к факторам обесцвечивания сточных вод дереворазрушающими грибами относит также хелатирующие агенты. Авторы наблюдали значительное ослабление окрашивания сточных вод и на 50 % снижение биологического и химического потребления кислорода. Pleurotus ostreatus может быть использован для обесцвечивания и снижения ХПК в сточных водах, содержащих винассу и экстракт кофейной гущи. При этом активность лакказы составляет 14,1 U/ml для винассы и 3,0 U/ml для экстракта кофейной гущи [Rodrigues etn al., 2003].
Показана возможность использовать Trametes trogii и Trametes versicolor для обесцвечивания различных промышленных красителей [Trupkin et al., 2003; Lorenzo et al., 2002; De Soura et al., 2002; Salony et al., 2006; Hao et al., 2006; Eichlerova et al, 2006].
Для Phanerochaete sordida YK-624 показана возможность удаления эстрогенной активнсти [Tamagawa et al., 2005; Tamagawa et al., 2006].
Лакказу применяют в биосенсорах [Капустин и др., 2004], например, анализ фенольных соединений. Показана возможность использования лакказы Coriolus versicolor для определения фенолов [Бреславская и Осина, 2002; Осина и др., 2003] включая лигнины, в сточных водах промышленных предприятий, [Патент РФ № 2001128771, 2003]. Лакказа может быть использована для определения антиоксидантной активности красных вин [Королева и др., 2002]
Таким образом, актуальной задачей биотехнологии является разработка технологии производства ферментного препарата лакказы, наиболее перспективными продуцентами которого являются базидиальные лигноразрушающие ксилотрофы рода Trametes. Однако в настоящее время недостаточно изучены вопросы влияния компонентов питательной среды и условий культивирования на синтез лакказы в
условиях глубинного культивирования. Недостаточно изучена видовая и штаммовая вариабельность грибов рода Trametes в отношении синтеза лакказы. Отсутствует разработанная промышленная технология произюдства ферментного препарата лакказы на основе грибов рода Trametes. Важнейшими этапами разработки технологии является разработка стадии культивирования и, в частности: выбор высокопродуктивного штамма, выбор основного сырья и дополнительных компонентов, оптимизация количественного состава питательной среды, оптимизация условий культивирования и разработка технологии выделения. Решению этих важнейших задач посвящена работа.
РОССИЙСКАЯ
ГОСУДАРСТВЕННАЯ
БИБЛИОТЕКА
Похожие диссертации на Разработка технологии биосинтеза фермента лакказы базидиальными грибами рода Trametes
