Содержание к диссертации
Введение
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13
2.1 Получение сухих стерильных препаратов для культур клеток 13
2.2 Бессывороточные и малосывороточные питательные среды для культур клеток 26
2.3 Влияние микроэлементов на специфическую активность питательных сред. Многоэлементные методы анализа биологических образцов 38
2.4 Заключение 55
3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 57
4 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1 Разработка технологии производства сухих препаратов для культур клеток 70
4.1.1 Разработка технологии приготовления сухой формы синтетических питательных сред 70
4.1.2 Некоторые особенности технологии изготовления сухой формы питательных сред на основе ферментативных гидролизатов
4.1.3 Разработка технологии изготовления сухой стерильной питательной среды для культивирования лимфоцитов крови 105
4.1.4 Разработка способа получения трипсина сухого стерильного для культур клеток 111
4.2 Разработка метода электронно-лучевой стерилизации сухих препаратов 131
4.3 Эффективность применения сухих стерильных препаратов в вирусологической практике 143
4.3.1 Применение сухих стерильных питательных сред для производства первичных и перевиваемых культур клеток 143
4.3.2 Изучение чувствительности культур клеток, полученных с использованием сухих стерильных питательных сред, к некоторым вирусам и токсоплазме 151
4.3.3 Оцен ка эффективности применение трипсина сухого стерильного для получения культур клеток , 159
4.4 Технико-экономическое обоснование производства препаратов для культур
клеток в сухой стерильной форме 163
Конструирование сухнх стерильных бессьгеороточных и малосывороточных питательных сред для культур клеток 167
Разработка качественных и количественных методов контроля исходных компонентов и готовых форм питательных сред 176
1 Разработка спектрофотометрического экспресс-метода анализа питательных сред на основе белковых гидролизатов 176
2 Разработка химико-атомно-эмиссионных методов анализа питательной среды и ее компонентов 182
Изучение роли и значения микроэлементов для пролиферации клеток в культуре 201
ВЫВОДЫ 217
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 219
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 222
ПРИЛОЖЕНИЯ 258
- Получение сухих стерильных препаратов для культур клеток
- МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
- Разработка технологии производства сухих препаратов для культур клеток
Введение к работе
Актуальность темы. В последние два десятилетия стремительно развиваются не только научные исследования в области клеточной биотехнологии, но и практически осуществился переход к крупномасштабному культивированию клеточных культур, на которых базируется производство разнообразных по назначению биологически активных препаратов медицинского, пищевого и сельскохозяйственного назначения. Постоянно возрастающие масштабы производства клеток-продуцентов для создания новых биопрепаратов вызвали необходимость разработки экономичных и доступных питательных сред (ПС), белковых гидролизатов, солевых и диспергирующих растворов.
Обеспечение потребности в синтетических и гидролизатных ПС до недавнего времени осуществлялось за счет производства жидких стерильных сред или их 10-кратных концентратов, имеющих срок годности, как правило, не более 6 или 12 мес. Широко используемые в вирусологической практике растворы трипсина имеют регламентированный срок хранения при температуре (6±2) С - 6 мес, а при температуре минус (15±5) С - 12 мес. При этом многократные процессы замораживания и оттаивания фермента недопустимы, так как существенно снижают его активность [88,89].
Недостатками жидкой формы препаратов для культур клеток являются нестабильность при положительных температурах, ограниченный срок годности, значительные затраты при транспортировке и хранении.
Альтернативой жидкой формы ПС может стать их сухая стерильная форма. Сухая стерильная форма ПС имеет ряд существенных преимуществ по сравнению с жидкой: продолжительный срок годности с сохранением физико-химических и биологических свойств, возможность производства больших объемов препарата одной серии, возможность быстрого приготовления жидкой стерильной среды без применения дорогостоящего оборудования для стерилизующей фильтрации, значительное сокращение расходов на хранение и транспортировку. Поэтому разработка технологии производства
7 ПС, солевых буферных систем, белковых гндролизатов, ферментов для культур клеток в сухой стерильной форме является актуальной и отвечает потребностям дальнейшего развития клеточной биотехнологии.
Следует также отметить, что в России метод получения сухих стерильных ПС на основе индивидуальных компонентов, предложенный Сперанской И.Д [157], а также исследования по изготовлению сухих стандартных образцов - референс-препаратов ПС на основе белковых гндролизатов [12] не вышли за рамки лабораторного изучения, промышленный выпуск этих препаратов не был организован.
Вопросы производства ПС представлены в трудах отечественных и зарубежных ученых: Сперанская И.Д., 1979; Дьяконов Л.П., 1984, 2000; Ермишина И.Г. 1989, 1996; Коренева А.И., Пригода А.С., 1991, 1996; Камший Л.П., 1991; Башашкина Н.А., 1994; Eagle Н., 1959, 1962; Dulbecco R„ 1954; Hayhlik L., 1964; Sato G., 1979; Patterson M.K., Ham R.G. 1982; Moore G.E., 1994; Hesse F., 2001 и др. Однако, несмотря на многочисленные имеющиеся публикации, практически отсутствуют данные по промышленному производству сухих стерильных вирусологических ПС.
Решение задач промышленного получения культур клеток потребовало научного обоснования и разработки технологии промышленного производства препаратов для культур клеток в сухой стерильной форме. Важным направлением при разработке экономичных сред является конструирование вирусологических ПС на основе белковых гндролизатов, конструирование бессывороточных и малосывороточных ПС. При этом особое значение приобретают вопросы стандартизации ПС, что требует комплексного подхода к оценке их качества и разработке эффективных методов контроля.
Цель и задачи исследований. Цель исследований - разработка технологии производства и методов контроля качества сухих стерильных форм синтетических и гидролизатных ПС, солевых буферных систем, трипсина квалификации "для культур
клеток" и их апробация при получении первичных и перевиваемых культур клеток и культивировании вирусов.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
определить общие требования к качеству исходных ингредиентов, пригодных для изготовления сухих стерильных препаратов квалификации "для культур клеток";
разработать технологию изготовления сухой стерильной формы ПС на основе индивидуальных аминокислот и витаминов и на основе белковых гидролизатов, а также технологию получения трипсина сухого стерильного (ТСС) для культур клеток;
- подобрать оптимальные условия радиационной стерилизации сухих ПС,
гидролизатов, трипсина, солевых буферных композиций;
определить оптимальные условия и сроки хранения, а также возможные причины снижения качества сухих стерильных препаратов;
апробировать сухие стерильные формы ПС и ТСС для производства первичных и перевиваемых культур клеток и наработки вирусов;
сконструировать и испытать сухие стерильные бессывороточные и малосывороточные ПС;
- разработать методы качественного и количественного контроля ПС;
оценить влияние микроэлементов, содержащихся в ПС, на пролиферацию клеточных культур;
оценить экономическую целесообразность производства и применения сухих стерильных форм ПС и ТСС в вирусологической практике;
- разработать НТД на изготовление, контроль и применение сухих стерильных ПС
и ТСС квалификации "для культур клеток".
Научная новизна. В результате проведенных исследований впервые:
- получены научно обоснованные данные, положенные в основу разработки
опытно-промышленной технологии производства сухих стерильных форм синтетических
9 и гидролизатных ПС, а также протеолитического фермента трипсина, отвечающих требованиям квалификации "для культур клеток";
экспериментально обоснованы условия электронно-лучевой стерилизации сухих форм препаратов для производства культур клеток;
определены оптимальные условия и сроки хранения сухих стерильных форм ПС и трипсина;
доказана пригодность и перспективность применения разработанных сухих форм препаратов для производства широкого спектра первичных и перевиваемых культур клеток и вирусов;
- сконструированы сухие стерильные бессывороточные и малосывороточные
синтетические ПС и ПС на основе белковых гидролизатов;
показана возможность оценки стандартности гидролизатных ПС сп ектрофото метрическим методом; отработаны методы контроля и определены предельно допустимые показатели качества сухих стерильных препаратов;
- продемонстрирована применимость разработанных автором химико-атомно-
эмиссионных методов для серийного анализа промышленных образцов сыворотки крови
(СК) животных, используемых в биотехнологии;
Приоритет и новизна научных разработок диссертации защищены 5 патентами РФ (№2084523, №2107724, №2142503, №2161549, №2201958).
Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны и внедрены в производство следующие технологии:
- технология производства в сухой стерильной форме ПС на основе индивидуальных
аминокислот и витаминов;
- технология производства в сухой стерильной форме ПС на основе белковых
гидролизатов;
- технология производства ТСС для культур клеток.
10 Разработаны экспресс-метод оценки качества гидролизатных ПС и унифицированные методики химико-атомно-эмиссионного определения микроэлементов вСК.
Обоснована экономическая и практическая перспективность применения сухих стерильных форм препаратов для вирусологической практики. По результатам работы подготовлены и утверждены в установленном порядке 18 нормативно-технических документов. Для вирусологической практики предложено 10 видов коммерческих препаратов в сухой стерильной форме:
питательная среда Игла сухая стерильная; питательная среда 199М сухая стерильная; питательная среда RPMI-1640 сухая стерильная; питательная среда МЕМ-4 сухая стерильная;
питательная среда для культивирования лимфоцитов крови сухая стерильная; среда питательная на основе ферментативного гидролизата мышечных белков сухая стерильная;
среда питательная на основе ферментативного гидролизата белков сыворотки молока сухая стерильная;
среда питательная на основе ферментативного гидролизата белков крови сухая стерильная;
среда питательная на основе ферментативного гидролизата лактальбумина сухая стерильная;
трипсин сухой стерильный для культур клеток.
Апробация работы. Основные результаты доложены и получили положительную оценку на Всесоюзной конференции по актуальным вопросам разработки препаратов медицинской биотехнологии (Махачкала, 1990 г.); III Всесоюзном совещании по культивированию клеток животных и человека (Пущино, 1990 г.); VII Европейской
конференции по аналитической химии (Вена, Австрия, 1990 г.); XI Международной конференции по аналитической атомной спектроскопии (Москва, 1990 г.); Всесоюзной конференции по питательным средам и сывороткам для культивирования клеток (Новосибирск, 1991 г.); Международной конференции по медицинской биотехнологии (Ленинград, 1991 г.); II, V, VII Симпозиумах «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 1995 г., 1998 г., 2000 г.); конференции «Перспективы развития производства биопрепаратов для медицины и сельского хозяйства» (Степногорск, 1995 г.); Всероссийской конференции «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 1996 г., 2000 г.); конференции «Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротест системи (Махачкала, 1998 г., 2001 г.); VII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2000 г.); VII, VIII, IX, X, XI международных конференциях «Новые информационные технологии в медицине и экологии» (Гурзуф, 1999 г., 2000 г., 2001 г., 2002 г., 2003 г.); I и II Международных конгрессах "Биотехнология - состояние и перспективы развития" (Москва, 2002 г., 2003 г.); Международной конференции "Современные достижения и проблемы клеточной биотехнологии и иммунологии в ветеринарной медицине" (Москва, 2003 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 57 печатных работ, в том числе 5 патентов.
Основная часть результатов получена автором самостоятельно, а также при участии аспирантов Величко А.В. и Богрянцевой М.П. Вклад в работу других авторов отражен в публикациях по теме диссертации.
Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту.
По результатам выполненных исследований на защиту выносятся следующие положения:
промышленная технология производства сухих стерильных форм ПС и трипсина квалификации <едля культур клеток»;
результаты изучения электронно-лучевой стерилизации сухих ПС, белковых гидролизатов, трипсина, солевых буферных композиций;
технология изготовления сухих стерильных бессывороточных и малосывороточных ПС для культур клеток;
спектрофотометри чес кий экспресс-метод оценки качества ПС на основе белковых гидролизатов;
методические разработки по химико-атомно-эмиссионному определению МЭ в СК;
результаты изучения концентрационных зависимостей влияния МЭ на пролиферацию клеточных культур;
экспериментальное обоснование целесообразности и перспективности применения сухих стерильных форм ПС и ТСС для производства широкого спектра первичных и перевиваемых культур клеток и вирусов.
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Получение сухих стерильных препаратов для культур клеток
Качество биопрепаратов, получаемых на основе клеточной технологии, в значительной степени обусловлено качеством ПС, буферных и диспергирующих растворов, используемых для получения культур клеток и вирусов. В свою очередь качество ПС и растворов зависит от свойств исходных компонентов, технологии производства и условий хранения конечного продукта.
Развитие биотехнологии и ее выход на промышленный уровень привели к увеличению потребности и расширению ассортимента ПС для культур клеток. ПС, буферные и диспергирующие препараты производят как в жидкой, так и сухой формах, и каждая из этих форм имеет конкретные преимущества и недостатки.
Преимущество жидкой формы ПС в том, что она готова к использованию (если не требуется добавления других питательных веществ, компонентов), а ее состав оптимизирован для конкретного типа клеток. Однако часто для оптимального роста клеточной культуры требуется введение дополнительных компонентов, в частности L-глутамина, сыворотки, экстрактов, цитокннов, липидов и т.п. При стерилизации ПС автоклавированием, переменным током высокой частоты или ультразвуком [95, 207] возможно разрушение ряда термолабильных компонентов ПС. Поэтому для стерилизации жидких форм ПС используют метод стерилизующей фильтрации [60, 80, 107]. Существенными недостатками данного метода являются высокие трудоемкость и себестоимость производства, ограниченная пропускная способность фильтрующих материалов, что сказывается при масштабировании производства ПС [135,155,156].
Следует отметить, что жидкие формы ПС чувствительны к воздействию повреждающих факторов: температуры и солнечного света [84, 96, 296]. В питательной среде под действием света образуются небольшие количества водорода пероксида (Н3О2), что может стать летальным для клеточной культуры. Так, например, при освещении 14 20 Вт/м2 среда RPM1-1640 с добавлением буфера HEPES (25 ммоль/л) за 3 часа снижает скорость синтеза ДНК в тимоцитах более чем в 300 раз [281]. Такое сильное подавление ростовых свойств среды объясняется участием рибофлавина и HEPES в образовании Н2О2, оказывающего токсическое воздействие. Имеются данные о значительном снижении ростовых свойств ПС после трехкратной (по 4 час) выдержке ее при комнатном свете, по сравнению с контролем [296]. Для избежания проблем, связанных с термо- и фотолабильностью, жидкие ПС хранят при пониженных температурах в защищенном от света месте. Гарантированные сроки хранения ПС не превышают 12 мес. при температуре 4-10 С.
Ограниченные сроки хранения имеют и жидкие формы протеолитических ферментов, используемых для дезагрегации тканей. Активность жидких форм трипсина при комнатной температуре снижается в 4 - 8 раз через 1 мес. хранения, при температуре 4 - 10 С - через 5 мес. В замороженном состоянии активность препарата сохраняется практически на исходном уровне в течение 18 мес. С учетом указанных данных максимальный срок хранения раствора трипсина при температуре 4 - 10 С составляет 6 мес, а в замороженном виде -12 мес. [145],
С целью увеличения гарантированных сроков хранения и стабилизации жидких форм ПС были попытки использования добавок антиоксидантов (АО) класса пространственно-затрудненных фенолов. Однако полученные данные свидетельствовали о том, что для низкомолекулярных АО существует концентрационный барьер, не позволяющий использовать такие соединения для стабилизации ПС: концентрация АО в среде 10 7 - 10 5 моль/л была недостаточной для предотвращения неблагоприятных химических реакций в жидких ПС, а увеличение концентрации АО до 10 4 моль/л вызывало дегенерацию клеток в культуре [114,214].
Материалы и методы
В исследованиях применялись следующие вирусологические ПС производства ГНЦ ВБ "Вектор":
ПС жидкие стерильные: RPM1-1640 по ФС 42-3628-98, Игла по ФС 42-3503-98, Игла MEM по ФС 42-3540-98, 199М по ФС 42-3500-98, Грейса (ICN), питательные среды ПС-1 и ПС-4 для культивирования клеток ВНК-21, ПС-3 для клеток ЛЭЧ [36].
Для приготовления гидролизатных ПС использовали следующие ферментативные гидролизаты: гидролнзат белков сыворотки молока (ГСБМ) по ТУ 10.07.44-90, гидролизат мышечных белков (ФГМ-С) по ТУ 461220-80, гидролизат белков крови (ГБК-С) по ТУ 10.09-137-91 и гидролизат лактальбумина (ГЛА) фирмы «Difco».
Сыворотки крови
Сыворотка крови КРС по ФС 42-3410-97, сыворотка крови плодов коровы ФС 42-3368-97, сыворотка крови КРС, обработанная полиэтиленгликолем по методике [102, 216].
Культуры клеток
Перевиваемые линии клеток,
В работе использовали паспортизованные клеточные культуры, полученные из музея клеточных культур ГНД ВБ " Вектор": перевиваемые линии клеток эпидермоидной карциномы гортани человека (Нер-2), клетки почки африканской зеленой мартышки (Vera, 4647), клетки почки сирийского хомячка (ВНК-21), клетки лимфомы Беркитта (Namalwa), клетки карциномы шейки матки (Hela), клетки эпидермоидной карциномы ротовой полости (KB), клетки почки собаки (MDCK), клетки яичников непарного шелкопряда Limantria dispar L. (SCLD-135), клетки почки теленка (MDBK), клетки почки эмбриона свиньи (СПЭВ), диплоидная культура легкого эмбриона человека (ДК-58).
Культивирование клеток проводили в течение 5 последовательных пассажей с 3 - 4 дневным циклом при посевной дозе в каждом пассаже 100 - 200 тыс.кл./мл. После 5-го пассажа осуществляли оценку морфологических характеристик, подсчет среднего значения индекса пролиферации (ИП) и количество жизнеспособных клеток [101]. Получение первичных культур клеток
Первичные культуры клеток (ФЭК, ПЭК, ПЭС, ТБ, ПК, ПЩ) получали по общепринятым методикам [36, 55] обработкой 0,25 %-ным раствором препарата ТСС животной ткани до полного ее «истощения».
Для каждого вида ткани определяли необходимую для дезагрегации оптимальную концентрацию фермента ТСС в растворе. С этой целью готовили его разведения в ФБР до активности 40, 20,10 и 5 ЕД по Шоу-Петиколас.
Эффективность дезагрегации ткани оценивали по выходу клеток из 1 г ткани. Подсчет клеток проводили в камере Горяева с использованием счетчика для форменных элементов крови.
Ростовые свойства клеток оценивали по их адгезионной способности, сроку формирования монослоя, урожаю клеток (УК), индексу пролиферации (ИП) и морфологии монослойной культуры. Доноры ткани
Донорами ткани служили 3-9 месячные эмбрионы коров, 2-3 месячные эмбрионы свиней, бычки 4 - 6 месячного возраста, 1 - 4 недельные крольчата, 1-2 месячные щенки, а также 7-12 дневные куриные эмбрионы. Микроорганизмы Toxoplasma gondii
Toxoplasma gondii (штамм Rh) поддерживали путем пассажей на беспородных мышах (питомник ГНЦ ВБ "Вектор") при внутрибрюшинном введении. Для выращивания препаративных количеств тахизоитов токсоплазм использовали монослой культуры клеток Vero.
Разработка технологии производства сухих препаратов для культур клеток
Производство ПС в сухой стерильной форме представляет собой сложную многооперационную технологию, включающую последовательные процессы предварительного отбора и подготовки исходных компонентов, дальнейшего их измельчения и смешивания, фасовки и радиационной стерилизации, контроля пригодности готового препарата для культивирования клеток и вирусов. Изучение и оптимизация этих процессов были необходимы при разработке технологии изготовления сухих стерильных ПС как на основе индивидуальных аминокислот и витаминов, так и на основе белковых гидролизатов, а также трипсина сухого стерильного квалификации «для культур клеток».
В производстве сухих ПС большое значение имеет качество исходных компонентов, от которого во многом зависит качество и стандартность готовых препаратов. В связи с этим нами изучены образцы и партии компонентов, поставляемые различными зарубежными и отечественными фирмами, и определена возможность их применения в производстве сухих стерильных ПС.
Для изготовления синтетических ПС использовали аминокислоты и витамины, производимые различными зарубежными фирмами (ICN, Sigma, Gibco, Difco и др.) квалификации «для культур клеток». Неорганические соли квалификации «хч» и «осч», и другие ингредиенты, выпускаемые отечественной промышленностью, не предназначены специально для получения вирусологических ПС и требовали предварительного контроля и дополнительной подготовки перед включением их в состав сред.
Сушка исходных компонентов. Сухая ПС должна представлять собой однородный порошок с определенной влажностью и насыпной плотностью, растворяться в воде без проявления опалесценции или образования осадка, иметь длительные сроки хранения при оптимальных условиях. Успех получения однородных порошковых смесей зависит от влажности исходных компонентов. Поэтому перед измельчением-смешиванием необходимо удалить излишнюю влагу. Сушка, как стадия технологического процесса, имеет свои особенности в силу специфических требований, предъявляемых к производству МИБП, к которым относятся ПС. Производство МИБП, должно соответствовать санитарным правилам СП 3.3.2.1288-03, включающим комплекс требований к производству и контролю МИБП, гарантированно обеспечивающих активность, безопасность и стабильность таких препаратов. Способ сушки должен исключить возможность загрязнения компонентов ПС, а также их разложения, предотвратить реакции окисления, гидролиза, приводящие к изменению качества сред. Как правило, ПС готовят на основе сбалансированных буферных солевых растворов. Неорганические соли создают необходимое осмотическое давление, ионный баланс, определенный рН и буферную емкость среды. В практике культивирования клеток in vitro наиболее широко используют сбалансированные солевые растворы Хенкса, Эрла, Дульбекко [58]. Поскольку многие неорганические соли гигроскопичны и содержат в своем составе кристаллизационную воду перед использованием их подвергают предварительному высушиванию. Продолжительность процесса высушивания солей при изготовлении сухой формы буфера в работах И.Д. Сперанской [157] и Н.А. Башашкиной [12], колебалась от 5 до 45 сут. при значительном варьировании температуры. По разработанным в ИПиВЭ [157] режимам высушивания магний хлористый вначале высушивают при температуре 70 С в течение 6-8 сут., а затем при температуре 80 С еще в течение 12-15 сут., натрий фосфорнокислый двузамещенный высушивают 30 сут. при температуре 37 С, а затем еще 12-15 сут. при температуре 50 - 56 С. Двухступенчатый режим высушивания применяется и для магния сернокислого [157].
Похожие диссертации на Разработка технологии производства и методов контроля препаратов для культур клеток в сухой стерильной форме
