Введение к работе
Актуальность проблемы
В Российской Федерации ежегодно регистрируется 31-32 млн. случаев инфекционных заболеваний, значительную часть в которых составляют острые кишечные инфекции. По данным Всемирной организации здравоохранения около 70% всех случаев ОКИ имеют вирусное происхождение и 30 % бактериальную этиологию. В последние годы в РФ наблюдалась устойчивая тенденция к росту заболеваемости ОКИ, а удельный вес заболеваний, вызванных возбудителями неустановленной этиологии, составляет от 62 % до 69 % (Государственный доклад «О состоянии здоровья населения Российской Федерации в 2010 году», Онищенко Г.Г.).
Для совершенствования лабораторной диагностики инфекционных заболеваний большое значение имеют питательные среды. Долгие годы производство питательных сред базировалось на панкреатическом гидролизате кильки каспийской, гидролизате казеина и пептоне ферментативном (Меджидов М.М., 1985). Недостаточный ассортимент сред в нашей стране приводил к практике их лабораторного изготовления, что естественно сказывалось на их качестве и стандартности (Раскин Б.М.,1985). Зарубежные фирмы производят питательные среды на основе гидролизатов мяса, cои, казеина, причем, доля питательных сред на основе ферментативных пептонов, переваров и экстрактов мяса составляет более 50 % (Culture Media Manual, bioMerieux, 1994; Microbiology Manual «Merck», 1990).
При рассмотрении вопроса замены пищевого белка в составе питательных сред на другие виды сырья, прежде всего, возникают проблемы их доступности и стандартности. В качестве такого источника белка может быть использована рыбная кормовая мука (ГОСТ 2116-82), содержание сырого протеина в которой составляет 60-70 %. При панкреатическом гидролизе этого сырья очевидно, что будет проявляться специфичность фермента, а аминокислотный и пептидный составы, получаемых гидролизатов, могут быть близки к пептонам, получаемым из мяса, рыбы, казеина. Для приготовления такого вида гидролизатов необходимо создать такие технологические стадии, при которых будут реализованы все необходимые условия для получения конечного продукта с заданными свойствами.
Острота проблемы обусловлена возрастающими требованиями санитарно-эпидемиологического надзора по расширению спектра диагностируемых инфекционных заболеваний, среди которых социально-значимые инфекции (ОКИ, дифтерия, туберкулез, др.) занимают одно из лидирующих положений. Разработка технологии и организации производства питательных сред вносят существенный вклад в обеспечение санитарно-эпидемиологического благополучия населения России.
Цель исследования - разработать технологию производства сухого панкреатического гидролизата рыбной муки и сконструировать на его основе бактериологические питательные среды для выращивания микроорганизмов.
Задачи исследования
-
Выявить альтернативные источники белкового сырья в производстве питательных сред, определить их аминокислотный и минеральный составы.
-
Определить оптимальные параметры получения панкреатического гидролизата рыбной муки, изучить биохимический и аминокислотный состав получаемых гидролизатов, провести сравнительные исследования получаемых препаратов с известными аналогами и разработать технологию его производства.
-
Изучить ростовые свойства панкреатического гидролизата рыбной муки с использованием широкого круга микроорганизмов различных таксономических групп, определить состав питательных сред общего назначения питательного агара – ГРМ-агара, питательного бульона – ГРМ-бульона.
-
С использованием панкреатического гидролизата рыбной муки определить оптимальные составы питательных сред для выделения и дифференциации энтеробактерий: среды Эндо-ГРМ агара, Левина-ГРМ агара, Висмут-сульфит-ГРМ агара, SS-агара.
-
Экспериментально обосновать состав и разработать сухую питательную среду для выделения возбудителя дифтерии, не требующую добавления нативной крови.
-
Разработать комплекс питательных сред для контроля микробной загрязненности нестерильных лекарственных средств.
-
Разработать нормативно-техническую документацию, провести государственные испытания и зарегистрировать питательные среды в качестве изделий медицинского назначения
Научная новизна
Впервые, с использованием микробиологических, биохимических и масспектрометрических исследований показано, что панкреатический гидролизат рыбной муки является в физиологическом и химическом отношении полноценным биологическим препаратом для конструирования бактериологических питательных сред. Аминокислотный состав и другие важные для роста бактерий показатели гидролизата находятся на уровне таких классических питательных основ как пептон ферментативный и ферментативные гидролизаты мяса. В своем составе ПГРМ содержит 3,5 % аминного азота, 10 % общего азота, 18 % свободных аминокислот, 20 % хлористого натрия.
Впервые, на основе исследования параметров роста ряда патогенных бактерий и их основных свойств, важных для диагностических исследований, с использованием разработанного ПГРМ как питательной основы, сконструирован ряд питательных сред для культивирования, выделения и дифференциации бактерий: ГРМ-агар, ГРМ-бульон, Эндо-ГРМ агар, SS-агар, Левина-ГРМ агар, Висмут-сульфит-ГРМ агар.
Впервые, на основе экспериментальных исследований по оптимизации роста возбудителя дифтерии на питательных средах, основу которых составили разработанный препарат ПГРМ и стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, создана питательная среда для выделения этого патогена – коринебакагар, не требующая добавления крови и обеспечивающая рост дифтерийных бактерий на уровне сред с использованием цельной крови.
Впервые разработаны оптимальные прописи питательных сред для определения микробной обсемененности нестерильных лекарственных средств на основе панкреатического гидролизата рыбной муки. Указанные препараты прошли все этапы государственной регистрации и рекомендованы для применения в практике здравоохранения.
Теоретическая значимость
Обоснована возможность использования панкреатического гидролизата рыбной муки как основы питательных сред для культивирования широкого спектра микроорганизмов. Обоснована возможность замены в рецептуре питательных сред пищевого сырья (пептон ферментативный, ферментативные гидролизаты мяса, килька каспийская, кровьи др.) на непищевые компоненты. Разработаны теоретико-методологические основы и методические подходы по замене панкреатический гидролизат кильки каспийской, гидролизат казеина, пептона ферментативного на панкреатический гидролизат рыбной муки. Обоснована возможность замены крови на стимулятор роста гемофильных микроорганизмов в составе питательной среды для выделения возбудителя дифтерии.
Практическая значимость
Разработана технология производства панкреатического гидролизата рыбной муки – утвержден регламент производства ПР № 78095326-63-2006, показатели качества определены в технических условиях ТУ 9385-17-78095326-2006.
На основе панкреатического гидролизата рыбной муки разработана технология производства 40 наименований питательных сред, 37 из которых прошли все этапы государственной регистрации. Среды рекомендованы для применения в практике здравоохранения, были зарегистрированы в Государственном реестре лекарственных средств, в настоящее время включены в реестр изделий медицинского назначения.
Разработанные питательные среды широко используются в бактериологических лабораториях лечебно-профилактических учреждений здравоохранения и центров гигиены и эпидемиологии при диагностике инфекционных заболеваний, при проведении санитарных исследований объектов внешней среды, питьевой воды, стоков, молочных и мясных продуктов, а также в фармацевтической промышленности при контроле лекарственных средств на микробную загрязненность.
Ежегодно с использованием разработанных препаратов проводится до 50 млн. бактериологических исследований, значительную часть из которых составляют исследования по диагностике кишечных инфекций.
Внедрение в практику
Разработана технология производства 40 наименований питательных сред, 37 из которых прошли все этапы государственной регистрации. На базе ФБУН ГНЦ ПМБ организован промышленный выпуск питательных сред с ежегодным объемом производства более 75 тонн.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Разработана и экспериментально обоснована технология получения панкреатического гидролизата рыбной муки, являющегося в физиологическом и химическом отношении полноценным биологическим препаратом для конструирования бактериологических питательных сред и полноценной питательной основой для выращивания широкого круга микроорганизмов, не уступающего пептону ферментативному.
2. Панкреатический гиролизат рыбной муки может быть использован в составе микробиологических питательных сред общего назначения лабораторного и промышленного изготовления.
3. Новые составы питательных сред: Эндо-ГРМ агар, Левина-ГРМ агар, Висмут-сульфит-ГРМ агар, SS-агар - обеспечивают выделение и дифференциацию энтеробактерий.
4. Созданная питательная среда – коринебакагар, в состав которой входит панкреатический гидролизат рыбной муки и стимулятор роста гемофильных микроорганизмов по ростовым свойствам не уступает средам для выделения возбудителя дифтерии лабораторного приготовления с добавлением нативной крови.
5. Сконструированные сухие питательные среды с использованием панкреатического гидролизата рыбной муки широко используются при контроле микробной загрязненности нестерильных лекарственных средств.
Апробация работы
Диссертация апробирована на межлабораторной научной конференции ФБУН ГНЦ ПМБ 5 октября 2012 г., протокол № 26 .
Результаты исследований доложены и обсуждены на Российских и международных научных конференциях: “Актуальные вопросы разработки препаратов медицинской биотехнологии“, 26-27 мая 1988 г., Махачкала; отраслевом совещании “Питательные среды в производстве бактерийных препаратов”, 3-4 октября 1989 г., Оболенск; «Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии» 1990 г., Махачкала; Всероссийской научно-практической конференции “Принципы и практика борьбы с холерой в Республике Дагестан. Актуальные вопросы разработки микробиологических питательных сред и тест-систем” 31 октября 1994 г., Махачкала; Всероссийской научно-практической конференции “Актуальные вопросы разработки и производства питательных сред по обеспечению санитарно-эпидемиологического благополучия населения России” с 31 мая по 5 июня 1999 г., Оболенск; Юбилейной научной конференции “Проблемы медицинской и экологической биотехнологии“ 14-15 декабря 1999 г., Оболенск; Международной научно-практической конференции “Актуальные вопросы разработки и производства диагностических питательных сред и тест – систем” 2001 г. Махачкала; 11-ом Московском международном Конгрессе “Биотехнология. Состояние и перспективы развития” 10-14 ноября 2003 г., Москва; VII Межгосударственной научно – практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств». Оболенск – 2006; XVI научно-практической конференции «Высокие технологии модернизация в лабораторной медицине» 30 марта 2011г., Москва.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 37 работ, в том числе 15 работ в рецензируемых изданиях и 6 патентов на изобретения РФ. Разработано и утверждено 40 регламентов производства и 40 технических условий, получено 37 регистрационных удостоверений. Результаты исследований отражены в 12 научно-исследовательских отчетах ГНЦ ПМ.
Структура и объем диссертации
Работа состоит из введения; обзора литературы; 7 глав собственных исследований; заключения; выводов и списка литературы.
Диссертация изложена на 225 страницах, содержит 61 таблицу и 17 рисунков. Список литературы включает 181 работу, в том числе 119 отечественных и 62 зарубежных авторов.
