Содержание к диссертации
Введение 5
Глава 1. Анализ существующих технологий получения 7-АЦК 10
1.1. Химические способы получения 7-АЦК 16
Гидролиз и подобные процессы 16
Реакция с нитрозилхлоридом 18
Реакция с тетрафторборатом триэтилоксония 20
Реакция с пятихлористым фосфором 20
При защищенной боковой аминогруппе и обеих карбоксигруп- 20 пах
При силильной защите реакционноспособных групп 24
При защите карбоксигрупп смешанными ангидридами 27
Через 7-тиоацилпроизводные цефалоспорина С 29
Сопоставление химических способов получения 7-АЦК 31
1.2. Энзиматические способы получения 7-АЦК 33
1.2.1. Одностадийное энзиматическое дезацилирование цефалоспорина 33
С
Поиск ферментов, способных дезацилировать цефалоспорин С 33
Цефалоспорин С-ацилаза Pseudomonas sp. SE-83 и ее мутанты 35
Цефалоспорин С-ацилаза Pseudomonas sp. N176 и ее мутанты 36
Природные цефалоспорин С-ацилазы других микроорганизмов 3 8
Условия проведения одностадийного энзиматического дезаци- 40 лирования цефалоспорина С и общая оценка цефалоспорин С-ацилаз
Лучшие мутантные цефалоспорин С-ацилазы 42
1.2.2, Окислительное дезаминирование цефалоспорина С — первая ста- 43
дия двухстадийного энзиматического дезацилирования
Действие оксидаз D-аминокислот на цефалоспорин С 43
Оксидаза D-аминокислот Trigonopsis variabilis 44
Получение оксидазы D-аминокислот Т. variabilis при помощи 50 рекомбинантных микроорганизмов
Оксидаза D-аминокислот Rhodotorula gracilis 53
Необычные гибридные оксидазы D-аминокислот 55
Оксидазы D-аминокислот из других источников 56
Химический способ дезаминирования цефалоспорина С 58
Определение активности оксидаз D-аминокислот 58
Условия проведения окислительного дезаминирования цефа- 59 лоспорина С
1.2.3. Энзиматическое дезацилирование глутарил-7-АЦК — вторая ста- 64
дия двухстадийного энзиматического дезацилирования
Назначение глутарилацилаз 64
Глутарилацилазы Pseudomonas sp. SY-77-1 и GK-16 64
Глутарилацияаза Pseudomonas sp. 130 67
Глутарилацилаза Pseudomonas dim inuta КАС-1 68
Глутарилацилазы других псевдомонад 69
Глутарилацилазы других микроорганизмов 72
Классификация цефалоспоринацилаз 74
Определение активности цефалоспоринацилаз 78
Условия проведения энзиматического дезацилирования глута- 79 рил-7-АЦК
1.2.4. Проведение обеих стадий трансформации цефалоспорина С в 82
7-АЦК
Проведение окислительного дезаминирования цефалоспорина С 82 и дезацилирования глутарил-7-АЦК в двух аппаратах
Проведение окислительного дезаминирования цефалоспорина С 84 и дезацилирования глутарил-7-АЦК в одном аппарате
1.2.5. Сопоставление энзиматических способов получения 7-АЦК 86
Сопоставление химического и энзиматического способов получе- 88 ния 7-АЦК
Выводы по главе 1 91
1.5. Постановка задач исследования 92
Глава 2. Объекты и методы исследования 93
Исследуемые материалы 93
Контрольно-аналитические методы 93 2.3 Химическая схема процесса 95
2.4. Условия проведения экспериментов 99
Методика лабораторного эксперимента 99
Методика опытно-промышленного эксперимента 104
Методика испытаний на пилотной установке 109
Кинетические расчеты 115
Выводы по главе 2 116 Глава 3. Результаты экспериментов и их обсуждение 118 3.1 Результаты экспериментов 118
Результаты лабораторных экспериментов 118
Результаты опытно-промышленных экспериментов 119
Результаты экспериментов на пилотной установке 120
3.2. Обсуждение результатов 120
Влияние начальной концентрации цефалоспорина С на протека- 120 ние процессов
Влияние рН на протекание процессов 122
Влияние температуры на протекание процессов 124
Влияние абсолютного давления кислорода на стадии окисления 125 на протекание процессов
3.3. Изучение кинетики энзиматических процессов 129
Кинетика процесса окисления 129
Кинетика процесса дезацилирования 134
Выбор условий осаждения 7-АЦК 139
Выводы по главе 3 141
Глава 4. Сравнительный анализ химической и энзиматической техноло- 143
гий получения 7-АЦК, в том числе по воздействию на окру
жающую среду
Сравнительный анализ химической и энзиматической технологий 143 получения 7-АЦК
Сопоставление техногенной нагрузки на атмосферу, гидросферу и 155 литосферу
4.3. Выводы по главе 4 159
Основные результаты и выводы 160
Литература 163
Приложение. Акт апробации технологии 210
Введение к работе
Актуальность работы. В ближайшие годы в мире ожидается рост производства продуктов биотехнологии. По оценке известной международной консалтинговой компании McKinsey & Company [1, 2] мировой объем продаж химических продуктов, полученных с использованием биотехнологических процессов, в 2000 г. составлял 53 млрд. евро (5 % всех химических продуктов), в 2005 г. - 77 млрд. евро (7 %), в 2007 г. — 99 млрд. евро (6 %), прогноз на 2010 г. - 125 млрд. евро, на 2012 г. - 153 млрд. евро (9-10 %).
Примерами наиболее массовых производств, в которых биокаталитические процессы заменяют или заменили химические, является получение следующих веществ [3]:
глюкоза, изоглюкоза, изомальтоза - моносахариды;
акриламид - мономер для полиакриламидных полимеров;
L-аспарагиновая кислота - аминокислота;
аспартам - подслащивающее вещество;
никотинамид — витамин РР;
пантотеновая кислота - витамин В6;
эфедрин - алкалоид;
6-аминопенициллановая кислота (6-АПК) - исходный полупродукт для синтеза полусинтетических пенициллинов;
7-аминоцефалоспорановая кислота (7-АЦК) - исходный полупродукт для синтеза полусинтетических цефалоспоринов.
Изучение технологии получения 7-АЦК является предметом данного диссертационного исследования. Мировое производство 7-АЦК в 2003 г. оценивалось в 4000 тонн в год [3], в 2006 г. в 5000 тонн в год [4].
Цефалоспориновые антибиотики, исходным сырьем для которых является 7-АЦК, широко применяются при лечении тяжелых инфекционных заболеваний, имеют широкий спектр действия, малотоксичны, хорошо переносятся. В 32 Фармакопее США (2009 г.) [5] описано 27 цефалоспоринов. В Реестре зарегистрированных лекарственных средств Российской Федерации в январе 2009 г. присутствовало 29 цефалоспоринов, из них разрешена продажа 14, а для 15 истек срок действия регистрации [6]. Общее число цефа-
лоспоринов в мире, разрешенных к применению или дошедших до последних стадий клинических испытаний, превышает 50 [7].
Объем продаж цефалоспоринов в 2005 г. оценивался в 9,7 млрд. долларов США (около 32 %) из около 30 млрд. долларов США мирового объема продаж антибиотиков [8], это первое место среди всех групп антибиотиков.
В России 7-АЦК не производят и поэтому закупают субстанции и готовые лекарственные формы цефалоспориновых антибиотиков за рубежом, что обуславливает их высокую стоимость и снижает лекарственную безопасность государства. В настоящее время производство цефалоспориновых антибиотиков в нашей стране признано приоритетным направлением. В связи с этим актуальным является проведение исследований по разработке оптимальной технологии получения 7-АЦК из цефалоспорина С с учетом новых, появившихся в последние годы знаний и достижений.
В специализированных научных учреждениях - Всесоюзном научно-исследовательском институте антибиотиков (ВНИИА), позже Государственном научном центре по антибиотикам (ГНЦА), и его Пензенском филиале (ПФ ВНИИА, ПФ ГНЦА), позже Пензенском научно-исследовательском и технологическом институте антибиотиков (ПНИТИА), начиная с 1981 г. по госзаказам № 103, 42-0263-02 и 140-187-БМ проводились исследования и разработка вначале химической, а затем энзиматической технологии промышленного получения 7-АЦК. После ликвидации ПНИТИА научно-исследовательская работа продолжена в Пензенской государственной технологической академии при поддержке РФФИ, гранты № 07-08-00557, 09-08-07049.
Актуальность указанной проблемы определила выбор направления исследования и основное содержание работы.
Цели и задачи исследований. Целью диссертационной работы являлась разработка биокаталитической технологии производства 7-АЦК для промышленного освоения на российских предприятиях.
Для реализации поставленной цели автором сформулированы и решены следующие задачи:
- проведен сравнительный анализ существующих за рубежом технологий синтеза 7-АЦК и выбраны наиболее перспективные;
на основе выбранных вариантов разработаны опытно-промышленные технологии получения 7-АЦК с учетом особенностей отечественного производства;
проведен сравнительный анализ воздействия этих опытно-промышленных технологий на окружающую среду;
предложена безопасная ресурсосберегающая биокаталитическая технология производства 7-АЦК для отечественных предприятий.
Научная новизна.
в соответствии с характеристиками ферментов для обеих энзиматиче-ских стадий синтеза 7-АЦК выбраны и обоснованы оптимальные условия проведения процессов: температура, рН и оптимальная начальная концентрация цефалоспорина С.
установлена зависимость протекания всех стадий процесса энзимати-ческого синтеза 7-АЦК от давления кислорода на первой стадии окислительного дезаминирования. Показано, что чем меньше давление кислорода, тем больше продолжительность процесса окисления, что приводит к уменьшению выхода глутарил-7-АЦК на этой стадии из-за гидролиза продуктов реакции. Установлено, что уменьшение выхода глутарил-7-АЦК на первой стадии приводит к уменьшению выходов на последующих стадиях дезацилиро-вания и осаждения.
предложены и подтверждены кинетические модели для обеих энзима-тических стадий синтеза 7-АЦК. Для стадии окисления это модель линейной зависимости скорости реакции от давления кислорода, причем константа скорости Кр зависит от условий массопередачи для данной системы. Для стадии дезацилирования - модель, использующая уравнение Михаэлиса-Ментен, в котором константы Vmax и Кт также зависят от условий массопередачи для данной системы.
установлено, что обе энзиматические стадии протекают в диффузионном режиме, поэтому при масштабировании этих процессов на стадии окисления необходимо достичь по возможности большего значения константы скорости Кр как характеристики массопередачи, а также определить предельное значение давления Рир, при котором скорость реакции перестает зависеть
от давления. На стадии дезацилирования необходимо достичь по возможности большего значения константы VmaK как характеристики массопередачи. Практическая значимость работы.
разработана опытно-промышленная биокаталитическая технология получения 7-АЦК из цефалоспорина С двухстадийным энзиматическим дезаци-лированием с использованием иммобилизованных ферментов, которую можно использовать как основу при организации промышленного производства 7-АЦК в Российской Федерации. Для данной технологии разработана нормативно-техническая документация для промышленного освоения 7-АЦК: опытно-промышленный регламент на получение 7-АЦК методом двухста-дийного энзиматического дезацилирования (ОПР 64-0263-55-2000); технические условия на 7-АЦК (ТУ 0263-15-2000) и решены вопросы регенерации органических растворителей и утилизации образующихся отходов. Предложенная технология апробирована на ОАО «Биосинтез» (г. Пенза) на пилотной установке.
проведен сравнительный анализ энзиматической технологии получения 7-АЦК и химической. Показано, что на 1 кг 7-АЦК при энзиматической технологии: суммарный расход реагентов в 7 раз меньше; расход питьевой воды в 11 раз меньше; выбросы в атмосферу в 24 раза меньше; количество сточных вод и отходов в 16 раз меньше, чем при химической технологии. При этом выход готового продукта при энзиматической технологии (79 %) больше, чем при химической (76 %).
даны рекомендации для масштабирования разработанных процессов в промышленном оборудовании.
На защиту выносятся.
технологические решения по условиям проведения процесса двухста-дийного энзиматического дезацилирования цефалоспорина С и осаждения целевого продукта;
установленные зависимости протекания всех стадий энзиматического синтеза 7-АЦК от давления кислорода на первой стадии окислительного де-заминирования;
кинетические модели для стадии окисления и стадии дезацилирования процесса синтеза 7-АЦК;
предложения по масштабированию разработанных процессов в промышленном оборудовании;
результаты сравнительного анализа воздействия на окружающую среду энзиматической и химической технологии получения 7-АЦК;
- опытно-промышленная биокаталитическая технология получения
7-АЦК двухстадийным энзиматическим дезацилированием с использованием
иммобилизованных ферментов.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на: Всесоюзной конференции «Биосинтез вторичных метаболитов» (Пу-щино, 1987); Всесоюзной конференции «Наука и производство в решении комплексной проблемы «Антибиотики» (Москва, 1989); IX Всесоюзном симпозиуме по целенаправленному изысканию лекарственных веществ (Юрмала, 1991); V Международной научно-практической конференции «Медицинская экология» (Пенза, 2006); III Всероссийской научно-практической конференции «Окружающая среда и здоровье» (Пенза, 2006); IX Международной научно-практической конференции «Экология и жизнь» (Пенза, 2006); I Международном конгрессе «Экология и безопасность жизнедеятельности про-мышленно-транспортных комплексов» (Тольятти, 2007); IV Всероссийской научно-практической конференции «Окружающая среда и здоровье» (Пенза, 2007); XXIII Международном симпозиуме «Новые технологии в образовании, науке и экономике» (Москва - Сидней, 2008); XXIV Международном симпозиуме «Новые технологии в образовании, науке и экономике» (Москва
- Сингапур, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 научных работ, в том числе 7 статей в журналах, рекомендуемых ВАК, и две монографии.
Автор выражает признательность всем сотрудниками ПНИТИА и ОАО «Биосинтез» (г. Пенза), которые работали вместе с ним при воспроизведении технологий на опытной и пилотной установках.
