Содержание к диссертации
Введение
Глава І.Обзор литературы 11
1. Новый этап развития вакцинологии 11
2. Методы получения вакцин
2.1. Методы получения и очистки вирусных вакцин 16
2.2. Методы получения очищенных полисахаридных вакцин ... 23
2.3. Культуральные вирусные вакцины 27
3. Система обеспечения качества - один из основных элементов GMP 31
3.1. Валидация аналитических методов 33
3.2. Проведение валидации 41
3.3. Показатели точности 47
3.4. Управление качеством 49
3.5. Стандартные образцы как средство метрологического обеспечения аналитических методов контроля медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП) 55
4. Методы контроля показателей качества МИБП химическими, физико-химическими и иммунохимическими методами: 62
5. Методы лабораторной диагностики вирусных гепатитов на основе амплификации нуклеиновых кислот 72
Глава 2. Материалы и методы исследования 84
Глава 3. Результаты и обсуяедение 98
3.1.Разработка методологии оценки валидационных характеристик стандартизованных химических и, иммунохимических методов контроля качества МИБП 98
1.1 . Определение белкового азота с реактивом Несслера . 98;
1.1.1. Разработка стандартного образца для контроля правильности определения белкового азота з
1.1.2.Оценка валидационных характеристик методики определения белкового азота 100
1.2. Определение Ви-антигена в брюшнотифозной вакцине «Вианвак» 125
1.2.1 .Аттестация ОСО содержания Ви-антигена 126
1.2.2. Валидация методики ракетного иммуноэлектрофореза (РИЭФ), применяемого для определения содержания Ви-антигена в брюшно тифозной вакцине «Вианвак» 134
3.2.Методология разработки новых химических и иммунохимическіїх методов контроля качества МИБП и оценки их валидационных характеристик 140
2.1. Определение гетерологичных примесей в МИБП 140
2.1.1. Модификация и валидация метода РИЭФ для определения бычьего сывороточного альбумина (БСА) в культуральных вирусных вакцинах 140
2.1.2. Разработка стандартного образца для определения содержания БСА методом РИЭФ 144
2.1.3. Модификация и валидация методики РИЭФ с применением сыворотки против белков сыворотки рогатого скота (СРС) 153
2.1.4. Валидация ИФА тест-системы для определенияБСА на примере «Immunoenzymetric Assay for the Measurement of BSA» («Cygnus Technologies, Inc.», США) 165
2.2. Определение консервантов в МИБП 187
2.2.1. Разработка и валидация методики определения содержания мертиолята в анатоксинах, вирусных и бактерийных вакцинах с помощью атомно-абсорбционного спектрометра KBAHT-Z.3TA... 188
2.2.2. Разработка и валидация методики, количественного определения хлороформа в антитоксических сыворотках 198
2.2.3. Изучение возможности применения методики определения фенола в МИБП с помощью газожидкостной хроматографии 205
3.3. Разработка стандартных образцов для химических и иммуно химических методов контроля качества МИБП 214
3.1.Разработка стандартного образца для определения содержания белка в препаратах иммуноглобулина 214
3.2. Разработка стандартных образцов для внутрилабораторного контроля качества аналитических работ при контроле МИБП
3.2.1. Разработка стандартного образца для калибрования хроматографической колонки при определении молекулярного состава иммуноглобулинов методом гель-фильтрации 1У
3.2.2. Разработка стандартных образцов и прецизионность комплексонометрического метода определения ионов алюминия 223
3.4.Валидация ПЦР тест-систем для количественного определения ДНК вируса гепатита В 228
4. 1.Разработка стандартного образца содержания ДНК гена HBsAg вируса гепатита В о
4.2. Валидация тест-системы «АмплиСенс HBV Монитор FRT»
(ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) для количественного определения ДНК вируса гепатита В с гибридизационно-флуоресцентной детекцией результатов амплификацииврежиме «реального времени».. 231
Заключение 241
Выводы 247
Список литературы
- Методы получения очищенных полисахаридных вакцин
- Управление качеством
- Определение белкового азота с реактивом Несслера
- Валидация ИФА тест-системы для определенияБСА на примере «Immunoenzymetric Assay for the Measurement of BSA» («Cygnus Technologies, Inc.», США)
Введение к работе
Актуальность проблемы
Широкое применение медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП), направленных на профилактику, лечение и диагностику инфекционных заболеваний, определяет повышенные требования к их эффективности и безопасности.
В современных условиях рынок иммунобиологических препаратов является международным, требования к их качеству регламентируются соответствующими международными правилами как на этапах лабораторных исследований - правила GLP (Good Laboratory Practice) и клинических испытаний - правила GCP (Good Clinical Practice), так и на этапе производства - правила GMP (Good Manufacturing Practice).
Соблюдение международных правил обязательно для всех стран входящих в мировую систему ВТО (Всемирная торговая организация). Россия предпринимает меры по вхождению в ВТО и, следовательно, требуется организация работ по выполнению требований GLP, GCP и GMP как со стороны разрабатывающих и выпускающих МИБП организаций, так и со стороны ГИСК имЛ.А.Тарасевича.
В Российской Федерации в этом плане достигнуты определенные позитивные сдвиги. Так, утвержден ГОСТ Р 52249-2004 «Правила производства и контроля лекарственных средств», положения которого гармонизированы с Руководством GMP, принятым в Европейском союзе. Выполнение этих стандартов гарантирует высокий уровень осуществляемых функций предприятием и контролирующими органами.
Правила GMP устанавливают требования к персоналу, помещениям, оборудованию, документации, производству продукции, проведению анализов, системе обеспечения и контроля качества и др.
Анализ современного состояния вопроса о контроле качества свидетельствует о том, что эта деятельность базируется на нескольких элементах, в том числе: методики, валидация, техническое обеспечение/оборудование, стандартные образцы, документирование, персонал.
В настоящее время в нашей стране проблемам обеспечения качества лабораторных исследований уделяется большое внимание, принята система мер по повышению качества лабораторных исследований в учреждениях здравоохранения и микробиологической промышленности.
Одним из основных элементов системы обеспечения качества является валидация - составляющая GMP, которая подтверждает, что поддерживающие системы, оборудование, процессы и методы контроля находятся на должном уровне, поэтому производится продукт, соответствующий требованиям нормативной документации (WHO TRS 822, ГОСТ Р 52249, СП 3.3.2.1288).
Аналитические методы позволяют судить об адекватности функционирования системы производства.
Валидация метода - это процесс установления пригодности метода или методики для оценки качества конкретной продукции в соответствии с требованиями нормативных документов (WHO 1999, ICH Q2A и Q2B, Eurachem 1998). Необходи-
мость валидации аналитических методов при контроле МИБП определена международными документами, рекомендациями Всемирной организации здравоохранения, а также отечественными нормативными документами.
В мировой практике разработка, промышленное освоение и методы контроля современных МИБП носят наукоемкий характер. Расширение номенклатуры МИБП, понимание механизмов иммунного ответа на молекулярном уровне, использование достижений генной инженерии требует разработки новых методов контроля или расширения области применения существующих, повышает требования к уровню их разработки, прежде всего, с учетом современных требований валидации. Данный подход широко используется в работе национальных органов контроля в странах с развитой экономикой - Великобритании, Германии, Голландии, США и др.
Применение валидированных и стандартизованных методов является одним из необходимых условий выполнения международных стандартов GLP, GCP и GMP в Российской Федерации, а также требований к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий. Однако в настоящее время применительно к контролю МИБП нет единого мнения, как устанавливать валидационные характеристики. Более того, понимание терминов еще не однозначно и окончательно не сложилось.
Контроль качества МИБП не может проводиться без стандартных образцов, которые используются и как мера сравнения, и для внутрилабораторного контроля качества работы аналитической лаборатории. В отсутствии эталонов порядок аттестации стандартных образцов становится не простой задачей, основой для создания стандартных образцов становится сама измерительная процедура. Аттестация должна проводиться валидированными методами, поскольку только при этом условии можно обеспечить корректное установление доверительного интервала для аттестованной характеристики стандартного образца и результата анализа, полученного при его использовании.
В связи с этим разработка методологии валидации и аттестации стандартных образцов МИБП, а также методических основ контроля качества МИБП с использованием современных химических, иммунохимических, молекулярно-биологических методов является актуальным.
Как известно, при разработке, производстве и контроле качества МИБП активно используются такие химические методы, как определение белка, консервантов, сорбента, иммунохимические методы, интенсивно разрабатываются и внедряются методы на основе амплификации ДНК. В связи с усовершенствованием приборной, реагентной базы возникает необходимость модернизации известных методов и разработки новых. С другой стороны, возрастающие научно-методические и технологические возможности конструирования новых МИБП, средств для генной терапии, в том числе получаемых с помощью методов современной биотехнологии и на-нотехнологии, остро ставят задачу совершенствования системы контроля медицинских препаратов. Поскольку эта проблема является многоплановой, т.к. включает научный, технологический, технический, человеческий факторы, то ее решение может быть постепенным. С нашей точки зрения, в первую очередь внимание должно
быть направлено на методики, их валидацию, внедрение и создание стандартных образцов. Одновременно такие исследования в большой степени помогли бы сформировать новое поколение специалистов, востребованных в сфере разработки, производства и контроля качества МИБП.
В связи с этим цель работы состояла в создании методологической базы контроля качества МИБП как основного элемента системы контроля качества данных препаратов.
Цель исследования
Создание методологической базы системы контроля качества МИБП на модели химических и иммунохимических методов.
Задачи исследования
Разработка методологии валидации стандартизованных (определение
белкового азота с реактивом Несслера и Ви-антигена методом РИЭФ) и вновь разра
батываемых методов контроля МИБП на примере определения БСА методом РИЭФ
и ИФА, мертиолята атомно-абсорбционной спектрометрией, хлороформа колори
метрическим методом, фенола методом ГЖХ.
Разработка стандартных образцов для определения показателей качества МИБП - содержания Ви-антигена, белка, БСА.
Создание стандартных образцов для оценки работы лабораторий по контролю качества МИБП ГИСК имЛА.Тарасевича и предприятий-изготовителей МИБП на примере стандартных образцов содержания белкового азота, алюминия, мертиолята, молекулярного состава препаратов иммуноглобулинов. .„
Валидация ПЦР тест-систем на примере набора реагентов «АмплиСенс HBV Монитор FRT» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора РФ) для количественного определения ДНК вируса гепатита В в плазме крови человека.
Научная новизна исследования.
Впервые в отечественной практике разработана методология валидации стандартизованных и вновь разрабатываемых химических методов контроля МИБП. Установленные с использованием данного подхода показатели точности методик позволяют использовать научно обоснованные критерии для сравнения результатов контроля в ГИСК им. Л.А.Тарасевича и на предприятиях-изготовителях МИБП.
Впервые показана значимость предложенной методологии валидации химических методов контроля для стандартизации контроля количественных ПЦР тест-систем.
Впервые в области контроля МИБП внедрены стандартные образцы для оценки правильности определения белкового азота в очищенных анатоксинах, вакцинах, аллергенах, а также мертиолята и алюминия в сорбированных препаратах; показана целесообразность применения стандартных образцов для оценки соответствующих анализов в .межлабораторных испытаниях.
Разработаны стандартные образцы как мера сравнения для определения специфически активного компонента (Ви-антигена, белка в иммуноглобулинах), приме-
си (БСА), стандартный образец для калибрования хроматографической системы при определении показателя «молекулярные параметры» в иммуноглобулинах.
Разработаны с учетом требований валидации методики количественного определения БСА методом РИЭФ, мертиолята с помощью отечественного атомно-абсорбционного спектрометра KBAHT-Z.3TA, хлороформа по цветной реакции с резорцином, использующиеся при контроле МИБП.
Теоретическая значимость работы.
Теоретическая значимость работы определяется формированием научных основ методологии валидации химических и иммунохимических методов, использующихся в системе контроля качества МИБП, что необходимо для осуществления статистического подхода к контролю качества.
Практическая значимость работы
Практическая значимость работы определяется внедрением системы контроля качества МИБП на основе использования стандартных образцов и химических и иммунохимических методик с установленными валидационными характеристиками в ГИСК им.Л.А.Тарасевича и на предприятиях-изготовителях МИБП.
Использование аттестованных образцов позволило стандартизовать условия проведения соответствующих анализов при контроле МИБП (определение Ви-антигена в брюшнотифозной вакцине, белкового азота, мертиолята и алюминия в полуфабрикатах и готовой продукции анатоксинов и вакцин, БСА в культуральных вирусных вакцинах, белка и молекулярных параметров в препаратах иммуноглобулинов, аналитической чувствительности ПЦР тест-систем для выявления ДНК вируса гепатита В) на предприятиях по производству МИБП и ГИСК им. ЛА.Тарасевича и получать объективные данные.
Применение разработанных и охарактеризованных на основе проведенной валидации химических и иммунохимических методик контроля качества МИБП позволило унифицировать определение БСА, мертиолята и хлороформа, а также использовать обоснованные критерии для сравнения результатов контроля в ГИСК им. Л.А.Тарасевича и на предприятиях-изготовителях МИБП при определении белкового азота, мертиолята, алюминия, БСА, белка с биуретовым реактивом.
Внедрение в практику результатов работы
ОСО содержания Ви-антигена (ОСО 42-28-383-2005) используется при контроле качества брюшнотифозной вакцины «Вианвак» (ФСП 42-0112-0274-05).
ОСО содержания белка в иммуноглобулинах (ОСО 42-28-340-08П) и ОСО для калибрования хроматографической колонки (ОСО 42-28-301-06П) используются при контроле зарубежных и выпускаемых в Российской Федерации препаратов иммуноглобулинов (ФСП 42-0504-6733-05, ФСП 42-0504-6732-05 и др.).
ОСО содержания БСА (ОСО 42-28-328-07) используется при контроле качества культуральных вирусных вакцин: герпетических (ФСП 42-0107-4707-03, ФСП 42-0022-3841-03), антирабических (ФСП 42-4046-07, ФСП 42- 0504- 7029-05), вакцины против клещевого энцефалита (ФСП 42-0070-5497-04), вакцины гепатита А (ФСП 42-0168-0478-06).
ОСО содержания белкового азота (ОСО 42-28-322-06П) используется для контроля правильности проведения анализа в полуфабрикатах анатоксинов и вакцин; в неинфекционных аллергенах (ФСП 42-0504-3763-04, ФСП 42-0504-3762-04, ФСП 42-0504-3764-04, ФСП 42-0010-1828-01, ФСП 42-0010-1739-01 и др.) используется ОСО содержания белкового азота ОСО 42-28-303-04.
ОСО содержания мертиолята (ОСО 42-28-334-09П, ОСО 42-28-334а-9П) и ОСО содержания алюминия (ОСО 42-28-ЗЗЗа-09П и ОСО 42-28-333-09П) используются для контроля правильности проведения соответствующих анализов в сорбированных препаратах (анатоксины и АКДС вакцины по ФСП 42-0504-5805-04, ФСП 42-0504-5804-04, ФСП 42-0504-4423-04, ФСП 42-0504-4424-04; ФСП 42-0010-4377-03, ФСП 42-0010-4375-03, ФСП 42-0010-4376-03; вакцины гепатита В по ФСП PN000738/01-191107, ФСП 42-0505-5653-0 и др.).
ОСО содержания ДНК гена HBsAg вируса гепатита В (ОСО 42-28-332-2007П) используется при контроле ПЦР тест-систем для выявления данного возбудителя в плазме и сыворотке крови человека (ФСР 2007/00584, ФСР 2007/00585, ФСР 2007/00586, ФСР 2007/00813).
Разработанные ОСО внесены в Реестр Национальных стандартов МИБП.
Определение БСА методом ракетного иммуноэлектрофореза включено в МУК 4.1/4.2.588-96, ФС 42-3874-99 «Физико-химические, химические, физические и иммунохимические методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов» и проект общей фармакопейной статьи в ГФ XII (том 3), введено в НД на 6 культуральных вирусных вакцин на пяти производствах. Валидированная ИФА тест-система для определения БСА введена в НД на 3 живые культуральные вирусные вакцины (ФСП 42-0504-7362-06, ФСП 42-2975 -07, ФСП 42-0504-0988-07, ФСП 42-0504-0368-07). Колориметрический метод определения хлороформа введен в НД на 5 наименований антитоксических сывороток на трех производствах (ФСП 42-0504-6761-05, ФСП 42-0504-6561-05, ФСП 42-0504-5438-04, ФСП 42-0504-0745-05, ФСП 42-0504-3277-04).
Определение мертиолята с помощью атомно-абсорбционного спектрометра KBAHT-Z.3TA включено в проект общей фармакопейной статьи для ГФХП (том 3) и используется при контроле мертиолята в МИБП в ГИСК им.Л.А.Тарасевича.
На основе материалов диссертации разработаны Методические указания 3.3.2.1886-04 «Валидация методов контроля химических и физико-химических показателей качества МИБП: организация, порядок проведения и представления результатов», М.,2004, а также проект общей фармакопейной статьи по валидации методов для ГФ XII. Материалы диссертации включены в лекции на ежегодном семинаре ГИСК им. Л.А.Тарасевича по GMP для сотрудников предприятий-изготовителей МИБП и использованы на обучающем семинаре ВОЗ по системе регулирования вакцин для Национальных органов контроля стран СНГ (г.Алма-Ата, 2008 г.).
Совокупность новых научных результатов, выносимых на защиту
1. Разработанная методология валидации химических методов контроля качества МИБП позволяет в соответствии с современными международными требова-
ниями оценить прецизионность, диапазон линейности и пределы определения стандартизованных и вновь разрабатываемых химических, иммунохимических, мо-лекулярно-биологических методов при количественном определении специфически активного компонента, консервантов и примесей.
-
Разработанные на основе методологии валидации методы оценки качества МИБП по содержанию Ви-антигена, БСА, хлороформа, мертиолята обеспечивают достоверность и воспроизводимость контроля МИБП в ГИСК и на предприятиях-изготовителях МИБП.
-
Разработанные ОСО содержания Ви-антигена, белка, БСА позволяют стандартизовать методы контроля специфически активного компонента и гетерологичных примесей МИБП.
-
Разработанные ОСО содержания белкового азота, ОСО содержания мертиолята и ОСО содержания алюминия позволяют проводить оценку стабильности результатов аналитической лаборатории при контроле данных показателей, а также проводить оценку работы аналитических лабораторий в межлабораторных испытаниях.
Личный вклад автора
Основные результаты получены в лаборатории биохимии и биотехнологии ГИСК им.Л.А.Тарасевича самостоятельно и под руководством автора в рамках исследований в соответствии с основными планами научных исследований ГИСК им.Л.А.Тарасевича -договора №№ 737/089/024 и 034/089/009 с Минздравом России - Отраслевая научно-исследовательская программа «Эпидемиология и микробиология» и договор с Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека № 73-Д в рамках отраслевой научно-исследовательской программы «Научные аспекты обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия в Российской Федерации на 2006-2010 годы».
Апробация материалов диссертации
Диссертация апробирована на заседании Ученого совета ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора - протокол № 9 от 23 июня 2009 г. Основные экспериментальные материалы и положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на VII и VIII съездах Всероссийского общества эпидемиологов и паразитологов, Москва, 1997, 2002 гг.; Всероссийских научно-практических конференциях «Генодиагностика в современной медицине», Москва, 2000, 2002, 2007 гг.; Всероссийских конференциях по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций», Москва, 2004, 2006, 2008 гг.; Второй международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», Москва, 2005 г.; конференции «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний», Нижний Новгород, 2006 г.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 36 научных работ, в статьях -18 (в том числе 8 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 10 - в периодических издани-
ях), в материалах всероссийских и международных конференций - 14, Общая Фармакопейная статья - 1, методических указаний, утвержденых МЗ РФ - 1, методических рекомендаций, утвержденых Роспотребнадзором РФ - 1, утвержденных ГИСК им.Л.А.Тарасевича -1.
Объем и структура диссертации
Методы получения очищенных полисахаридных вакцин
Вакцины представляют собой единственный эффективный и наиболее экономичный способ противостояния инфекционным болезням [55,112].
В настоящее время используются более 15 бактерийных вакцин и практически столько же вирусных вакцин, из них 11 вакцин включены в календарь прививок, что означает массовую иммунизацию этими вакцинами детей практически во всем мире и делает управляемыми соответствующие инфекции. Это привело к практической элиминации и/или контролю таких заболеваний как оспа, полиомиелит, корь, паротит, краснуха, коклюш, столбняк, дифтерия, Haemophilus influenzae тип В [55].
В 19 и 20 столетии использовали разные технологии: разработаны живые вакцины (на основе возбудителя с ослабленной вирулентностью), инак-тивированные или убитые вакцины (нагреванием, химическими агентами, УФ-облучением или сочетанием факторов), а также инактивированные вакцины разной степени очистки.
В 21 веке продолжится совершенствование существующих технологий, что позволит получать более очищенные, а следовательно, более безопасные препараты, однако можно ожидать, что, благодаря технологиям, разработанным на основе более глубокого понимания механизма иммунного ответа, появятся новые возможности [140,171,184,221,229]. Можно ожидать успехов в разработке вакцин против инфекционных болезней, вызываемых такими возбудителями как ВИЧ , цитомегаловирусы, вирус тяжелого острого респираторного синдрома, бактерии; Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium tuberculosis, возбудителями паразитарных заболеваний. С этим же подходом связаны надежды в лечении неинфекционных заболеваний: аутоиммунных, опухолевых, болезни Альцгеймера, и даже разработка препаратов, которые пока непривычно называть вакцинами: для борьбы с вредными привычками, например, курением [224,246,255].
Достижения биотехнологии, генной инженерии, иммунологии позволили выделить самостоятельную науку — вакцинологию, которая основывается на изучении физико-химических свойств и структуры специфически активных компонентов и молекулярно-генетичеких аспектов иммунного ответа с помощью современных методов, в том числе биоинформатики, использующей для прогнозирования результатов компьютерные возможности [99,130].
Более глубокое понимание механизма иммунного ответа в сочетании с успехами молекулярной биотехнологирі, применение достижений геномики, протеомики и структурной биологии - основа для разработок нового поколения медицинских иммунобиологических препаратов и прежде всего вакцин. Знание генетической последовательности микроорганизмов позволяет предсказать соответствующие иммуногены и использовать их для приготовления вакцин, по существу это новая - обратная вакцинология [175,206]. По этому принципу разработана новая менингококковая вакцина типа В [220,252]. Исходя из генетической последовательности возбудителя, были идентифицированы потенциальные иммуногены клеточной поверхности, гены этих белков были клонированы, экспрессированные белки были выделены в количестве, достаточном для иммунизации животных, и показано, что два белка внешней мембраны обладают протективной активностью [157].
Применение адъювантов. Современное понимание механизмов активации и регулирования дендритных клеток (ДК), Т-клеток и других антиген-презентирующих клеток способствует разработке и использованию новых адъювантов, цитокинов, хемокинов и костимулирующих молекул для усиления иммуногенности, развития памяти и направленного типа иммунного ответа. Адъюванты — это усилители иммуногенности вакцин, они содействуют захвату, доставке иммуногена для инициации иммунного ответа [94,122,131,151,212,225]. Природные адъюванты включают лиганды Toll-like receptors (TLR) [207], цитокины и хемокины, продуцируемые в ответ на естественную стимуляцию. Искусственные адъюванты усиливают иммуноген-ность антигенов за счет активации цитокинового ответа, сходного с TLR активацией ДК, или содействуя эндоцитозу иммуногена. Идеальный адъювант помогает более естественному иммунному ответу на меньшее количество иммуногена. Широко распространенный, хотя и не идеальный, адъювант для вакцин, это адъювант на основе алюминия [107,260]. Этот адъювант по существу является сорбентом для вакцин, что способствует захвату иммуногена, однако слабо активирует ДК и не индуцирует продукцию ИЛ 12. В результате вакцины с таким адъювантом инициируют только Th2 антительный ответ.
Очень сильным адъювантом является полный адъювант Фрейнда (ПАФ), в состав которого входят инактивированные палочки Кальметта-Герейна и смесь различных лигандов TLR в минеральном масле. Эмульгирование иммуногена в минеральном масле создает депо для медленного освобождения антигена, содействуя фагоцитозу, а БЦЖ является сильным активатором ДК и ТЫ ответа. Однако из-за высокой реактогенности ПАФ не разрешен для применения на людях.
Поиску новых и безопасных адъювантов всегда уделялось большое внимание. В настоящее время разрешены к применению в вакцинах для людей или для испытаний в составе вакцин для людей следующие адъюванты: - Монофосфорил липид A (MPL), включает эндотоксинподобный ком-понент бактериального липополисахарида [253]; - Монтанид ISA51 (Seppic), состоит из хорошо охарактеризованной смеси маслоподобных компонентов ПАФ без БЦЖ [170]; - MF59, состоит из сквалена в составе маслянойи водной эмульсии; - QS21 и другие производные сапонинов используются в качестве адъювантов, индуцирующих ТЫ ответ [96].
Эти адъюванты, обладая некоторыми активностями ПАФ, менее токсичны. Комбинирование адъювантов на основе алюминия с такими адъюван-тами как MF59, QS21, MPL может усиливать иммуногенность вакцин, так комбинирование с MPL (AS04) было использовано для вакцины на основе вирусоподобных частиц вируса папилломы человека [141,142] и субъединичной вакцины на основе гликопротеина Д вируса простого герпеса [245], которые в настоящее время зарегистрированы во многих странах. Комбинирование с более жесткими MPL (AS01, AS02) использовано для вакцин против гепатита В и ВИЧ [257], которые находятся на разных стадиях клинических испытаний.
Применение конъюгации с белками. Иммуногенность небольших пептидов можно повысить, присоединив их к более крупным белкам. Однако это приводит к образованию дополнительных эпитопов, а к интересующему антигену развивается Th2 антительный ответ. В настоящее время используется новый подход - на основе взаимодействия пептидов с молекулами МНС, Т-клетками и ДК.
LEAPS (ligand epitop antigen presentation system) - технология превращения небольших эпитопсодержащих пептидов в иммуногены [274], позволяющая предсказать тип иммунного ответа, Thl или ТЪ2, который будет развиваться на такую вакцину. LEAPS использует небольшие пептиды (18-20 аминокислот), полученные из молекул МНС-1 или МНС-П-класса или из других молекул, которые являются лигандами, обеспечивающими связывание иммунных клеток (ICBL), что облегчает взаимодействие иммуногена с молекулами МНЄ и рецептором Т-клеток. ICBL ковалентно связывают с эпи-топсодержащим пептидом через триглициновый линкер. G ICBL - 15 аминокислотный пептид из молекул MHG-П-класса, способствующий Th2 ответу на прикрепленный к нему пептид. J ICBL - 13 аминокислотный пептид из бета-2-микроглобулина, позволяющий индуцировать ТЫ ответ. На J и G ICBL пептиды, в отличие от крупных носителей, иммунный ответ не развивается. На основе этой технологии были приготовлены вакцины против M.tuberculosis, плазмодия, вируса простого герпеса (144,145,191,228).
Управление качеством
При выделении биологически активных веществ бактериального происхождения также получили широкое распространение современные физико-химические, молекулярно-биологические и иммунохимические методы исследования. Широко используются приборы для колоночной хроматографии, ультра- и диафильтрации.
Для получения индивидуальных антигенов на первых этапах используют традиционные методы, такие как: высаливание, осаждение кислотами, спиртом, ацетоном. Дальнейшая очистка осуществляется методами гель-фильтрации или ионообменной хроматографии. С целью выделения специфических антигенов достаточно широко используются методы аффинной хроматографии: При исследовании субклеточных структур используют высокоскоростное центрифугирование.
Наиболее очищенными являются полисахаридные вакцины. Полисахариды в качестве антигенов относятся к тимуснезависимым антигенам [205]. Антигены этой группы характеризуются многократным повторением структурно идентичных эпитопов. Подобное повторяющееся расположение антигенных детерминант приводит к многоточечному взаимодействию с В-клеткой, что и обеспечивает полноценное развитие этих клеток до зрелых, продуцирующих антитела плазмоцитов [11]. Иммуногенность полисахаридных антигенов растет с повышением молекулярной массы.молекулы.
Полисахаридные вакцины являются безопасным типом, вакцинных препаратов. Очищенный ПС не токсичен и, в отличие от очищенного белкового препарата, обладает минимальными аллергизирующими свойствами [234].
Одними из первых были разработаны менингококковые вакцины [85,86,149]. Химическая природа менингококковых полисахаридов детально изучена. С помощью метода ядерномагнитного резонанса (ЯМР) в сочетании с химическими методами анализа удалось определить состав полисахарида, порядок расположения мономеров в цепи, положение связи, тип и конфигурации связи, локализацию о-ацетильных групп [166].
Основу стандартизации менингококковых вакцин составляет характеристика химического состава и молекулярных параметров. При этом химические показатели позволяют оценить степень очистки, а молекулярные параметры дают информацию о степени полимерности, коррелирующей с иммунологической активностью препарата. Отечественные менингококковые вакцины ( А и С) соответствуют требованиям ВОЗ [48].
В настоящее время используются конъюгированные с белком менингококковые вакцины, что позволяет получить более полный иммунный ответ [268].
Особую проблему представляет собой разработка вакцин против менингококка1 серогруппы В [192,194,167]. Полисахарид данного возбудителя (В-ПС) не вызывает иммунного ответа ни у взрослых, ни у детей. Это объясняется иммунологической толерантностью людей к этому антигену, обусловленной с одной стороны полным химическим сходством В-ПС со структурой ПС E.coli KI, постоянно обитающей в кишечнике человека, с другой стороны - сходством его со структурой ганглиозидов мозга. Многочисленные попытки создания вакцины на основе белков менингококка В оказались неудачными. Однако перспективным оказалось направление, связанное с разработкой вакцины на основе генноинженерных пептидов; представляющих собой активные эпитопы белков» внешней-мембраны менингококка. Ъ [220Д57].
Интенсивно разрабатываются полисахаридные вакцины против пневмококка [108,124,138,139,177,263], а также Я. Influenza тип b [169,188, 215,258]. Вакцины против брюшного тифа. Бактериальные кишечные инфекции, вызываемые многочисленными представителями семейства Enterobacteriaceae, ответственны за рост заболеваемости и смертности от инфекционных заболеваний. Среди наиболее эпидемиологически значимых кишечных инфекционных заболеваний следует отметить брюшной тиф. Несмотря на широкое применение антибиотикотерапии, брюшной тиф остается опасной инфекцией с высоким уровнем летальности [211].
Несмотря на то, что вакцины против кишечных инфекций являются проблемной областью иммунопрофилактики [164,182], вакцинация против брюшного тифа уже в XIX веке была одним из элементов профилактики бактериальных кишечных инфекций. Применение убитой цельноклеточной брюшнотифозной вакциной в сочетании с улучшением санитарно-гигиенических стандартов жизни привела к существенному снижению случаев брюшного тифа в промышленно-развитых странах во второй половине XX века [132]. Однако главным недостатком подобных вакцин, а также разработанных позднее субклеточных «химических» вакцин, является их высокая реактогенность [227].
К концу XX века встает вопрос о необходимости создания эффективной и безопасной брюшнотифозной вакцины нового поколения [97]. Перспективу для разработки такой вакцины открыли серьезные достижения в области создания бактериальных полисахаридных вакцин [4,81].
Высокомолекулярные фракции капсульного антигена S.enterica cv typhi индуцируют более интенсивный иммунный ответ по сравнению с низкомолекулярными полисахаридами [4,81]. Молекулярная масса капсульных вакцинных ПС достигает 10 000 KD.
Опасность представляет частичная деполимеризация молекул ПС. Фармакопейные требования ограничивают содержание низкомолекулярных фракций в вакцинном препарате, регламентируя выход не менее 50% вещества до Kd=0,25.
Определение белкового азота с реактивом Несслера
Оценка показателей точности метода - правильности и прецизионности является с организационной точки зрения наиболее сложной.
Как уже указывалось, термин «правильность» характеризует степень близости среднего арифметического значения большого числа результатов измерений к условно истинному или опорному значению, термин «прецизионность» - степень близости результатов измерений друг другу.
Необходимость рассмотрения «прецизионности» возникает из-за того, что измерения, выполняемые на предположительно идентичных материалах при предположительно идентичных обстоятельствах, не дают, как правило, идентичных результатов. Это объясняется неизбежными случайными ошибками, присущими каждой измерительной процедуре. Эта изменчивость должна устанавливаться при оценке валидационных характеристик методики и учитываться при практической интерпретации результатов измерений и установлении требований показателям:
Условия, которые: могут оказывать влияние на результаты испытаний, это все перечисленные выше источники неопределенности;, из которых можно выделить те, которые рассматривают чаще всего: исполнитель; оборудование; техническое состояние испытательного оборудования; градуировка оборудования; условия окружающей среды (температура, влажность, запыленность и т.д.); интервал времени между проводимыми испытаниями. При проведении испытаний в разных лабораториях все указанные факторы «различаются: Изменчивость результатов; испытаний; полученных.различными;исполнителями или на; разном оборудовании, всегда выше, чем при работе одного исполнителя-на;одномі оборудовании. Аналогично,.для; одного исполнителя изменчивость результатов; полученных через продолжительные: интервалы времени, выше, чем в короткие интервалы времени.
Количественной формой выражения прецизионности методов испытаний, как уже говорилось, являются повторяемость и воспроизводимость. В условиях повторяемости вышеуказанные факторы практически не меняются и вносят минимальный вклад в изменчивость результатов. В условиях воспроизводимости эти факторы вносят заметный вклад в изменчивость результатов испытаний. Т.о., повторяемость и воспроизводимость представляют собой две крайние формы выражения прецизионности. Для того, чтобы различать изменчивость при изменении указанных факторов в разных лабораториях и в одной лаборатории, для последней введено понятие «промежуточная прецизионность», которую часто называют «промежуточная воспроизводимость» или «внутрилабораторная воспроизводимость».
Правильность метода измерений имеет смысл в случаях, когда можно прямо или косвенно представить истинное значение измеряемой величины. Как и при любых измерениях не связанных с эталонами, при измерениях с участием химических и биологических объектов истинное значение не может быть известно точно, поэтому следует говорить об условно истинном или опорном значении. Располагать принятым опорным значением измеряемой величины- возможно, например, когда имеются в наличии стандартные образцы [23].
В условиях отсутствия необходимых эталонов, обеспечивающих воспроизведение, хранение и передачу соответствующих значений единиц величин и в отечественной, и в международной практике за действительное значение зачастую принимают общее среднее значение (математическое ожидание). В ГОСТ ИСО 5725 это отражено в-термине «принятое опорное значение» (accepted, reference value)- значение, которое служит в качестве согласованного для сравнения и получено как: - теоретическое или установленное значение, базирующееся на научных принципах; - приписанное или аттестованное значение, базирующееся на экспериментальных работах какой-либо национальной или международной организации; - согласованное или аттестованное значение, базирующееся на совместных экспериментальных работах под руководством научной или инженерной группы; - математическое ожидание измеряемой характеристики, то есть среднее значение заданной совокупности результатов измерений в отсутствии возможности первых трех вариантов.
Результаты анализов должны отвечать двум требованиям: соответствовать условно истинному (опорному) значению и иметь удовлетворительную воспроизводимость (малый разброс результатов). Воспроизводимость зависит от случайной ошибки метода, чем она меньше, тем выше точность. Отклонения от опорного значения, т.е. правильность, определяются систематической ошибкой (правильность), которая должна быть охарактеризована.
При контроле МИБП среди основных причин разброса результатов необходимо указать неполное представление об измеряемой величине, неоднородность. анализируемого; материала, ошибки пробоотбора и пробоподго-товки, химические превращения, протекающие при;проведении анализа (ограниченность и равновесность химических процессов). 3L41 Управление качеством
Выпуск качественной продукции, т.е. продукции, отвечающей определенным требованиям и своему назначению - главная задача производства. За прошедшие 100 лет изменилось представление о том, что такое качественная продукция. В; начале 20 столетия качество характеризовалось как соответствие продукции: требованиям: определенных стандартов достаточно- было приемочного контроля. К 50-м годам прошлого векш формируется система: сертификации продукции;и концепция!качества как комплексная проблема; К 80-м -годаМ это дополняется оценкойґусловийшроизводства продукции и его-сертификацией:. В! эти же годы, внедряются стандарты- системы качества; (стандарты И0 серии 9000), на основе которых была сформирована концепция управления качеством и соответственно сертификация систем менеджмента качества. Благодаря этому в 90-е годы формируется всеобщее управление качеством [6]. Таким образом, представление о качестве прошло путь от приемочного контроля к сертификации продукции, затем производства в целом и, наконец, к сертификации системы менеджмента качества, т.е. от контроля к обеспечению качества.
Важным техническим и экономическим показателем становится процент брака, поскольку цена брака переносится на качественную продукцию. Анализ причин брака потребовал использования статистических методов, так как по образному выражению Деминга «Не существует точных значений; не существует истинных значений ни для чего на свете ... среднее процесса будет зависеть от метода, каким берутся выборочные партии, а также от метода испытаний и установленных критериев. Измените метод взятия выборок или метод испытаний, и вы получите новое число дефектов в данной партии и новое среднее процесса. Таким образом, не существует истинного значения для числа дефектных изделий в заданной партии и не существует истинного значения для среднего процесса» [35].
Валидация ИФА тест-системы для определенияБСА на примере «Immunoenzymetric Assay for the Measurement of BSA» («Cygnus Technologies, Inc.», США)
Гибридизационно-ферментные методы детекции основаны на использовании меченых компонентов реакции и иммуноферментном выявлении продуктов амплификации. Для этого применяют праймеры, меченные био-тином, соответственно меченным оказывается и продукт реакции амплификации - ампликон. Данный метод детекции дает оценку анализа в виде значений оптической плотности, что позволяет использовать его для количественного определения ДНК или РНК.
В настоящее время широко используется технология ПЦР в реальном времени (Realime PCR) [110,129,199]. Ее принципиальной особенностью является мониторинг накопления флуоресцирующих продуктов полимераз-ной цепной реакции, автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов с помощью специального прибора. Кинетика накопления продуктов амплификации связана с исходным количеством матрицы, что делает возможным оценить ее количество в образцах [156].
Различают два основных принципа детекции накопления продуктов амплификации:
1. Применение интеркалирующих флуоресцентных агентов (этидия бромид и SYBR Green), флуоресценция которых значительно возрастает при связывании с двуцепочной ДІЖ. В качестве интеркалирующего красителя наиболее часто используют SYBR Green. Для получения корректных результатов при его использовании необходимо проводить дополнительный анализ при помощи построения так называемых «кривых плавления».
2. Использование меченых флуоресцентными агентами олигонуклео-тидных проб, комплементарных участку PGR-продукта (технологии TaqMan, Molecular Beacons и LightGycler).
Технология TaqMan основана на использовании 5 -экзонуклеазной активности полимеразы. В реакционную смесь добавляют ДНК-зонды, меченные на 5 -конце флуоресцентным красителем, а на З -конце — фосфатной группой и гасителем флуоресценции. Зонды комплементарны участку ам-плифицируемой области. Гаситель поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение, а фосфатная группа в З -положении блокирует полимера-зу. При отжиге праймеров проба количественно связывается с комплементарным участком ДНК-зондов. Во время стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и, дойдя до участка, гибридизованно-го с пробой, начинает расщеплять пробу за счет 5 -экзонуклеазной активности. В результате флуоресцентная метка отделяется от гасителя, и ее свечение может быть зарегистрировано. Таким образом, увеличение флуоресценции пропорционально количеству PCR-продукта [156].
Технология Molecular Beacons (зонды с комплементарными концевыми последовательностями) отличается от TaqMan тем, что концы пробы (на которых находятся соответственно метка и тушитель флуоресценции) комплементарны друг другу. В результате, при температуре отжига праймеров они образуют структуру типа "ручки сковородки", где зона комплементар-ности пробы, с матрицей находится в петле. При гибридизации пробы с матрицей вторичная структура-разрушается, флуоресцентная метка и тушитель расходятся в разные стороны, и флуоресценция от метки может быть зарегистрирована [105,254].
Технология LightCycler assay (применение 2-х зондов с резонансным переносом энергии). В этой методике используют два зонда, меченых флуоресцентной меткой. Принцип метода заключается в.переносе энергии от одного флуорофора, находящегося на З -конце первого зонда, ко второму флуорофору, находящемуся на 5 - конце второго зонда, который происходит в том, случае, когда расстояние между флуорофорами составляет 1-3 нук-леотида. При одновременном, связывании обоих зондов с ДНК матрицей испускаемое первым, флуорофором излучение передается на второй флуо-рофор, а его излучение детектируется прибором [195].
Выявление ДНК вирусагепатитаВ в крови; плазме, сыворотке;, Выявление ДНК HBV в крови имеет важное значение для прогноза острого ВГВ. Установлено, что выявление ДНК HBV более 8 недель после начала заболевания указывает на хронизацию процесса, тогда как эли 81 минация ДНК вируса в течение первых 2 недель болезни коррелирует с полным выздоровлением. Для выявления ДНК ВГВ применяют такие методы как ДНК-гибридизационный захват (препарат производства фирмы Dia-gene), гибридизация с использованием разветвленных зондов (препарат «Quantiplex HBV» фирмы Bayer Diagnostics и фирмы Chiron) [183], лигазная цепная реакция (препарат фирмы «ABBOTT») [92,173], метод транскрипци-онно-опосредованной амплификации, метод НИР in situ [172]. Но все эти методы обладают достаточно низкой чувствительностью от 5x103 - 105 копий/мл. В настоящее время для диагностики ВГВ наиболее широкое применение нашел метод полимеразной цепной реакции, как качественный вариант, так и количественный с грибридизационно-ферментной детекцией и в формате «Realime», существует широкий спектр диагностических препаратов для выявления ДНК ВГВ, основанных на вышеперечисленных методах. Это препараты для выявления ДНК ВГВ фирмы Roche «HBV-Amplicor», препараты-отечественного производства ФГУН ЦНИИЭ Роспот-ребнадзора, ООО Медицинский центр «Авиценна», ЗАО «Лагис», ЗАО «Вектор-Бест», «ДНК технология» с электрофоретическим методом детекции продуктов амплификации в агарозном геле. Чувствительность данных методов - 5x1 (Г -10J копий в 1 мл. Препараты с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в «режиме реального времени» и по «конечной точке» производства ЦНИИЭ Роспотребнадзора, «ДНК технология», «Век-тор-Бест» позволяют выявлять ДНК ВГВ в количестве 10 копий в 1 мл, а при использовании магнитных сорбентов-5-10 копий в 1 мл.
