Содержание к диссертации
Введение
I. МЕТОДЫ И УСТРОЙСТВА ОПРЩЕПЕНШ ПАРАМЕТРОВ ПОДВЖНОСТИ
МИКРООРГАНИЗМОВ 14
1.1. Биологические задачи, сводящиеся к исследованию параметров подвижности; связь подвижности с воздействием факторов внешней среды в процессе культивирования микроорганизмов 14
1.2. Параметры подвижности, методы и средства определения параметров подвижности биологических объектов 24
1.3. Сканирующие телевизионные методы определения параметров подвижности микрообъектов 31
1.4. Микробиологические измерительные преобразователи как основа для построения измерительных комплексов по оценке параметров подвижности микроорганизмов 38
1.5. Основные направления исследования 44
2. СЛЕДОВЫЙ СКАНИРУЮЩИЙ МЕТОД ОПРВДЕЯЕНИЯ ПАРАМЕТРОВ
ПОДВЖНОСТИ 47
2.1. Основные виды движения биологических объектов 47
2.2. Метод измерения параметров подвижности одиночных объектов путём регистрации характеристик следа 50
2.3. Следовый метод определения параметров подвижности популяции микроорганизмов 53
2.4. Определение параметров подвижности объектов по измерению амплитуд видеосигналов следов 59
2.5. Определение параметров подвижности объектов по измерению геометрического центра тяжести следа 62
2.6. Определение параметров подвижности объектов.по измерению длины следа "63
2.7. Определение подвижности при использовании сравнительной микроскопии 68
Выводы 73
3. АНАЛИЗ МЕТОДИЧЕСКИХ ПОГРІШНОСТЕЙ ИЗМЕРЕНИЯ ПАРАМЕТРОВ
ПОДВИЖНОСТИ СВДОВЫМ. МЕТОДОМ 75
3.1. Влияние геометрических характеристик формы следов на результаты измерения параметров подвижности 75
3.2. Источники методических погрешностей в следовом, методе определения параметров подвижности 77
3.3. Влияние коэффициента формы объектов на определение параметров подвижности.при использовании следового, метода 83
3.4. Влияние направления движения на определение параметров подвижности следовым методом 86
3.5. Методы коррекции методических погрешностей следового метода .91
Выводы 94
4. АППАРАТНО-АЛТОРИТМИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО' ИЗМЕРИТЕЛЬНОГО ПРЕОБРАЗОВАТЕПН НА ОСНОВЕ СЛІДОВОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАРАМЕТРОВ ПОДВИЖНОСТИ- 96
4.1. Обобщённая структура измерительного комплекса по определению параметров подвижности популяции микро организмов следовым методом 96
4.2. Метод и алгоритм определения количества.исследуемых объектов 100
4.3. Метод определения площадей перемещающихся объектов 106
4.4. Оперативные запоминающие устройства в блоках определения длины следа 115
Выводы 126
5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ИЗМЕРИТЕЛЬНОГО КОМПЛЕКСА"
ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАРАМЕТРОВ ПОДВИЖНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ И
РЕЗУЛЬТАТЫ ЛАБОРАТОРНЫХ ИСПЫТАНИЙ ПРИ РМЕНИИ ПРАКТИЧЕС
КИХ ЗАДАЧ .127
5.1. Аппаратура для экспериментальных исследований параметров подвижности следовым сканирующим методом. .127
5.2. Исследование погрешностей измерения методом физического моделирования популяции микроорганизмов... 130
5.3. Экспериментальные исследования вледового сканирующего метода в условиях биологической лаборатории 135
Выгоды 140
ЗАКЛЮЧЕНИЕ : 141
ЛИТЕРАТУРА 143
- Биологические задачи, сводящиеся к исследованию параметров подвижности; связь подвижности с воздействием факторов внешней среды в процессе культивирования микроорганизмов
- Основные виды движения биологических объектов
- Влияние геометрических характеристик формы следов на результаты измерения параметров подвижности
- Обобщённая структура измерительного комплекса по определению параметров подвижности популяции микро организмов следовым методом
- Аппаратура для экспериментальных исследований параметров подвижности следовым сканирующим методом.
class1 МЕТОДЫ И УСТРОЙСТВА ОПРЩЕПЕНШ ПАРАМЕТРОВ ПОДВЖНОСТИ
МИКРООРГАНИЗМОВ class1
Биологические задачи, сводящиеся к исследованию параметров подвижности; связь подвижности с воздействием факторов внешней среды в процессе культивирования микроорганизмов
Среди свойств, определяющих существование живой материи, одним из важнейших является движение. Движение микроорганизмов привлекает к себе пристальное внимание многочисленных исследователей различных областей наук, В микробиологии это важно при определении видовых и штаммовых различий бактерий, спирохет, спирилл, вибрионов и многих других видов микроорганизмов. Движение служит одним из наиболее чувствительных и интегральных показателей физиологического состояния клеток.
В большинстве случаев, когда размеры микрообъектов особенно малы, приходится анализировать при помощи микроскопа объемный препарат, в котором элементы находятся на разных высотах, что вынуждает использовать различную глубину резкости микроскопа Г2J .
С некоторой степенью приближения виды биологических препаратов можно разделить на следующие [53] :
а - мазки, получаемые с помощью микроскопа, - кровь, спинномозговая жидкость, мокрота, в изображении которых наблюдаются отдельные клетки на оптически однородном светлом фоне; б - посевы - моноолойные препараты с одноклеточными микроорганизмами (бактериями, вирусами, микробами и др.), отличающиеся наличием в изображении отдельных микроорганизмов или групп на оптически однородном фоне; в - срезы - многослойные препараты, имеющие структуру, которую нельзя обработать так, чтобы объекты расположились в одной плоскости.
При изучении поведенческих реакций биологических объектов на воздействия каких-либо факторов часто бывает необходимо смоделировать их геометрические формы, привести их к плоским фигурам; Однако, определение естественной формы микрообъектов представляет собой сложную задачу, так как постоянное взаимодействие МО с внешней средой приводит к частичной деформации форм и изменению их размеров.
Известно большое число работ, посвященных решению стереоло-гических задач на фиксированных препаратах с целью морфологического анализа формы клеточных популяций. Результаты при таких исследованиях обычно получают с использованием статистических методов: нахождение аналитического выражения функции распределения объектов по радиусам [63] , определение среднего количества объектов в единице объема ткани 95] , определение эквивалентного размера (например, средней высоты эллипсоида, которым описывается клетка) [І02І, вычисление объемов для совокупности случайно сориентированных эллипсоидов вращения сигарообразной формы с близкими коэффициентами отношений осей.
class2 СЛЕДОВЫЙ СКАНИРУЮЩИЙ МЕТОД ОПРВДЕЯЕНИЯ ПАРАМЕТРОВ
ПОДВЖНОСТИ class2
Основные виды движения биологических объектов
К подвижным микрообъектам можно отнести как целые клетки -бактерии, водоросли, простейшие, форменные элементы клетки и т.д., так и органеллы некоторых клеток растений и животных - клеточные ядра, вакуоли и др. При таком многообразии микрообъекты существенно отличаются по типу своего перемещения, которое может быть поступательным, вращательным, сокращательным, колебательным и т.д., а также представлять комбинацию из этих видов. Скорости перемещения при этом различных видов сильно различаются (от нескольких микрометров в минуту у микобактерий до 2000 микрометров в секунду у некоторых видов инфузорий)
Геометрическое место последовательных положений материальной точки в пространстве называется ее траекторией. В случаях, когда во время движения биологического объекта взаимное расположение материальных точек, составляющих его, не меняется, а сам объект не деформируется (не меняет форму и объем), его можно условно считать абсолютно жестким телом. В зависимости от ограничений степеней свободы движения абсолютно жесткого тела существуют следующие разновидности движения:
- поступательное, когда все точки имеют одинаковые траектории перемещения;
- вращательное, когда движение происходит вокруг оси вращения;
- сложное, когда движение состоит из двух или более простых движений: например, объект может совершать вращательное движение,
- 48 -а ось вращения может двигаться тем временем поступательно.
В случаях, когда во время воздействия на объект взаимное расположение элементов, из которых он состоит, меняется, объект является деформируемым, т.е. меняет свою форму и объем. Произвольная частица с координатой Хо не деформированной в начальный момент времени to сплошной среды после деформации в момент времени t займет новое положение в пространстве, имеющее координату Xt . Другая, близкач к ней, частица с координатой Х0 + dx займет в деформированном состоянии положение с координатой Xt + doc %
В общем случае, когда движение неравномерное и меняет свое направление, мгновенная скорость выражается по формуле: Vs dt » где $ - перемещение точки объекта. Скорость в произвольный момент времени направлена по касательной к траектории движения. Поле скоростей движущейся сплошной среды записывают в виде: V- v(Zit) , где Z - радиус кривизны траектории перемещения. Если поле скоростей не зависит от времени, то V-VС%) . При движении точки по окружности угловая скорость определяется выражением: СО- щ%/ j где oL - угол между двумя последовательными положениями радиус-вектора, а І - единичный вектор.
class3 АНАЛИЗ МЕТОДИЧЕСКИХ ПОГРІШНОСТЕЙ ИЗМЕРЕНИЯ ПАРАМЕТРОВ
ПОДВИЖНОСТИ СВДОВЫМ. МЕТОДОМ class3
Влияние геометрических характеристик формы следов на результаты измерения параметров подвижности
Пусть дано некоторое изображение R(oc,ij) (рис. 3.1). Требуется обнаружить в изображении и выделить по заданным признакам все объекты, принадлежащие определенному классу. Основными геометрическими характеристиками плоских объектов являются [17] :
- общая площадь области внутри внешних границ объекта без площади дыр 30 ;
- площадь областей, определенных внутренними границами объекта - площадь дыр SQ ;
- максимальное расстояние между внешними параллельными касательными к границам - наибольшая длина L ;
- наименьшее расстояние между параллельными касательными к границам - ширина И ;
- длина границ объекта - периметр р ;
- периметр наименьшей выпуклой геометрической фигуры, заключающей в себя объект - описанный периметр р0
Вторичные характеристики, получаемые в результате алгебраических операций с основными характеристиками:
Основные характеристики инвариантны относительно поворотов объекта. Некоторые вторичные характеристики зависят от угла поворота и называются факторами ориентации.
Кроме геометрических признаков существуют яркостные признаки: максимальная или средняя яркость, динамический диапазон яр-г костей в объектах. При использовании следового метода основными характеристиками являются площади самих объектов и их следов при перемещении.
При измерении площадей возможны два вида ошибок: аномально большие и малые. Аномально большие ошибки возникают из-за неверного отождествления объекта или его частей на стадии выделения. Малые ошибки вызваны, в основном, ошибками в отсчетах координат границ измеряемой площади. Расчеты показывают [17] , что чем больше размеры площади, тем меньше сказываются ошибки в первичных отсчетах. Если эти размеры больше 10-12 строк растра, то погрешность достигает 1$, для круглых объектов при диаметре примерно 30 строк погрешность измерения его площади составляет 0,2$. Ошибки от координатных искажений в первом случае достигают на краю растра величины 2-3$, а втором - 0,3 - 0,5$.
Обобщённая структура измерительного комплекса по определению параметров подвижности популяции микро организмов следовым методом
Как указывалось в главе 2, при определении параметров подвижности микробиологических объектов с использованием следового сканирующего метода необходимо определять площади объектов, площади их следов при перемещении, время их перемещения и количество объектов. На рис. 4.1 изображена блок-схема измерительного комплекса по определению параметров подвижности популяции микроорганизмов следовым методом. Блок подготовки выдает в узел исследуемой популяции стандартные растворы испытуемых объектов (в капиллярах, кюветах, чашках). Блок внешних воздействий оказывает влияние на исследуемые объекты контактным (внесение растворов химических соединений) или бесконтактным (внешние электро-магнитные поля, температура и т.п.) способами. Оптическая система представляет собой микроскоп либо с импульсным управляемым источником света, либо без него. Телевизионная сканирующая система используется в качестве преобразователя "свет-сигнал". В качестве датчиков видеосигнала могут быть применены передающие трубки типа плюмбикон или кремни-кон, время формирования потенциального рельефа которых составляет 10-20 мкс после окончания импульсной засветки мишени. Без импульсной подсветки можно использовать трубки типа видикон и кадмикон. Система формирования изображения производит предварительную обработку выходного сигнала от телевизионной сканирующей системы, преобразует двумерную функцию координат Rfaty) ,пропорциональ ную яркости и оптической плотности, в одномерную функцию времени U() -видеосигнал, причем зависимости X (4),у() определяются законом сканирования. Кроме того, происходит предварительная обработка видеосигнала, заключающая в усилении, при необходимости - во временной задержке, отробировании, нелинейном ограничении, нормировке и других операциях, в результате которых формируется измерительный сигнал, характеристики которого согласованы с соответствующими характеристиками устройств получения первичных отсчетов видеосигнала по динамическому диапазону изменения амплитуды сигнала, временному положению и т.д. [17].
class5 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ИЗМЕРИТЕЛЬНОГО КОМПЛЕКСА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАРАМЕТРОВ ПОДВИЖНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ И
РЕЗУЛЬТАТЫ ЛАБОРАТОРНЫХ ИСПЫТАНИЙ ПРИ РМЕНИИ ПРАКТИЧЕС
КИХ ЗАДАЧ . class5
Аппаратура для экспериментальных исследований параметров подвижности следовым сканирующим методом
Используя построчное сканирование телевизионной пассивной разверткой и производя покадровое запоминание и сравнение, можно получать следы перемещающихся объектов, измеряя площади которых и количество объектов за определенный промежуток времени, можно создать анализаторы, работающие в реальном масштабе времени, для получения параметров подвижности исследуемых объектов. Блок-схема такого телевизионного анализатора КАДР изображена на рис. 5.1. Анализатор работает следующим образом. Оптическая система с постоянным подсветом формирует световое поле исследуемых объектов. Передающая телевизионная камера преобразует это световое поле в видеосигналы, которые поступают в блок счета количества объектов, в блок задержки, в котором видеосигнал задерживается на время одного кадра, и на вход первой схемы совпадения. Блок управления при запуске передающей телевизионной камеры сообщает блоку задержки то время кадра, в котором работает телевизионная камера. Во время первого кадра на входе инвертора действует постоянный "О", и видеосигнал с выхода телевизионной камеры проходит через схему совпадения, так как на второй ее вход с инвертора подается "І". Во время второго кадра на вход инвертора подается с выхода блока задержки видеосигнал первого кадра. Видеосигнал с выхода телевизионной передающей камеры подается на первый вход первой схемы совпадения, на второй вход которой подается инвертированный сигнал первого кадра. В первой схеме совпадения происходит временное вычитание изсигнала второго кадра сигнала первого кадра. Во время третьего кадра произойдет вычитание из сигнала данного кадра сигнала второго кадра и т.д.. Из первой схемы совпадения видеосигнал поступает в первый блок измерения площадей и через вторую схему совпадения, которая открыта только в течение первого кадра в соответствии с сигналом блока управления, во второй блок измерения площадей. Через время экспонирования t , задаваемое блоком управления, телевизионная передающая камера закрывается, а величина t непосредственно передается в арифметический блок, в котором производится расчет оценки средней скорости объектов с учетом многократных пересечений их следов и с использованием информации о величине площади всех объектов, площади их следов, количестве объектов. На выходе арифметического блока формируется сигнал, который поступает в блок индикации.
