Введение к работе
Актуальность темы. Растительный белок является важным источником незаменимых аминокислот для питания человека и животных. Одной из задач селекции сельскохозяйственных растений является получение новых сортов с высокой продуктивностью и содержанием белка, а также сбалансированным аминокислотным составом. В качестве основного источника растительного белка в мировом сельском хозяйстве используется соя (Glycine max L.) благодаря сравнительно высокой урожайности и содержанию белка (до 50%) во многом аналогичного животному. Однако широкому распространению этой культуры на территории Российской Федерации препятствуют ее некоторые недостатки: теплолюбивость, требовательность к условиям возделывания, низкая устойчивость к болезням и вредителям. Заменой сое в нашей стране может стать люпин узколистный (Lupinus angustifolius L.), содержащий в семенах до 50% белка и до 12% масла. Эта культура менее требовательна к плодородию почв и климатическим условиям, за что получила название «северная соя». Другим преимуществом люпина является более низкое по сравнению с другими зернобобовыми (в 10 раз меньше, чем у гороха, и в 100 раз меньше, чем у сои) содержание ингибиторов трипсина.
Селекционная работа направлена на получение скороспелых, низкоалкалоидных, высокоурожайных сортов люпина со сбалансированным аминокислотным составом, устойчивых к болезням и вредителям, а также пригодных к технологическим операциям. Селекционный процесс является длительным, поскольку наследование ряда сельскохозяйственно-ценных признаков носит полигенный характер. Одним из путей ускорения селекционного процесса является сочетание методов классической селекции с биотехнологией.
Современная биотехнология позволяет создавать новые формы растений за короткий промежуток времени с помощью методов клеточной и генной инженерии. Однако разные сорта люпина узколистного в значительной степени отличаются регенерационным потенциалом, что вызывает необходимость дифференцированного подхода к применению и совершенствованию технологий клонального микроразмножения. Кроме того, как и все бобовые культуры, люпин характеризуется низким уровнем тотипотентности клеток, что затрудняет проведение работ в области клеточной инженерии и трансформации.
Одной из основных проблем при получении регенерантов люпина является высокая восприимчивость растений к условиям культивирования, а также экзогенным фитогормонам. В процессе клонального микроразмножения часто происходит формирование растений с нарушенной морфологией, анатомией и физиологией. Одной из причин подобных изменений является
окислительный стресс, происходящий при нарушении равновесия между образованием активных форм кислорода (АФК) в клетках и их разрушением под действием антиоксидантной системы (АОС) (Cutler et al., 1991; Roubelakis-Angelakis, 1993; Papadakis et al, 2001).
На сегодняшний день относительно мало известно о влиянии регуляторов роста на изменение уровня АФК в клетках растений в условиях in vitro и воздействии АФК на процессы дифференцировки и морфогенеза. Таким образом, является актуальным исследование взаимосвязи активности ферментов антиоксидантной системы с морфогенезом растений и условиями их культивирования in vitro.
К настоящему моменту существует ряд работ по получению регенерации люпина узколистного, однако исследования активности ферментов антиоксидантной системы и их связи с процессами морфогенеза в культуре in vitro не были проведены.
Цель работы заключалась в изучении влияния условий культивирования in vitro на морфогенетические процессы и активность ферментов антиоксидантной системы в растениях люпина узколистного на разных этапах клонального микроразмножения.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
Выявить оптимальные условия получения стерильной культуры различных сортов люпина узколистного.
Провести анализ влияния культуральных сред различного гормонального состава на морфогенетические процессы люпина узколистного in vitro.
Исследовать влияние условий культивирования на ризогенез микропобегов люпина узколистного in vitro.
Изучить активности ферментов антиоксидантной системы на различных этапах культивирования люпина узколистного in vitro.
Научная новизна и значимость. Проведен сравнительный анализ эффективности регенерации люпина узколистного сортов Ладный, Деко, Куршавель, Миртан из различных типов первичного экспланта. Усовершенствована методика клонального микроразмножения, включающая изолирование пазушных почек с 3-7-ми суточных проростков и добавление в состав питательной среды ИМК в концентрации 4,5 мкМ, обеспечивающая получение до 10 тыс. мериклонов с одного первичного экспланта за 6 циклов культивирования. Показана возможность индукции ризогенеза у микропобегов люпина узколистного после 6 пассажей культивирования на гормональной питательной среде. Выявлено изменение активности ферментов антиоксидантной системы в зависимости от состава культуральной среды.
Обнаружены различия в изоферментном составе супероксиддисмутазы в зависимости от этапа культивирования и сорта растений.
Практическая ценность исследований. Полученные результаты расширяют представления о взаимосвязи активности ферментов антиоксидантной системы и морфогенетических процессов в культуре in vitro.
Разработанные подходы к методике клонального микроразмножения могут быть использованы для проведения агробактериальной трансформации и последующего получения трансгенных растений люпина узколистного, а также для быстрого размножения ценных генотипов этой культуры.
Данные методы исследований могут быть применены для решения разнообразных задач в области биотехнологии, биохимии и физиологии растений.
Полученные результаты могут быть использованы в теоретической части курса дисциплины «Сельскохозяйственная биотехнология».
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на: 2-й Международной школе-конференции молодых ученых "Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях" (Звенигород, 2011); VII Mezinarodni vedecko-prakticka konference «Vedecky pramysl evropskeho kontinentu - 2011» (Прага, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, включенных в перечень ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендуемых ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Объем работы составляет 140 страниц. В диссертации содержится 30 рисунков и 3 таблицы. Список использованной литературы содержит 152 источника, в том числе 135 работ иностранных авторов.
