Содержание к диссертации
Введение
1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Характеристика вилона 10
1.2. Характеристика эпиталона 20
1.3. Состояние клеточного и гуморального иммунитета при сахарном диабете первого типа 23
1.4. Состояние сосудисто-тромбоцитарного гемостаза при сахарном диабете первого типа 32
1.5. Состояние свертывающей системы крови и фибринолиза при сахарном диабете первого типа. 42
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 51
2.1. Клиническая характеристика обследованных больных 51
2.2. Лабораторные методы исследования 53
2.2.1. Изучение клеточного и гуморального иммунитета 53
2.2.2.Определение фагоцитарной активности нейтрофилов... 54
2.2.3. Изучение состояния системы гемостаза 55
2.2.3.1. Исследование агрегации тромбоцитов 56
2.2.3.2. Оценка лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии 57
2.2.3.3. Определение уровня инсулина в крови 57
2.3. Статистическая обработка материала 57
3. СОБСТВЕННЫЕ ДАННЫЕ 59
3.1. Влияние вилона и эпиталона на общий анализ крови у больных сахарным диабетом первого типа 59
3.2. Состояние клеточного и гуморального иммунитета при воздействии вилона и эпиталона 60
3.3. Влияние вилона и эпиталона на состояние фагоцитарной активности лейкоцитов 64
3.4.. Влияние вилона и эпиталона на состояние сосудисто-тромбоцитарного гемостаза у больных сахарным диабетом первого типа... 66
3.5.. Влияние вилона и эпиталона на состояние коагуляционного гемостаза у больных сахарным диабетом І типа... 72
3.6.. Влияние вилона и эпиталона на состояние лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии у больных
сахарным диабетом первого типа 85
3.7. Влияние вилона и эпиталона на уровень инсулина в периферической крови 88
4.ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 91
ВЫВОДЫ 101
Список литературы 103
- Характеристика вилона
- Клиническая характеристика обследованных больных
- Влияние вилона и эпиталона на общий анализ крови у больных сахарным диабетом первого типа
Введение к работе
Актуальность проблемы: Одним из актуальнейших вопросов современ
ной эндокринологии является лечение сахарного диабета. Согласно данным
ВОЗ во всём мире с каждым годом возрастает число больных сахарным диабе
том [69, 272]. Предполагается, что уже к 2010 году их частота составит 30 чело
век на 100000 населения в год. Общее число больных сахарным диабетом к
t этому сроку в Западной Европе превысит 32 млн. человек, а общее их количе-
ство во всём мире составит около 250 миллионов человек [243]. Только в России к настоящему времени сахарным диабетом болеют более 8 миллионов людей [62]. Вместе с тем, основным методом терапии сахарного диабета 1 типа до последних лет является заместительная инсулинотерапия и диетотерапия.
Несмотря на предпринимаемое лечение при сахарном диабете 1 тина чрезвычайно высок риск развития таких осложнений, как слепота, почечная недостаточность, инфаркт миокарда, инсульт, облитерируїощие заболевания нижних конечностей, вплоть до развития гангренозной диабетической стопы [18, 19, 51, 229, 199]. К сожалению, до сих пор не разработаны эффективные меры, предупреждающие эти осложнения.
До последнего времени окончательно не решен вопрос о том, как изменяется состояние сосудисто-тромбоцитарного гемостаза, свёртывания крови и фибринолиза при сахарном диабете Ітипа. Нет никакого сомнения, что при этом грозном заболевании создаются благоприятные условия для развития хронической формы ДВС-синдрома [116,18,30]. Однако окончательный механизм этого явления далёк от разрешения и требует проведения тщательных дополнительных исследований [127,162,229,199].
За последние годы в терапии сахарного диабета стали использоваться такие биорегуляторы, как тималин, тимоген и эпиталамин. В частности, В.Х. Ха-винсон и Т.С. Шутак (2000) показали, что применение эпиталамина нормализует функцию сердечно-сосудистой системы при инсулиннезависимом сахарном диабете.
Вместе с тем, у нас есть все основания предполагать, что не менее, и даже
более хороший эффект при сахарном диабете 1 типа, может быть достигнут при
использовании дипептида вилона (Lys-Glu) и тетрапептида эпиталона (Ala-Glu-
Asp-Gly) обладающих иммуномодулирующим и мощным репаративным дей
ствием. Об этом говорят многочисленные экспериментальные и клинические
наблюдения многих авторов [149, 141, 143, 114, 98, 79], применявших эпиталон
и вилон при самых различных заболеваниях. При этом отмечалась нормализа-
* ция гормонального фона, иммунитета и гемостаза, как известно, значительно
нарушенных при сахарном диабете 1 типа. Однако эпиталон и вилон при сахарном диабете 1 типа до сих пор не применялись.
Известно, что сахарный диабет 1 типа сопровождается резким повышением уровня глюкозы в крови, которая перестаёт усваиваться клетками [52, 62, 11, 13]. Нами сахарный диабет Ітипа избран в качестве модели для изучения роли биологически активных пептидов в регуляции иммунитета и гемостаза.
Избранная тема кандидатской диссертации является актуальной как в теоретическом, так и практическом отношении.
Цели и задачи исследования. Основной целью исследований явилось
сравнительное изучение действия дипептида вилона и тетрапептида эпиталона
на состояние иммунитета, системы гемостаза и уровня инсулина в крови у
больных сахарным диабетом 1 типа.
В связи со сказанным решались следующие задачи:
изучить, как влияет вилона на состояние красной и белой крови, клеточного и гуморального иммунитета, а также фагоцитарную активность лейкоцитов у больных с осложнённым и не осложнённым течением сахарного диабета первого типа.
выяснить изменения сосудисто-тромбоцитарного гемостаза, свёртываемости крови и фибринолиза у больных сахарным диабетом первого типа в зависимости от продолжительности и тяжести заболевания, наличия осложнений и дозы применяемого инсулина.
- выявить эффективность применения вилона и эпиталона на сосудисто-
тромбоцитарный гемостаз, свёртывание крови, фибринолиз у больных с ос
ложнённым и не осложнённым течением сахарного диабета первого типа.
исследовать способность лимфоцитов присоединять тромбоциты в условиях применения вилона и эпиталона при сахарном диабете первого типа.
изучить действие вилона и эпиталона на уровень инсулина в перефериче-ской крови.
Научная новизна. Впервые при лечении сахарного диабета первого типа были применены биорегуляторы вилон и эпиталон. Применение эпиталона и вилона у большинства испытуемых приводит к нормализации или к значительному улучшению агрегатограммы на действие АДФ, коллагена, адреналина и ристомицина. При использовании вилона и эпиталона наблюдается удлинение АЧТВ, уменьшение уровня фибриногена и РФМК, повышение концентрации АТ-Ш и протеина С, а также стимуляция фибринолиза, то есть уменьшается дессиминированное внутри со суд истое свёртывание крови.
Впервые установлено, что у больных сахарным диабетом 1 типа сдвиги лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии (ЛТА) протекают в 2 фазы: при относительно лёгких формах сахарного диабета 1 типа ЛТА возрастает, а при тяжелом течении и наличии осложнений - значительно снижается.
При использовании вилона и эпиталона значительно возрастает уровень инсулина, что не отмечается при стандартной терапии.
Практическая ценность работы.
Полученные данные позволяют рекомендовать вилон и эпиталон при лечении больных сахарным диабетом 1 типа. Результаты работы включены в материалы учебных занятий по патологической физиологии в Читинской государственной медицинской академии и внедрены в практику лечения больных сахарным диабетом 1 типа в диабетическом центре Читинской областной больницы (Акт внедрения от 15.02.2006).
Положения, выносимые на защиту.
1. У больных СД-1 в стадии декомпенсации наблюдается активация кле
точного иммунитета, уменьшается фагоцитарная активность лейкоцитов и воз
растает число В-лимфоцитов. Применение стандартной терапии (диета, вита
минотерапия, увеличение дозы инсулина) сопровождается нормализацией кле
точного и иммунитета и числа В-лимфоцитов, Использование вилона на фоне
традиционной терапии приводит к уменьшению числа Т-хелперов и иммуноре-
а гуляторного индекса, снижению количество Т-зависимых и Т-независимых НК-
клеток, а также активных Т-лимфоцитов, нормализации числа В-клеток и уровня IgA. При этом стабилизация состояния больных и нормализация углеводного обмена в большинстве случаев сопровождается уменьшением дозы применяемого инсулина.
При сахарном диабете первого типа у подавляющего большинства больных наблюдается активация клеточного и гуморального иммунитета, спонтанная агрегация и вторичная гипоагрегация тромбоцитов при использовании АДФ, коллагена, адреналина и ристомицина. Одновременно развивается гиперкоагуляция, снижается концентрация антитромбина III и протеина С, тормозится фибринолиз, выявляется высокая скорость образования растворимых фиб-ринмономерных комплексов (РФМК), что свидетельствует о наличии хронической формы ДВС-синдрома. Применение стандартной терапии не сказывается существенным образом на состоянии сосудисто-тромбоцитарного и коагуляци-онного гемостаза, тогда как назначение эпиталона и вилона значительно уменьшает интенсивность ДВС.
У больных с неосложнённым течением сахарного диабета первого типа лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия (ЛТА) резко возрастает, а при наличии осложнений и тяжелого течения заболевания - уменьшается. Нормализация ЛТА является надёжным тестом, свидетельствующим о стабилизации состояния больных.
4. Под воздействием вилона и эпиталона совместно со стандартной терапией значительно увеличивается содержание инсулина в периферической крови, что не наблюдается на фоне стандартного лечения.
Характеристика вилона
Одной из основных задач исследований явилось применение иммуно-модулирующей терапии для лечения больных сахарным диабетом 1 типа. С этой целью нами был избран тимомиметик вилон (Lys-Glu), синтезированный на основе изучения аминокислотного состава тималина [114].
Следует обратить внимание на то, что Lys-Glu является фрагментом многих цитокинов (IL-la, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, Ifa), а также целого ряда биологически активных веществ - тимозинов, тимопоэтинов I и II, парати-реоидного гормона и других, что во многом определяет его биологическую активность [114].
Вилон в концентрации от 10 нг/литр до 100 мкг/литр приводит к увеличению уровня внутриклеточного Са2+ в тимоцитах и макрофагах, что, по всей видимости, является одним из механизмов активации клеток.
В.В. Малининьш (2001) в опытах in vitro исследовано действие вилона на рост тимоцитов, полученных от 1- и 21-дневных крыс. При этом установлено, что препарат в дозе 2 нг/мл у однодневных крыс ингибировал рост тимоцитов. У 21-дневных крыс под воздействием вилона отмечалась тенденция к увеличению роста трансплантатов. Такое же действие проявлял препарат на спленоциты. Следует отметить, что аналогичными свойствами обладает тимомиметик - тимоген. По всей видимости, действие тимогена и вилона на рост лимфоидной ткани обусловлено структурными характеристиками этих дипептидов.
Представленные данные свидетельствуют о том, что действие вилона определяется зрелостью клеточных популяций и, вероятно, связано с селекцией клеток путём апоптоза.
Особый интерес представляют исследования, в которых изучалось, как действует вилон на экспрессию генов одного из ведущих иммуногенных цитокинов- IL-2. Установлено, что после 5-часовой инкубации дипептид стимулировал синтез IL-2 мРНК в лимфоидных клетках селезенки мышей. При этом наиболее сильный эффект наблюдали при инкубации с пептидом в концентрации 5 нг/мл, Полученные данные свидетельствуют о том, что ви-лон не только проникает через мембрану в клетку, но и участвует в регуляции экспрессии генов. Высказывается предположение, что вилон способствует доставке трансфакторов в ядро, или входит в структуру функционально активных центров трансфакторных комплексов, необходимых для активации транскрипции гена IL-2 в лимфоцитах [110].
В опытах in vitro установлено, что вилон, как и тимоген, стимулирует клеточный иммунитет и неспецифическую резистентность организма [92]. Вилон не только значительно усиливает экспрессию рецепторов на Т- и В-лимфоцитах больных с вторичными иммунодефицитами, но и стимулирует продукцию провоспалительных цитокинов - IL-la, IL-lp, IL-8 и TNFa. Вместе с тем, в культуре астроцитов вилон снижает продукцию IL-8, но увеличивает синтез Ify в лимфоцитах[114].
Более детально этот вопрос был изучен в последующем нашим сотрудником А.В. Чиркуповым (2000). В качестве культуральной среды в его экспериментах были выбраны цельная гепаринизированная кровь, фибрино-лизная кровь и фибриновый сгусток, инкубируемые при температуре 37 без добавления и с добавлением вилона. Для сравнения в опытах применялись известные иммуномодуляторы: тималин и тимоген. Изучалось, как при этом изменяется концентрация провоспалительных цитокинов в крови здоровых людей и больных острым гнойным разлитым перитонитом сразу после оперативного вмешательства.
Жидкая и фибринолизная кровь, а также фибриновый сгусток были избраны потому, что они символизируют 3 основных агрегатных состояния крови, встречающихся в организме здоровых и больных людей [39].
Клиническая характеристика обследованных больных
В работе с обследуемыми людьми соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской Декларацией Всемирной Медицинской ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki (1964,2000 ред.)).
Всего под наблюдением находилось 280 больных с сахарным диабетом 1 типа - 117 мужчины (41,79%) и 163 (58,21%) женщин- В качестве контроля обследовано 168 здоровых людей в основном молодого возраста (18-25 лет). Все наблюдаемые нами больные находились на стационарном лечении в областном диабстологическом центре на базе эндокринологического отделения Читинской областной клинической больницы в период с 2002 по 2005 год. Возраст пациентов колебался от 15 до 73 лет, средний возраст составил 34 года.
У 151 больного (61 мужчин - 40,4%, 90 женщин - 59,6 %) с наличием ке-тоза и поздних осложнений диабета наряду с традиционной терапией применяли вилон или эпиталон. Возраст в этой группе колебался от 15 до 73 лет, средний возраст составил 33 года, В группе пациентов, не получавших эпиталон или вилон, было 129 человек-53 мужчин (41,1 %) и 76 женщина (58,9 %). Возраст больных был от 16 до 56 лет, средний возраст составил 33 года (табл. 1)
Как видно из представленных данных, по возрасту и половому составу больные всех трёх исследуемух групп мало отличались друг от друга-Длительность заболевания во всех трёх группах была также сходной, о чем свидетельствуют данные, приведенные в таблице 2,
Длительность заболевания Количество больных Средний возраст Средняя доза инсулина (ЕД)
Сахар крови натощак при поступлении у больных, получавших эпиталон или вилон, колебался от 7,2 до 29,4 ммоль/л, глюкозурия отмечалась у всех пациентов, кетонурия у 12 (21,8%) человек. Сахар крови у лиц, не получавших вилон или эпиталон, варьировал натощак от 7,0 до 37,6 ммоль/л, глюкозурия обнаружена у 31 (83,7%) пациентов, ацетон в моче - у 6 (16,2 %), Уровень HbAlc (гликированный гемоглобин) у лиц, получавших эпиталон или вилон, равнялся в среднем 9,3%, в то время как у пациентов, его не получавших, он был равен 10,3%.
Все приведенные данные свидетельствуют о том, что группы пациентов, получавших и не получавших вилон и эпиталон, были близки по дебюту заболевания, его течению и степени тяжести,
Влияние вилона и эпиталона на общий анализ крови у больных сахарным диабетом первого типа
. Влияние ви.гшна и эпиталона на общий анализ крови у больных сахарным диабетом первого типа Известно, что общий анализ крови, как никакие другие, отражает общее состояние больного и позволяет охарактеризовать, какие изменения происходят со стороны красной и белой крови, числа тромбоцитов и скорости оседания эритроцитов- Эти исследования были проведены на 188 больных, из которых 37 получали традиционную терапию, 96 одновременно с общепринятым лечением вилон, а 55 - эпиталон (табл. 3). Таблица 3 - Влияние вилона и эпиталона на показатели красной и белой
Как показали проведенные наблюдения, существенных отклонений от нормы в общем анализе крови у больных сахарным диабетом 1 типа не наблюдается. Следует лишь обратить внимание на относительно низкое содержание эритроцитов и уровня гемоглобина, а также низкий гематокрит (нижняя граница нормы), увеличенное по сравнению со средней нормой процентное содержание лимфоцитов (верхняя граница нормы) и слегка повышенную СОЭ.
В процессе традиционной терапии у больных отмечалась тенденция к снижению числа эритроцитов и уровня гемоглобина, довольно значительно увеличивалось количество тромбоцитов, относительное содержание эозинофилов и моноцитов существенно не изменилось. Всё это является явно неблагоприятными признаками. Особенно тревожным следует считать резкое увеличение числа тромбоцитов, так как у больных сахарным диабетом 1 типа (см, раздел 3.2) имеется усиление спонтанной агрегации тромбоцитов.
При использовании вилона и эпиталона наблюдалось увеличение гематокрита, числа эритроцитов и уровня гемоглобина, тогда как количество тромбоцитов, эозинофилов и моноцитов оставалось без изменений, а СОЭ имела небольшую тенденцию к снижению.
Не вызывает сомнений, что полученные результаты при лечении с использованием вилона и эпиталона являются более благоприятными и способствуют успеху применяемой терапии.
Разницы в действии вилона и эпиталона на показатели красной и белок крови не обнаружено,
Состояние клеточного и гуморального иммунитета у больных сахарным диабетом 1 типа при воздействии вилона и эпиталона
Одной из основных задач наших исследований явилось изучение состояния клеточного и гуморального иммунитета у больных сахарным диабетом 1 типа. Эти наблюдения проведены на 25 больных. Все исследования проводились утром при поступлении в стационар больных, находящихся в стадии декомпенсации, а также после окончания курса терапии. При этом из-за малочисленности наблюдений учитывались лишь те осложнения, которые были связаны непосредственно с основным заболеванием.
Десять исследуемых больных находились на обычной стандартной терапии. Достижение компенсации у них достигалось главным образом за счёт увеличения дозы вводимого инсулина. Пятнадцати больным кроме стандартной терапии назначали БИЛОН из расчёта 10 мкг на инъекцию на протяжении 8-Ю дней. Полученные данные представлены в таблице 4.
Как видно из приведенной таблицы, абсолютное число лейкоцитов и лимфоцитов у больных сахарным диабетом 1 типа оставалось в пределах нормы. Вместе с тем, процентное содержание лимфоцитов у больных оказалось значительно повышенным.
Абсолютное количество зрелых Т-лимфоцитов (CD3+) у больных сахарным диабетом I типа было резко увеличено (в контроле 1302+51, у больных -1812±70Д Р 05001). Вместе с тем, относительное содержание клеток, несущих маркеры CD3+, у больных сахарным диабетом 1 типа оставалось в пределах нормы.
У больных отмечалось увеличение как относительного, так и абсолютного содержания Т-хелперов (CD3+, CD4+), тогда как абсолютное количество Т-киллеров (CD3+, CD8+) оставалось без изменений, а их относительное число уменьшалось. При этом резко возрастал иммунорегуляторный индекс, что свидетельствовало о значительном усилении хелперной активности, следовательно, и возможности развития аутоиммунных процессов.
Как относительное, так и абсолютное количество Т-независимых естественных киллеров (NK, CD3 , CD16+, CD56+) при сахарном диабете 1 типа уменьшалось, а уровень Т-зависимых NK-клеток (CD3+, CD 16+, CD56+) резко возрастал, что говорит о повышенной способности этих клеток распознавать чужеродные агенты.
