Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1 Типы микробных сурфактантов, их физиологическая роль 10
1.2 Методы оценки продукции сурфактантов микроорганизмами, скрининг
культур-продуцентов 16
1.3 Гидрофильно-гидрофобные свойства клеток углеводородокисляющих бактерий 19
1.4 Влияние условий культивирования на продукцию биоПАВ углеводородокисляющими бактериями 23
1.5 Микробная биодеградация углеводородных загрязнений, применение СПАВибиоПАВ 30
2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 36
2.1 Бактериальные штаммы 36
2.2 Питательные среды и субстраты 36
2.3 Условия культивирования микроорганизмов, получение биомассы и куль-туральных жидкостей 37
2.4 Методы регистрации поверхностно-активных свойств 37
2.4.1 Измерение величин поверхностного натяжения 37
2.4.2 Измерение эмульгирующей активности 39
2.4.3 Измерение уровня гидрофобности поверхности клеток 40
2.5 Химическое выделение биосурфактантов 41
2.6 Оценка эффективности штаммов - продуцентов биосурфактантов в модельных экспериментах по биоремедиации 42
2.6.1 Микробиологические методы анализа 42
2.6.2 Определение концентрации нефтепродуктов, азота, фосфора 43
2.6.3 Оценка фитотоксичности нефтезагрязнённых субстратов 43
2.7 Методы математического планирования эксперимента 44
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 49
3. СКРИНИНГ КУЛЬТУР-ПРОДУЦЕНТОВ БИОСУРФАКТАНТОВ .. 49
3.1 Поверхностно-активные свойства бактерий при росте на питательном агаре 50
3.2 Поверхностно-активные свойства культур при росте в жидкой минеральной среде с углеводородами 53
3.3 Определение локализации биосурфактантов в микробных культурах ... 57
4. ГИДРОФОБНОСТЬ КЛЕТОК КАК ФАКТОР, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЙ
ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫЕ СВОЙСТВА ЖИДКИХ БАКТЕРИ
АЛЬНЫХ КУЛЬТУР 63
4.1 Естественная гидрофобность клеток и эмульгирующая активность S, R- и М-форм культур на жидкой минеральной среде с углеводородом 63
4.2 Гидрофобность суспендированных клеток как фактор, определяющий уровень поверхностного натяжения и эмульгирующую активность жидких культур углеводородокисляющих бактерий 66
5. ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫЕ СВОЙСТВА ХИМИЧЕСКИ
ВЫДЕЛЕННЫХ МИКРОБНЫХ СУРФАКТАНТОВ 71
5.1 Активность биосурфактантов углеводородокисляющих культур, выращенных на питательном агаре 71
5.2 Активность биосурфактантов некоторых штаммов, выращенных на жидкой минеральной среде с углеводородом 75
5.2.1 Активность клеточно-связанных биосурфактантов 75
5.2.2 Активность экстрацеллюлярных биосурфактантов 78
6. ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА ПОВЕРХНОСТ НО-АКТИВНЫЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ-ПРОДУЦЕНТОВ БИОСУР ФАКТАНТОВ 81
6.1 Поверхностно-активные свойства культур при росте на различных типах сред 81
6.2 Зависимость поверхностно-активных и ростовых свойств жидких культур от соотношения углерода, азота и фосфора в среде 84
6.3 Поверхностно-активные свойства культур при росте на различных гидрофобных источниках углерода 90
6.4 Зависимость поверхностно-активных свойств жидких культур от продолжительности культивирования 94
6.5 Характер расслоения биомассы и поверхностно-активные
свойства жидких культур 99
7. МОДЕЛИРОВАНИЕ БИОРЕМЕДИАЦИИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ СУБСТРАТОВ ПОСРЕДСТВОМ БАКТЕРИЙ - ПРОДУЦЕНТОВ БИОПАВ 103
7.1 Влияние культур-продуцентов клеточно-связанных биоПАВ наремедиа-цию нефтезагрязнённого чернозёма в сравнении с другими стимулирующими агентами 103
7.2 Влияние культур-продуцентов биосурфактантов на детоксикацию неф-тешлама в сравнении с активированными аборигенными штаммами 107
7.3 Биодеградация нефти на поверхности воды культурами - продуцентами
биосурфактантов 113
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 118
ВЫВОДЫ 128
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 129
- Типы микробных сурфактантов, их физиологическая роль
- Бактериальные штаммы
- Поверхностно-активные свойства бактерий при росте на питательном агаре
Введение к работе
Актуальность проблемы
Крупнейшей проблемой, стоящей перед человечеством, является разрушение естественных экосистем под действием антропогенной нагрузки. Одним из основных фактором давления общепризнанно считается накопление в биосфере всевозможных поллютантов, в том числе сырой нефти и продуктов её переработки. Мощное негативное влияние нефтепродуктов на атмосферу, гидросферу, почвенный покров Земли обусловлен рядом факторов: активным и всё более возрастающим применением углеводородного сырья во всех отраслях хозяйственной деятельности человека; широким распространением нефтедобывающих, транспортирующих, перерабатывающих и потребляющих предприятий; характерными физико-химическими и токсическими свойствами углеводородов, обусловливающими их низкую биоде-градабельность в естественных экосистемах.
Для ликвидации углеводородных загрязнений в настоящее время выработан комплекс мер - применяется механическая очистка, физическая и химическая переработка контаминирующих нефтепродуктов [Бельков В.В., 1995; Панченко Л.В. и др., 2003]. Однако, единственным методом, позволяющим преобразовать углеводородные поллютанты в безвредные соединения максимально естественным путём, является биоремедиация. Ключевым звеном любой биоремедиационной технологии являются микроорганизмы-деструкторы, способные утилизировать нефтепродукты в качестве источника углерода и энергии, преобразуя их в микробную биомассу, углекислый газ и другие нетоксичные метаболиты [Андресон Р.К., 1993]. Мощным лимитирующим фактором использования микробного разложения нефтепродуктов служит гидрофобная природа углеводородов, что приводит как к сорбции их на различных поверхностях и переходу в биологически труднодоступную форму, так и к невозможности эффективного контакта с микробными клетками, имеющими, как правило, гидрофильный характер внешних поверхностей. Перспективным способом устранить это затруднение может стать применение микробных поверхностно-активных веществ - биосурфактантов [Banat I.M. et. al., 2000]. БиоПАВ способны как диспергировать углеводороды, переводя их в водную фазу и повышая биологическую доступность, так и модифицировать внешние поверхности бактерий путём гидрофобизации обеспечивая прямой контакт с молекулами углеводородов. Биосурфактанты, в отличие от своих синтетических аналогов, как правило нетоксичны и био-деградабельны, могут синтезироваться микробами из дешёвого сырья. Всё это делает актуальным поиск культур - продуцентов биоПАВ и исследование их свойств.
Цель и задачи исследования
Целью работы являлся поиск углеводородокисляющих бактерий-продуцентов биосурфактантов, изучение факторов, влияющих на поверхностно-активные свойства культур-продуцентов, экспериментальная проверка эффективности отобранных штаммов.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
• Определить критерии отбора бактерий - продуцентов биосурфактантов.
• Провести скрининг потенциальных продуцентов среди коллекции неф-теокисляющих бактерий Кубанского государственного университета, отобрать наиболее активные штаммы;
• Исследовать влияние условий культивирования на поверхностно-активные свойства культур - продуцентов биоПАВ, определить направления оптимизации, способствующие получению культур с повышенными сурфактантными свойствами;
• Выделить микробные биосурфактанты наиболее активных штаммов, охарактеризовать их свойства;
• Экспериментально проверить эффективность биоремедиации нефте-загрязнённых субстратов отобранными углеводородокисляющими бактериями - продуцентами биоПАВ. Научная новизна работы.
Охарактеризованы по поверхностно-активным свойствам ряд бактерий-деструкторов нефтепродуктов. Впервые показано, что культуры нефтеокис-ляющих бактерий, длительно поддерживающиеся на питательном агаре, способны синтезировать биосурфактанты при культивировании на этой среде, а эмульгирующая активность, показатель гидрофобности клеток и морфотип колоний могут служить критериями отбора штаммов - продуцентов биосур-фактантов. Впервые выявлена важная роль гидрофобности клеток в формировании поверхностно-активных свойств жидких бактериальных культур — эмульгирующей активности и способности снижать поверхностное натяжение среды. Показано, что наибольшее влияние на поверхностно-активные свойства жидких культур исследованных штаммов оказывает концентрация углерода в среде.
Часть исследований проведена в рамках работы по грантам INTAS 01-2150, CAF "Экологичные технологии". Практическая значимость работы
Отобранные штаммы-продуценты биосурфактантов могут быть использованы для создания нового бактериального биопрепарата для очистки загрязнённых нефтепродуктами субстратов. Полученные в ходе диссертационного исследования результаты используются в деятельности центра "Биотехнология" Кубанского государственного университета по биологической рекультивации нефтезагрязнённых почв и грунтов, детоксикации нефтешла-мов.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
1. Скрининг штаммов-продуцентов клеточно-связанных и экстрацеллюляр-ных биосурфактантов.
2. Роль гидрофобности клеток в формировании поверхностно-активных свойств жидких бактериальных культур. 3. Критерии отбора бактерий - продуцентов биосурфактантов при культивировании на питательном агаре.
4. Результаты влияния условий культивирования на поверхностно Ф активные свойства жидких бактериальных культур.
5. Результаты лабораторных испытаний бактерий - продуцентов биосурфак тантов в ликвидации нефтяного загрязнения в почве, нефтешламе, на поверхности воды. Апробация работы
Основные результаты исследования были представлены на следующих
• конференциях: Международная школа-конференция "Биология - наука XXI века" (г. Пущино, 2001 и 2006 гг); 1st European microbiological congress. (Slovenia, Lubjana 2003 г); 2-й съезд общества биотехнологов России (Москва,
• 2004 г); "Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды" (Саратов, 2005 г); 2-я международная конференция "Микробное разнообразие 2005" (Пермь-Казань, 2005 г); 2-я Всероссийская научная конференция молодых учёных и студентов. (Краснодар, 2005 г).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 11 работ, одна работа принята к печати, подана заявка на патент. Структура и объём работы
• Диссертация состоит из введения, обзора литературы, глав собственных исследований, заключения и выводов. Работа изложена на 148 листах машинописного текста, содержит 36 рисунков и 13 таблиц. Список литературы включает 178 наименований, в том числе 70 зарубежных источников.
Типы микробных сурфактантов, их физиологическая роль
К поверхностно-активным веществам относят соединения способные снижать поверхностное и межфазное натяжение. Это обширный класс веществ различной химической природы, общим свойством которых является дифильное строение образующих их молекул, то есть наличие в их составе гидрофильной полярной "головы" и неполярного гидрофобного "хвоста". Благодаря такому строению молекулы, этих веществ способны концентрироваться на поверхности раздела фаз, что ведёт к появлению поверхностно-активных свойств [Абрамзон А.А, 1981]. К последним относятся эмульгация и деэмульгация гидрофобных жидкостей, их солюбилизация, изменение смачиваемости твёрдых поверхностей и другие явления.
К биоПАВ (биосурфактантам) относятся поверхностно-активные вещества биогенного, в частности микробного происхождения. По своим активно-стным характеристикам они, как правило, близки к синтетическим ПАВ, но выгодно отличаются такими свойствами как:
- меньшая токсичность или её отсутствие;
- высокая биодеградабельность природными микроорганизмами;
- наличие активности в широком диапазоне кислотности и солёности среды;
- возможность их синтеза микробами из относительно дешёвых субстратов, в том числе и из соединений-поллютантов.
По химической природе биосурфактанты - весьма разнородные соединения но, как правило, роль полярного компонента играют пептиды или гли-каны, неполярного - различные липиды. Согласно химической классификации Rosenberg Е. Розенберга и Ron Е. [1999], биоПАВ относятся к следующим основным группам.
А) Гликолипиды - наиболее распространённая группа, низкомолекулярные соединения, состоящие из углеводного и липидного компонента. Включают трегалозолипиды, которые содержат дисахарид трегалозу и коринемиколовые кислоты и синтезируются представителями родов Rhodococcus, Nocardia [Bell K.S. et. al., 1998; Ганиткевич Я.В., 1988]; рамнолипиды - содержат углевод рамнозу и гидроксидекановую кислоту, синтезируются бактериями рода Pseudomonas [Карпенко Е.В. и др., 1996; Sim L. et. al., 1997, Sandrin T.D., 2000], софорозолипиды - в их молекулах присутствуют ацетилированный дисахарида софороза и алифатические кислоты, синтезируются дрожжами, например рода Candida [Otto R.T., 1999].
Б) Липопептиды - низкомолекулярные соединения, состоящие из пептидной (белковой) и липидной части, синтезируются некоторыми псевдомонадами и дрожжами, наиболее известными продуцентами являются представители рода Bacillus, синтезирующие широкий спектр липопептидных биоПАВ, в том числе сурфактин [Peypoux F. et. al., 1999], лихенизин [Mikkola R. et. al., 2000], антибиотики с поверхностно-активными свойствами [Niran Roongsawang. et. al., 2002].
В) Жирные кислоты и фосфолипиды - жирные кислоты образуются при окислении алканов, и могут выделяться в окружающую среду родококками, фосфолипиды синтезируются представителями родов Acinetobacter, Corine-bacterium [Елисеев С.А., Кучер Р.В., 1991].
Г) Полисахариды - внеклеточные полимерные соединения, обладающие мощными эмульгирующими свойствами. Широко известны такие биосур-фактанты как ксантан, образуемый Xanthomonas campestris [Гвоздяк Р.И. и др., 1989], аласан-продукт Acinetobacter radioresistens [Navon-Venezia S. et. al., 1998; Barkay T. et. al, 1998], эмульсан - Acinetobacter venetianus [Baldi F. et. al., 1999].
Бактериальные штаммы
Объектами исследования послужили культуры коллекции нефтеокис-ляющих бактерий кафедры генетики и микробиологии Кубанского государственного университета. Штаммы были выделены из нефтезагрязнённых почв, грунтов, вод, нефтешламов Краснодарского края и других регионов сотрудниками кафедры. Бактерии поддерживались в чистых культурах, в том числе и на питательном агаре, на протяжении ряда лет. Большая часть исследованных изолятов принадлежала к группе нокардиоморфных актиномицетов из родов Rhodococcus, Nocardia, Gordonia, Dietzia, Kocuria. Присутствовали отдельные штаммы родов Pseudomonas, Arthrobacter, Micrococcus, Planococcus и несколько культур с неопределённой родовой принадлежностью. Все исследуемые микроорганизмы были способны к росту на питательном агаре и на жидкой минеральной среде с нефтепродуктами при температуре 20-30 С.
Питательные среды и субстраты
Для поддержания культур и оценки их поверхностно-активных свойств использовали плотную питательную среду - питательный агар производства ГНЦПМ, г.Оболенск (Россия), следующего состава (г/л): панкреатический гидролизат рыбной муки - 24,0; натрий хлористый - 4,0; агар микробиологический - 12,0+2,0; рН 7,3+0,2. Питательный агар стерилизовали автоклавиро-ванием при 1 атм в течение 20 мин. Для исследования поверхностно-активных свойств жидких культур использовали жидкую минеральную среду следующего состава [Нетрусов А.И. и др., 2005] (г/л): КМЗз - 4; Na2HP04-12H20 - 1,4; КН2Р04 - 0,6; MgS04-7H20 - 0,8; стандартный раствор микроэлементов (из 10 элементов) - 1 мл на 1 л среды. В отдельных опытах использовали минеральную среду состава (г/л): NH4NO3 - 16,65; KCI - 10; MgS04"7 Н20 - 0,88; Na2HP04-12 Н20 - 20; раствор микроэлементов (из 10 элементов) - 1 мл на 1 л среды. При приготовлении сред использовались минеральные соли марок "Ч , ХЧ и "ЧДА". В качестве единственного источника углерода и энергии использовали гексадекан или дизельное топливо, вносимые в среду в количестве 1 % (об). В отдельных опытах использовали н-алканы от С7 до С17, растительное масло, сырую нефть. Стерилизацию жидкой минеральной среды осуществляли автоклавированием при 1 атм в течение 20 мин, фосфорные соли стерилизовали отдельно. Углеводороды стерилизовали автоклавированием при 0,5 атм в течение 20 мин.
Условия культивирования микроорганизмов, получение биомассы и культуральных жидкостей
Все исследуемые штаммы выращивали при комнатной температуре в интервале 20-25 С. Культивирование на жидких средах проводили во флаконах объёмом 200 мл с объёмом среды 50 мл или в круглых плоскодонных колбах объёмом 500 мл с объёмом среды 150 мл, или в пробирках объёмом 50 мл с объёмом среды 10 мл. Постоянная аэрация достигалась встряхиванием на орбитальных качалках "Экрос" (Россия) при частоте вращения 100-150 об/мин. Продолжительность культивирования как правило составляла от 3 до 5 суток, в отдельных опытах - до 7-Ю суток. Инокулирование жидких сред осуществляли клетками, смытыми с питательного агара или предварительно выращенными в жидкой минеральной среде с углеводородами. Для получения биомассы и культуральных жидкостей, образцы нативных жидких культур центрифугировали при 4000 об/мин в течение 20 мин.
Бактериальные штаммы
В ходе первичного скрининга были проанализированы 39 изолятов неф-теокисляющих бактерий. Все они с разной активностью росли на питательном агаре в аэробных условиях при комнатной температуре, большая часть изолятов являлась S- и R-формами, меньше было М-форм. Поскольку в литературе не описаны факты продукции биосурфактантов углеводородокисляющими бактериями при росте на питательном агаре, представлялось необходимым выяснить принципиальную возможность продукции биоПАВ в этих условиях.
Культуры наращивали на скошенном агаре или в чашках Петри в течение 3-7 суток, смывали клетки минеральной средой или фосфатным буфером (рН 6,8) и доводили концентрацию клеточных взвесей до оптической плотности 0,2-0,3 усл. ед. при длине волны 670 нм. Полученные бактериальные суспензии служили объектом измерения поверхностного натяжения, индекса эмульгации и показателя гидрофобности клеток. С целью обнаружения продукции экстрацеллюлярных биоПАВ при росте на ПА, смытую с агара биомассу встряхивали на орбитальной качалке при 200 об/мин в течение 15 мин для отделения связанных с клетками слизей, затем центрифугировали. В полученных образцах супернатанта определяли уровень ПН и ИЭ.
Как видно из таблицы 5, клетки, суспендированные в минеральной среде, сообщают ей уровень поверхностного натяжения в диапазоне 50-60 мН/м, что сравнимо с ПН исходной чистой среды. Уровень ПН супернатантов большинства культур был несколько ниже, чем клеточных суспензий, но в целом, находился в том же диапазоне значений. Эмульгирующая активность была определена для суспензий клеток 39-ти штаммов, 16 из которых показали индекс эмульгации по отношению к дизельному топливу от 3 до 25 %. Три из 32-х исследованных супернатантов эмульгировали дизтопливо с ИЭ 3-8 %. Наибольший разброс значений был отмечен при регистрации показателя гидрофобности клеток - от 6 до 88 %. Закономерности распределения по ПГ исследованной выборки штаммов будут рассмотрены ниже в разделе 4.
На основании представленных результатов можно отметить, что культуры нефтеокисляющих бактерий длительно поддерживающиеся на питательном агаре, обладают эмульгирующими свойствами по отношению к углеводороду, но не способны снижать поверхностное натяжение среды. Лучшим эмульгатором показал себя штамм Nocardia sp.K5. Таким образом, у 40 % исследованных изолятов клетки способны образовывать эмульсию с углеводородом (как масло/вода, так и вода/масло), что свидетельствует о возможной продукции биоПАВ при росте на питательном агаре. Три изолята, вероятно, являются продуцентами экстрацеллюлярных биосурфактантов - для них отмечена эмульгирующая активность образцов внеклеточных слизей. Культурой с наиболее выраженными поверхностно-активными свойствами при росте на плотной богатой питательной среде является Micrococcus sp. НІ, для которой зафиксировано как существенное снижение поверхностного натяжения, так и эмульгирующая активность.
У 17 изолятов были количественно выделены вещества - носители поверхностно-активных свойств, определены их содержание и активность.
