Введение к работе
Актуальность темы
Энтерококки входят в состав нормальной микрофлоры ротовой полости, кишечника и мочеполовой системы животных и человека, поэтому их обнаружение в объектах внешней среды свидетельствует о биологической контаминации изучаемого объекта (Еремина, Седов, 1994; Anderson, Turner, Lewis, 1997; Бухарин, 2002).
Кроме того, среди этих микроорганизмов встречаются патогенные варианты, способные вызывать поражения мочеполовой системы, бактериальные эндокардиты и бактериемии у людей. Гемолизирующие энтерококки также способны вызывать пищевые отравления и дисбактериозы кишечника (Cassell, 1997; Смирнов, 2000; Kurup, Tee, Loo, Lin, 2001; Макушенко, 2002; Тюрин, 2004).
У животных энтерококки вызывают гастроэнтериты, пневмонии, маститы, эндокардиты, менингиты, септоцемию и другие заболевания (Панин, 1991; Субботин, 2001; Колычев, Петрова, Лазарева, 2006; Иващук, 2006).
Энтерококки в настоящее время являются одними из самых часто встречающихся возбудителей нозокомиальных инфекций. Тем не менее, наибольшую опасность вызывает не столько широкая распространенность этих микроорганизмов, сколько их устойчивость к большому спектру антибактериальных препаратов (Bell, Paton, Turnidge, 1998; Сидоренко, 2003; Hershberger et al., 2005; Kolar et al., 2005). Поскольку из патологического материала чаще всего выделяют E.faecalis, то в большинстве случаев приходиться идентифицировать именно этот вид.
Все вышесказанное обуславливает актуальность своевременной индикации и идентификации изучаемых микроорганизмов. При использовании бактериологических методов идентификация занимает длительное время. Хотя современные методы лабораторной диагностики (Braak et al., 2001; Drews et al., 2006) и являются высокоспецифичными и чувствительными, сложность методик, требования к квалификации персонала, высокая стоимость оборудования и реактивов делает их недоступными для многих бактериологических лабораторий на данный момент.
Таким образом возникает необходимость изыскания специфичных и менее трудоемких методов исследования. Благодаря специфичности действия бактериофаги используются для определения видовой принадлежности микроорганизмов, индикации бактерий в объектах внешней среды, диагностики инфекционных заболеваний.
Цель исследования
Разработка технологии изготовления и применения биопрепарата энтерококковых бактериофагов для идентификации и индикации бактерий вида Enterococcus faecalis в объектах внешней среды.
Задачи исследования
-
Выделить бактериофаги, активные в отношении бактерий вида E.faecalis.
-
Изучить основные биологические свойства выделенных изолятов бактериофагов: морфологию негативных колоний, морфологию фаговых корпускул, литическую активность, диапазон литической активности, специфичность действия, температурную устойчивость, чувствительность к воздействию хлороформа.
-
Отобрать штаммы фагов с заданными биологическим свойствами – высокой литической активностью (титр), широким диапазоном литического действия, выраженной видовой специфичностью, более высоким, чем у бактерий порогом инактивации – для конструирования биопрепарата.
-
Разработать оптимальные параметры идентификации энтерококков с помощью выделенных бактериофагов.
-
Разработать параметры ускоренной индикации бактерий вида E.faecalis в объектах внешней среды с помощью реакции нарастания титра фага.
-
Разработать технологические параметры изготовления и контроля биопрепарата энтерококковых бактериофагов.
Научная новизна
Впервые выделены бактериофаги, активные в отношении штаммов бактерий вида E.faecalis, патогенных для животных.
Изучены основные биологические свойства новых изолятов фагов.
Разработаны параметры идентификации и индикации бактерий вида E.faecalis в объектах внешней среды с помощью бактериофагов.
Впервые определена технология изготовления биопрепарата бактериофагов бактерий вида E.faecalis.
Доказана эффективность использования биопрепарата для индикации и идентификации бактерий вида E.faecalis в условиях производства.
Практическая значимость
Выделенные бактериофаги депонированы во Всероссийском государственном центре качества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов (№ 801/15 и № 802/15 от 24 апреля 2009 года), признаны перспективными и рекомендованы для изготовления диагностических и лечебно-профилактических препаратов.
Разработана «Инструкция по изготовлению и контролю серии бактериофагов E.faecalis EF – 4 УГСХА и EF – 5 УГСХА», предложены «Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий вида E.faecalis из патологического материала, пищевых продуктов, кормов и объектов внешней среды с применением диагностических бактериофагов EF – 4 УГСХА, EF – 5 УГСХА» и «Методические рекомендации по ускоренной индикации методом реакции нарастания титра фага бактерий вида E.faecalis в патологическом материале, пищевых продуктах, кормах и объектах внешней среды», одобренные Научно-техническим советом Ульяновской ГСХА и утвержденные ректором академии (16 июня 2009 года).
Материалы диссертационных исследований используются при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий по биотехнологии, вирусологии, микробиологии для студентов факультета ветеринарной медицины Ульяновской ГСХА, а также при выполнении тем научно-исследовательских работ.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Разработанная схема выделения энтерококковых бактериофагов позволяет обнаружить и изолировать фаги E.faecalis из объектов внешней среды.
-
Изученные биологические свойства бактериофагов E.faecalis дают возможность применять отобранные изоляты с диагностической целью.
-
Разработанная схема фагоидентификации бактерий вида E.faecalis с применением бактериофагов EF – 4 УГСХА и EF – 5 УГСХА ускоряет определение видовой принадлежности энтерококков.
-
Разработанные технологические параметры РНФ с использованием фагов EF – 4 УГСХА и EF – 5 УГСХА значительно сокращают сроки обнаружения гомологичных бактерий в исследуемых объектах.
-
Разработанные технологические параметры изготовления бактериофагов позволили получить фаговый биопрепарат с высокой литической активностью, широким диапазоном действия, строгой видовой специфичностью.
Апробация работы
Материалы работы доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Аграрная наука и образование в реализации национального проекта «Развитие АПК» (Ульяновск, 2006); Международных научно-практических конференциях: «Молодежь и наука XXI века» (Ульяновск, 2006), «Роль молодых ученых в реализации национального проекта «Развитие АПК» (Москва, 2007), «Ломоносов-2008» (Москва, 2008), «Актуальные вопросы аграрной науки и образования» (Ульяновск, 2008), «Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел» (Москва, 2008), «Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных» (Покров, 2008); Международном конгрессе МАКМАХ / ESCMID по антимикробной терапии (Москва, 2009); Молодежном инновационном форуме Приволжского федерального округа (Ульяновск, 2009); Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи (Москва, 2009).
Результаты изучения биологических свойств бактериофагов ЕF – 4 УГСХА, ЕF – 5 УГСХА и индикации бактерий вида E.faecalis в объектах внешней среды методом РНФ подтверждены актами комиссионных испытаний в Ульяновской ГСХА (14 – 16 апреля 2009 года), во Всероссийском государственном центре качества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов (22 – 25 апреля 2009 года); актами производственных испытаний на базе бактериологического отдела ОГУ «Ульяновская областная ветеринарная лаборатория» (18 – 22 мая 2009 года).
Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГУ ВПО «Ульяновская ГСХА».
Публикации
По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них 2 – в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения и список использованных литературных источников (145 всего, в том числе 65 зарубежных авторов). Работа изложена на 154 страницах текста, иллюстрирована 37 таблицами, 16 рисунками и дополнена приложениями.
