Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы иммунобиологические препараты: применение в практике здравоохранения и технологии приготовления 21
1.1. Сферы применения иммунобиологических препаратов 21
1.1.1. Биопрепараты в акушерско-гинекологической практике 22
1.1.2. Применение препаратов в терапевтической стоматологии 26
1.1.3. Пробиотики в лечении больных с кранио-фациальной патологией 28
1.1.4. Комплексное лечение некоторых заболеваний ЛОР-органов и легких 30
1.1.5. Лечение больных атопическим дерматитом 33
1.1.6. Биопрепараты при острых кишечных инфекциях и дисбактериозах кишечника 34
1.2. Состав и лекарственные формы биопрепаратов 43
1.2.1. Колисодержащие биопрепараты 44
1.2.2. Бифидосодержащие препараты 47
1.2.3. Биопрепараты на основе лактобацилл 50
1.2.4. Споровые биологические препараты 53
1.2.5. Иммуноглобулиновые и интерфероновые препараты 54
1.3. Анализ технологий приготовления сухих биопрепаратов... 56
1.3.1. Способы обезвоживания биоматериалов 56
1.3.1.1. Получение сухих материалов методом распылительной сушки 57
1.3.1.2. Сублимационное высушивание биопрепаратов.. 59
1.3.1.3. Сорбционно-контактное обезвоживание биопрепаратов 61
1.3.2. Технологии получения сухих биопрепаратов 64
1.3.2.1. Способы приготовления таблеток 64
1.3.2.2. Технология приготовления порошков и капсул в производстве биопрепаратов 66
1.3.2.3. Псевдосухие материалы в технологии 69 приготовления биопрепаратов
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 71
2.1. Материалы 71
2.1.1. Микроорганизмы 71
2.1.2. Питательные и защитные среды 71
2.1.3. Биоматериалы, материалы и реактивы 73
2.1.4. Экспериментальные животные 75
2.2. Методы исследований 76
2.2.1. Культивирование микроорганизмов, концентрирование биомассы и введение защитных сред 76
2.2.2. Микробиологические методы 77
2.2.3. Иммунохимические методы 79
2.2.4. Физико-химические методы 80
2.2.5. Физические методы 81
2.2.6. Планирование эксперимента и статистическая обработка результатов 82
Результаты исследований и их обсуждение
ГЛАВА 3. Формирование микрокапельного порошка ... 84
3.1. Микрокапельный порошок как дисперсная система 84
3.2. Устройство для приготовления микрокапельных порошков 91
3.3. Обоснование требований к размерам микрокапель в порошке 94
ГЛАВА 4. Исследование технологических параметров переработки системы аэросил суспензия в электромагнитном диспер гаторе 100
4.1. Обоснование показателей состояния системы аэросил-жидкость при получении микрокапельных порошков 100
4.2. Изучение зависимости выживаемости микроорганизмов от режимных параметров процесса образования микрокапельных порошков в ЭМД 105
ГЛАВА 5. Исследование процесса сорбционно контактного обезвоживания микрокапельных порошков 125
5.1. Обоснование методического подхода обезвоживания микрокапельного порошка при контакте с влагоемким сорбентом 125
5.1.1. Выбор типа сорбента для контактного обезвоживания микроканельных порошков 126
5.1.2. Исследование основных закономерностей процесса с использованием модельного микроорганизма 131
5.2. Сорбционно-контактное обезвоживание МП энтеральных микроорганизмов 139
ГЛАВА 6. Конструирование комплексных биопрепаратов 146
6.1. Обоснование компонентного состава комплексного препарата КИП и В. adolescentis МС-42 146
6.2. Приготовление сухого биопрепарата комплекса иммуноглобулинов и бифидобактерий 148
6.3. Обоснование методического подхода к конструированию биопрепарата КИП и L. acidophilus (смесь штаммов NKb
100аш,К3Ш24) 152
6.3.1. Исследование основных закономерностей конвек тивной сушки МП при атмосферном давлении 153
6.3.2. Выбор компонентного состава комплексного биопрепарата 167
6.3.3. Приготовление комплексного препарата КИП и L. acidophilus (смесь штаммов NKb ЮОаш, К3Ш24) 168
ГЛАВА 7. Исследование защитных свойств структур ного компонента препарата 175
7.1. Оценка гигроскопичности сухого препарата, полученного
из микрокаиельного порошка 175
7.2. Изучение in vitro защитного эффекта аэросила при моделировании воздействия неблагоприятных факторов пищеварительной системы 177
7.3. Рентгенография прохождения капсулами верхних отделов желудочно-кишечного тракта обезьян 185
ГЛАВА 8. Доклинические испытания комплексного препарата кип и в. adolescentis МС-42 190
8.1. Оценка острой токсичности биопрепарата 190
8.2. Изучение безвредности и терапевтической эффективности препарата КИП и В. adolescentis МС-42 на обезьянах 190
Заключение 206
Выводы 215
Практические рекомендации 217
Список литературы
- Применение препаратов в терапевтической стоматологии
- Питательные и защитные среды
- Устройство для приготовления микрокапельных порошков
- Исследование основных закономерностей процесса с использованием модельного микроорганизма
Введение к работе
Актуальность проблемы
Важное значение симбиотической микрофлоры для организма человека к настоящему времени общепризнанно и обосновано результатами многочисленных исследований (Перетц Л.Г., 1955; Шендеров Б.А., 1998; Bongle D. et al., 1999).
Симбиотическая микрофлора составляет основу микроэкологии человека. Все сообщающиеся с внешней средой полости тела человека, а также кожные покровы заселены микроорганизмами, которые представлены несколькими сотнями видов бактерий, без учёта одновременной персистенции вирусов, простейших, грибов (Воробьев А.А. с соавт., 1998; Luckey T.D., 1987; Onderdonk А.В. et at., 1993).
Нарушения качественного и количественного состава симбиотической микрофлоры объединяются термином "дисбактериоз" (Грачева Н.М. с соавт., 1986; Воробьев А.А. с соавт., 1998).
В современных условиях на фоне частого воздействия неблагоприятных экологических факторов и широкого распространения в повседневной практике противомикробных лекарственных средств, дисбиотические нарушения микрофлоры носят массовый характер и выявляются практически среди всех слоев населения (Ногаллер A.M. с соавт., 1991; Вавилова О.В., 2000).
Для коррекции дисбиотических нарушений микрофлоры применяется целый комплекс лечебных мероприятий с учетом клинических проявлений основного заболевания и степени выраженности дисбактериоза, а также данных лабораторных исследований микрофлоры биотопа и состояния реактивности организма. Однако основную роль играет дифференцированное применение различных иммунобиологических препаратов, в том числе пробиотиков, являющихся наиболее физиологичными для коррекции микрофлоры и профилактики дисбиотических изменений, а также препаратов, применяемых для повышения резистентности организма, восстановления иммунного статуса (Грачева Н.М. с соавт., 1986; Алешкин В.А с соавт., 2000).
Вместе с тем, до настоящего времени в производстве сухих биопрепаратов единственным широко используемым методом стабилизации свойств биологических субстанций остается сублимационное (лиофильное) высушивание. Этот способ, обеспечивая высокое качество продукта, отличается чрезмерной длительностью (до 2 суток), а получаемая сухая субстанция без дополнительной переработки непригодна для приготовления сухих дозированных форм препаратов (Халенева М.П., 1984; Несчисляев В.А„ 2005). Кроме того, получаемые с использованием этого способа высушивания пероральные препараты на основе живых пробиотических микроорганизмов нуждаются в защите от кислотно-ферментного комплекса пищеварительной системы. По-видимому, этим, а также стремлением придать биологическому началу новые фармакокинетические свойства (повышенную
биодоступность и защищенность от воздействия неблагоприятных факторов хранения и применения), объясняется появление разработок, направленных на создание технологий с иммобилизацией биокомпонентов, которая осуществляется сорбцией на различных носителях (Бородин Ю.И. с соавт., 1998; Молокеев А.В. с соавт., 2001; Бартоломойз И. с соавт., 2003; Вайншток И.И. с соавт., 2007).
Одним из вариантов современной технологии с наименьшим количеством стадии и продолжительностью является описанный в патентной литературе способ с непосредственным обезвоживанием биомассы пробиотических микроорганизмов моно - или поликомпонентного состава сорбентами (Нахабин И.М. с соавт., 1996; Ходак В.И. с соавт., 1998). Высушивание биомассы и приготовление препарата происходит на одной технологической стадии. Однако вследствие прямого контакта биомассы с сорбентом выживаемость клеток пробиотических микроорганизмов не превышает 10-20%. Отсутствуют также сведения о принципиальной возможности и эффективности применения такого способа для получения сухих биопрепаратов немикробной природы (например, иммуноглобулинов).
Таким образом, не существует современной технологии приготовления пероральных иммунобиологических препаратов, отличающейся универсальностью в плане возможности переработки биологических компонентов различной природы. Вместе с тем рациональное использование особых свойств нового вида биологического материала - микрокапельного порошка в сочетании с обоснованным выбором обезвоживания создают предпосылку для разработки такой технологии. Однако системных исследований в этом направлении не проводилось, что и определило актуальность данной работы.
Цель исследования: На модели микроорганизмов Bifidobacterium adolescentis МС-42, Lactobacillus acidophilus (смесь штаммов NKj, 100am, К3Ш24) и иммуноглобулиновых комплексов типа КИП экспериментально обосновать новый концептуальный принцип и практические подходы к конструированию и технологии приготовления сухих комплексных биопрепаратов для профилактики и лечения заболеваний, ассоциированных с дисбалансом нормофлоры желудочно-кишечного тракта.
Задачи исследования:
1. На основе анализа и в эксперименте идентифицировать микрокапельный
порошок как дисперсную систему, определить его основные свойства и требования к
размерам микрокапель жидкости. Обосновать выбор устройства для приготовления
микрокапельного порошка.
2. Определить технологические показатели состояния системы аэросил-
биообъект, исследовать устойчивость биообъектов к механическим нагрузкам,
возникающим при диспергировании жидкой субстанции, и выбрать оптимальный
режим приготовления микрокапельных порошков в электромагнитном диспергаторе.
-
Определить требования к сорбенту как структурному элементу и биологически активному компоненту препарата и на примере модельного микроорганизма обосновать методический подход к проведению процесса сорбционно-контактной сушки микрокапелыюго порошка. Доказать общность установленных положений при обезвоживании микрокапельных порошков микроорганизмов и КИП.
-
Исследовать основные закономерности конвективной сушки микрокапельного порошка при атмосферном давлении. Обосновать компонентный состав и методический подход к конструированию биопрепаратов на основе комплекса сывороточных иммуноглобулинов и пробиотических микроорганизмов.
5. В экспериментах in vitro исследовать защитные свойства структурного
компонента препарата - наноразмерного разобщителя аэросила.
6. Оценить нетоксичность и безвредность комплексного биопрепарата КИП и В.
adoiescentis МС-42 в экспериментах на мелких лабораторных животных и здоровых
приматах. Изучить терапевтическую эффективность препарата при лечении обезьян,
больных острой кишечной инфекцией с диарейным синдромом.
Научная новизна
Получены знания о структуре, основных свойствах и способе получения нового вида биоматериала - микрокапельного порошка, образующегося при диспергировании биологической жидкости во взвешенном слое наноразмерного разобщителя аэросила. Наиболее эффективно процесс формирования порошка протекает в электромагнитном диспергаторе, принцип действия которого основан на передаче энергии вращающегося электромагнитного ноля рабочим ферромагнитным телам, осуществляющим механическое дробление жидкости.
Показано, что степень инактивации биокомпонента при диспергировании жидкой субстанции обусловливается его восприимчивостью к механическим нагрузкам. Наиболее чувствительными оказались клетки L. acidophilus (смесь штаммов NKb ІООаш, К3Ш24) и В. adoiescentis МС-42, клетки Е. coli М-17 занимают промежуточное положение, и наименее чувствительным является энтерококк Е. faecium ГНКИ-27. Значительно большей механоустойчивостыо, чем энтеральные микроорганизмы, обладают сывороточные иммуноглобулины трех основных классов (IgG, IgA и IgM) в растворе КИП.
Доказано, что закономерности протекания процесса сорбционно-контактной сушки микрокапельного порошка являются общими для биологических субстанций различной природы. При этом гибель клеток энтеральных микроорганизмов независимо от их видовой принадлежности составляет от 30 до 70%, а наибольшее снижение антисальмонеллезиой активности иммуноглобулинов - одно двукратное разведение.
Впервые проведенными исследованиями атмосферного обезвоживания микрокапельных порошков бифидобактерий и лактобацилл установлено, что температура осушающего воздуха не должна превышать 35-40С, то есть величин,
близких к оптимальной температуре роста этих микроорганизмов, во избежание интенсивной гибели клеток как в процессе конвективного обезвоживания, так и последующего досушивания сорбционио-контактиым методом.
Исследованиями in vitro впервые показан защитный эффект аэросильной оболочки, проявляющийся в затруднении доступа к сухому биологическому началу паров воды из воздуха и агрессивных составляющих желудочного и кишечного соков, и таким образом обеспечивающий негигроскопичность препарата и повышенную биодоступность бактериального компонента.
Впервые проведенными доклиническими испытаниями комплексного биопрепарата КИП и В. adolescents МС-42 показана его нетоксичность и безвредность для приматов, а также 100% терапевтическая эффективность при лечении обезьян, больных острой кишечной инфекцией с диарейным синдромом. Исчезновение клинических проявлений заболевания сопровождалось выраженными положительными изменениями в микробиоценозе желудочно-кишечного тракта обезьян - повышением содержания нормальных Е. coli, существенным снижением количества таких условно-патогенных микроорганизмов, как Staph, epidermis, представители родов Enterococcus, Proteus, Klebsiella, и полной элиминацией Citrobacter.
Теоретическое значение работы
Обоснован концептуальный принцип разработки биопрепаратов нового поколения для коррекции дисбиотических нарушений в биотопах организма, базирующийся на сочетании в одной лекарственной форме обогащенных иммуноглобулиновых комплексов типа КИП с микробными пробиотиками, обладающими широким спектром и высоким уровнем антагонистической активности в отношении как патогенных, так и условно-патогенных возбудителей заболеваний.
Предложен метод конструирования сухих биопрепаратов, заключающийся в использовании особых свойств микрокапельного порошка и обеспечивающий получение препаратов перорального применения на основе биологических субстанций различной природы. Этот метод может быть использован в дальнейшем при разработке иммунобиологических препаратов для профилактики и терапии других заболеваний.
Практическая значимость
Предложен новый вид биологических материалов - микрокапельный порошок, относящийся к трехфазным микрогетерогенным дисперсным системам и обладающий вследствие особой структуры одновременно свойствами сухого порошка и жидкого аэрозоля, что существенно расширяет возможности его технологической переработки и обусловливает наличие улучшенных фармакокинетических свойств у сухого препарата.
Разработан способ обработки материалов и конструкция электромагнитного диспергатора для осуществления технологического процесса получения
микрокапельного порошка биологических жидкостей. Предложена упрощенная методика перехода при переработке суспензий микроорганизмов различных видов, базирующаяся на общей для большинства бактерий закономерности экспоненциальной их гибели с увеличением интенсивности механического воздействия.
Аналитически и экспериментально выдвинут ряд требований к физическим, физико-химическим и биологическим характеристикам сорбента, позволяющих обосновать его выбор в качестве структурного элемента сухого биопрепарата, получаемого сорбционно-контактной сушкой микрокапельного порошка.
Введение в технологическую схему двухэтапной стадии обезвоживания микрокапельных порошков приводит к несущественному увеличению длительности технологического цикла, обеспечивая повышение выживаемости бифидобактерий и лактобацилл до 50-70% и сохранение без потери антисальмопеллезной активности сывороточных иммуноглобулинов. Полученные результаты по выживаемости микроорганизмов не уступают, а по соханению специфической активности иммуноглобулинов превосходят результаты их лифильного обезвоживания.
Защита аэросильной оболочкой сухого биологического начала от воздействия влаги воздуха и агрессивных составляющих желудочного и кишечного соков обеспечивает следующие преимущества. Во-первых, исключается необходимость проведения специальных мероприятий, направленных на предотвращение гидратации препарата при выполнении технологических операций, что упрощает и удешевляет технологию в целом, а во-вторых, снижается инактивация биокомпонента при прохождении верхних отделов желудочно-кишечного тракта, что делает возможным уменьшение доз лекарственных веществ в препарате для достижения адекватного терапевтического эффекта.
С использованием разработанного метода сконструированы комплексные биопрепараты КИП и В. adolescentis МС-42, КИП и L acidophilus (смесь штаммов NK|,
100ашиК3Ш24).
Внедрение результатов работы
На базе лаборатории медицинской биотехнологии ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора разработаны и приготовлены экспериментальные серии комплексных биопрепаратов КИП и В. adolescentis МС-42, КИП и L. acidophilus (штаммы NK|, ЮОаш и К3Ш24).
На основании проведенных исследований оформлено 10 патентов на изобретения:
-
Пат. 1831801 СССР, B01F 13/08. Устройство для обработки материалов / ИЛО. Давыдкин, Ю.П. Давыдкин, В.Ю. Давыдкин, В.М. Блинов, С.Д. Никитинский (СССР). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 13.10.1992. Патентообладатель коллектив авторов.
-
Пат. 2026730 РФ, ВО IF 13/08. Способ обработки материалов / И.Ю. Давыдкин, Ю.П. Давыдкин, В.Ю. Давыдкин, В.М. Блинов, С.Д. Никитинский (РФ).
Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.01.95. Патентообладатель коллектив авторов.
-
Пат. 2161887 RU, A23D 9/00. Биологическая активная добавка / В.А. Алсшкин, С.С. Афанасьев, В.Ю. Давыдкин, О.В. Рубальский, И.Ю. Давыдкин, Г.И. Ханина, А.Г. Гаврин, А.В, Алешкин, Л.А. Денисов, Д.С. Афанасьев, М.С. Афанасьев (RU). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.01.2001. Патентообладатель коллектив авторов.
-
Пат. 2164765 RU, A23L 1/30. Биологически активная добавка / В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, О.В. Рубальский, В.Ю. Давыдкин, Л.А. Денисов, И.Ю. Давыдкин, А.Г. Гаврин, А.В. Алешкин, Д.С. Афанасьев, М.С. Афанасьев (RU). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10.04.2001. Патентообладатель коллектив авторов.
-
Пат. 2240136 RU, А61К 39/395. Композиция, содержащая иммуноглобулины и целевые добавки / В.А. Алешкин, С.С, Афанасьев, В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин, А.Г. Гаврин, О.В. Рубальский, А.В. Мелихова, И.В. Борисова, М.С. Афанасьев, Л.И. Новикова (RU). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.11.2004. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.
6. Пат. 2247578 RU, А61К 39/395. Состав, обладающий противомикробным
действием / А.В. Мелихова, В.А. Алешкин, В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин, С.С.
Афанасьев, И.В. Борисова, О.В. Рубальский, А.Г. Гаврин (RU). Зарегистрирован в
Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10.03.2005.
Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.
7. Патент РФ JS& 2371200, МПК А61К 39/395. Способ получения
иммуноглобулинового препарата / Мелихова А.В., Давыдкин В.Ю., Алешкин В.А.,
Давыдкин И.Ю. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской
Федерации 27.10.2009. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского
Роспотребнадзора.
-
Пат. 2317064 RU, МПК А61К 6/00. Способ определения защитного действия покрытия капсул от содержимого желудка / Алешкин В.А., Лапин Б.А., Афанасьев С.С, Джикидзе ЭХ, Сішавонян К.В., Давыдкин В.Ю,, Давыдкин И.Ю., Холодилова Л.И., Мелихова А.В., Трофимова Л.И., Кебу Т.И., Калашникова В.А., Егорова Т.П. (RU). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.04.2008. Патентообладатели ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, ГУ НИИ МП РАМН.
-
Пат. 2317065 RU, МПК А61К 6/00. Способ определения целевой доставки в желудочно-кишечном тракте твердой лекарственной формы с защитным покрытием / Алешкин В.А., Лапин Б.А., Давыдкин В.Ю., Джикидзе Э.К., Мелихова А.В., Симавонян К.В., Рубальский О.В., Давыдкин И.Ю. (RU). Зарегистрирован в
Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.02.2008. Патентообладатель коллектив авторов.
10. Пат. 2322506 RU, МІЖ C12Q 1/02. Способ определения защитного действия покрытия капсул для штамма Bifidobacterium adolescentis МС42 от содержимого желудка / Алешкин В.А., Лапин Б.А., Афанасьев С.С., Джикидзе Э.К., Симавонян К.В., Давыдкин В.Ю., Давыдкин И.Ю., Воропаева Е.А., Рубальский О.В., Холодилова Л.И., Мелихова А.В., Трофимова Л.И., Кебу Т.И., Байракова А.Л., Калашникова В.А., Афанасьев М.С., Егорова Т.П. (RU). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.04.2008. Патентообладатели ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, ГУ НИИ МП РАМН.
Результаты исследований использованы в ОКБ А (г. Йошкар-Ола) при разработке и испытаниях аквабиодиспергатора на базе плоских двухсторонних индукторов, а также ОНОПБ (п. Восточный) при отработке промышленной технологии получения препаратов ветеринарного и медицинского назначения. Акты внедрения от 26 ноября 1991 г. и 22 октября 1992 г.
Экспериментальная серия комплексного биопрепарата КИП и В. adolescentis МС-42 прошла успешные доклинические испытания при лечении больных ОКИ обезьян в питомнике ГУ НИИ медицинской приматологии РАМН (г. Сочи - Адлер) под руководством академика РАМН, профессора Б.А. Лапина и доктора медицинских наук, профессора Э.К. Джикидзе. Акт о доклинических испытаниях от 9 апреля 2009г.
Методика доклинических испытаний биопрепаратов, разработанная в ходе выполнения работы совместно с сотрудниками ГУ НИИ медицинской приматологии РАМН, легла в основу разработки «Новые алгоритмы доклинических испытаний неинъекционных иммунобиологических препаратов и БАД», награжденной серебряной медалью VII Московского международного салона инноваций и инвестиций на ВВЦ (Москва) в 2007 г.
Разработан лабораторный регламент приготовления комплексного биопрепарата КИП и В. adolescentis МС-42.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Разработанная универсальная технология приготовления сухих энтеральных биопрепаратов позволяет перерабатывать жидкие биологические субстанции различной природы и основана на переводе субстанций в устойчивое микрокапелыюе состояние в виде высокодисперсного порошка, что, в свою очередь, позволяет использовать различные интенсивные, в том числе и комбинированные, способы обезвоживания для получения сухих биопрепаратов.
-
Структурный компонент препарата - аэросил оказывает защитный эффект, проявляющийся в ограничении доступа к сухому биокомпоненту паров воды из воздуха и агрессивных составляющих желудочного и кишечного соков, в результате чего препарат приобретает повышенную устойчивость к неблагоприятным факторам пребывания в атмосфере воздуха и прохождения желудочно-кишечного тракта.
3. Концепция разработки биопрепаратов нового поколения для коррекции дисбнотических нарушений в микробиоценозе желудочно-кишечного тракта базируется на конструировании комплексных препаратов на основе сочетания обогащенных иммуноглобулиновых комплексов типа КИП с микробными пробиотиками, в совокупности обладающими широким спектром и высоким уровнем антагонистической активности в отношении как патогенных, так и условно-патогенных возбудителей заболеваний.
Апробация работы:
Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора 28 апреля 2009 г. протокол № 4.
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на VII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, 2000); VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (г. Москва, 2002); Международной научно-практической конференции памяти Г.И. Гончаровой «Пробиотичсские микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования» (г, Москва, 2002); IX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, 2002); 1-м международном Конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (г. Москва, 2002); Третьей международной конференции, посвященной 80-летию института имени Пастера, «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (г. Санкт-Петербург, 2003); И-м Московском международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (г. Москва, 2003); Научно-практической конференции «Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения» (г. Москва, 2003); XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, 2004); Международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» (г. Москва, 2004); Симпозиуме «Лабораторные приматы цпя решения актуальных проблем медицины и биологии» (г. Москва, 2004); Третьей международной конференции «Высокие медицинские технологии XXI века» (г. Бенидорм, Испания, 2004); Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы совершенствования технологии производства и переработки продукции сельского хозяйства» (г. Йошкар-Ола, 2005); Всероссийской научной конференции «Перспективные направления использования лабораторных приматов в медико-биологических исследованиях» (г. Сочи-Адлер, 2006); Всероссийской конференции, посвященной 75-летию со дня открытия Чувашской государственной сельскохозяйственной академии (г. Чебоксары, 2006); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (г. Москва, 2007); Международной научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии в опытах на обезьянах» (г. Сочи-Адлер, 2007); Юбилейной Всероссийской научно-
практической конференции "Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения'1 (г. Н.Новгород, 2009).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 60 печатных работ, в том числе: 7 в изданиях, рекомендованных ВАК Российской Федерации, 6 - в периодических изданиях, 4 - в сборниках научных трудов, 32 - в материалах конференций, разделы в 1 монографии, 10 патентов РФ на изобретения.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на русском языке и состоит из введения, 8 глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Общий объем диссертации 271 страница. Работа иллюстрирована 43 таблицами и 41 рисунком. Список литературы включает 474 работы, в том числе 378 - отечественных и 96 - иностранных авторов.
Применение препаратов в терапевтической стоматологии
Самостоятельную проблему бактериотерапии в области стоматологии представляет разработка способов санации ороназофарингеальной области (ОНФО) у пациентов, подвергающихся хирургическому лечению по поводу врождённых пороков развития лица и челюстей. Врождённые расщелины верхней губы и нёба являются одним из наиболее распространённых пороков развития; их частота составляет, по данным разных авторов, от 1:500 до 1:800 и имеет явную тенденцию к нарастанию [288, 374]. Объективные условия для своевременного и успешного хирургического лечения таких больных связаны с рядом неблагоприятных факторов, устранение которых составляет ведущую задачу всей проблемы эффективной реабилитации. Все эти факторы прямо или косвенно обусловлены нарушениями естественного процесса становления 1 симбиотической микрофлоры, резкими отклонениями показателей бактериоценоза от физиологической нормы.
Оценку эффективности включения микробных биопрепаратов в комплексную терапию больных с врождённой кранио-фациальной патологией на разных этапах оперативного лечения для обеспечения наиболее благоприятных условий заживления операционных ран, с учётом выявляемых дисбиотических нарушений, проводили с участием 289 пациентов.
Как свидетельствовали результаты клинико-бактериологических исследований, у всех детей с врождённой кранио-фациальной патологией имел место дисбактериоз полости рта, выражающийся в снижении количества лактобацилл и бифидобактерий, частом выделении кишечной палочки, золотистого стафилококка и реже - грибов рода Кандида. Дисбактериоз полости рта сопровождался дисбактериозом кишечника, преимущественно третьей степени. Применение традиционных методов антибиотикотерапии для профилактики послеоперационных гнойно-воспалительных осложнений у таких больных нецелесообразно. Постоянство дисбиотических нарушений ОНФО и кишечника у детей с врождённой кранио-фациальной патологией определяет необходимость коррекционной бактериотерапии на разных этапах хирургического лечения [1, 196, 287, 373].
Результаты проведённых наблюдений позволили рекомендовать следующую схему применения биопрепаратов в тактике лечения больных с врождённой кранио-фациальной патологией: 1) в предоперационном периоде при отсутствии клинических проявлений дисбактериоза и неглубоких нарушениях микрофлоры показан приём ацилакта по 2,5-5 доз 2 раза в сутки на протяжении месяца до операции; возможно применение примадофиліоса по 3,0 г 1 раз в сутки; в случае выраженных клиничесішх и бактериологических проявлений дисбактериоза (например, при упорном выделении клебсиелл) проводится курс деконтаминации полимиксином- в возрастной дозе в течение 7 дней с одновременным приёмом ацилакта и последующим применением пробиотика в течение месяца до операции; 2) в послеоперационном периоде местное применение ацилакта проводится в виде пропитывания тампонов и орошения полости рта и носа 5 дозами препарата во время перевязок; одновременно продолжается пероральный приём ацилакта по 5 доз 2 раза в день в течение одного месяца; применение антибиотиков с профилактической целью не показано; исключение составляют дети после костной пластики с применением трансплантантов, где антибактериальная терапия проводится с одновременным применением пробиотиков. С учётом механизма санирующего действия ацилакта, основанного на селективной деконтаминации от возбудителей инфекции и восстановлении защитной симбиотической микрофлоры, разработанный способ профилактики послеоперационных осложнений при пластике нёба может оказаться эффективным и при других видах оперативных вмешательств в полости рта как у детей, так и у взрослых пациентов. 1.1.4. Комплексное лечение некоторых заболеваний ЛОР-органов и легких
Еще несколько десятилетий назад хламидийная инфекция была в основном представлена хроническим конъюнктивитом, трахомой, урогенитальными заболеваниями [70, 85, 150]. В современных условиях респираторный хламидиоз приобрел особую актуальность в связи со значительной распространенностью среди часто болеющих респираторными заболеваниями детей [85, 112]. Наличие даже локальных проявлений хламидиоза и стафилококковой инфекции свидетельствует о патологии иммунной системы, снижении колонизационной резистентности, по крайней мере, в соответствующем биотопе [156, 186, 432].
Разработанными в МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского биопрепаратами лечили 756 детей (435 мальчиков и 321 девочка) в возрасте от 2 до 14 лет с хроническими и рецидивирующими заболеваниями лимфаденоидного кольца глотки (218 детей с рецидивирующим ринофарингитом, 195 детей с хроническим аденоидитом, 204 ребенка с хроническим тонзиллитом, 139 детей с хроническим фарингитом). Все больные дети получали единую базовую терапию: интерфероновую мазь интраназалыю 2 раза в день, закапывание в нос взвеси ацидофильных лактобацилл по 6-8 капель 3 раза в день, орошение зева взвесью ацидофильных лактобацилл 1 раз в день. Дополнительно к этому часть детей в каждой нозологической группе получала ингаляцию интерферона на глицерине 1 раз в день, другая группа -смазывание ротоглотки интерфероном на: глицерине 3 раза в день. В нозологической группе больных хроническим тонзиллитом (третья группа) -интралакунарное введение интерферона на глицерине после предварительного промывания лакун физиологическим раствором 1 раз в день. Длительность лечения - 10 дней. При этом исключалось применение антибиотиков, диоксидина, протаргола, хлоргексидина биглюконата, физиотерапевтических процедур.
Питательные и защитные среды
Преципитацию в геле по Оухтерлони проводили в соответствии с [133] в 1 % агаре, используя при этом моноспецифические антисыворотки к IgG, IgA, IgM человека.
Иммуноэлектрофорез проводили в соответствии с [56]. На стеклянную пластину размером 9x12 см наносили 15 мл расплавленного раствора агара и после его застывания пробивали лунки и траншеи с помощью специального трафарета, штампа диаметром 3 мм и резака. Из лунок удаляли агар, после чего в них вносили исследуемые образцы. Электрофорез проводили на аппарате Multifor LKB в течение 1,0-1,5 ч при силе тока 40 мА и напряжении 200 В. По окончании электрофореза из траншей вынимали агар, заливали соответствующие антисыворотки и оставляли пластину во влажной камере при комнатной температуре в течение 18-24 часов для инкубации. Окончательный учет результатов проводили после окрашивания пластины.
Определение концентрации иммуноглобулинов в образцах проводили методом РИД по Манчини [133] в 1% агарозе. В качестве стандарта использовали стандартную сыворотку крови человека. Для построения калибровочной кривой использовали разведения стандартной сыворотки в 8, 4, 2 раза и без разведения. Подсчет результатов проводили с помощью прикладной программы для персональных компьютеров (РИД-3 и РИД-4), разработанной профессором Л.В. Козловым (МНИИЭМ им Г.Н. Габричевского).
Определение антисальмонеллезной активности осуществляли методом РПГА с помощью соответствующих диагностикумов согласно инструкциям производителя в соответствии с [303].
Концентрацию белка в образцах определяли спектрофотометрически на СФ-46 или КФК-3-01 [56]. Для этого измеряли оптическую плотность исследуемого белкового раствора при 280 и 260 нм. Затем рассчитывали концентрацию белка по формуле Калькара: С = 1,45 хОД280-0,74 хОД260 , где С - концентрация белка, мг/мл; ОД280 показатель оптической плотности раствора при 280 нм; ОД2бо — показатель оптической плотности раствора при 260 нм.
Содержание липидов в образцах определяли с помощью адаптированной тест-системы Bio-Laest Lachema для общих липидов. Оптическую плотность пробы и стандартного раствора против контрольного раствора измеряли на КФК-3-01 при 540 нм. Расчет содержания липидов осуществляли по формуле: C = 8x(A,/Az), где С - концентрация общих липидов, г/л; А] - оптическая плотность пробы; А2 - оптическая плотность стандарта. 2.2.4. Физико-химические методы Физико-химические характеристики жидкостей определяли в соответствии с рекомендациями [31].
Концентрацию ионов водорода в дистиллированной воде, различных растворах, защитных средах, суспензиях микроорганизмов измеряли с помощью рН-мстров рН-673.М, Mettler Toledo Seven Easy и MP 225. За величину рН сорбентов принимали рН суспензии (водной вытяжки), полученной перемешиванием в течение 5 мин 4 г материала в 100 мл прокипяченной дистиллированной воды.
Вязкость растворов и биосуспензий определяли, используя стеклянные капиллярные вискозиметры типа ВПЖ, по методике изготовителя. Величину вязкости рассчитывали по известной формуле, с учетом приведенной в паспорте постоянной вискозиметра.
Плотность жидкостей измеряли с помощью набора стеклянных ареометров. Поверхностное натяжение жидкостей определяли методом отрыва кольца. Относительную и остаточную влажности различных материалов определяли гравиметрически, выдерживанием навесок в сухо-жаровом шкафу при 105С до постоянной массы.
Изотермы сорбции-десорбции БЭТ паров воды сухими и влажными материалами строили по результатам определения равновесной влажности материалов при заданных значениях относительной влажности окружающей среды. Навески материалов выдерживались в эксикаторах над растворами серной кислоты различной концентрации до прекращения изменения массы навесок.
Реологические характеристики порошков (насыпная и утрясочная плотность, угол естественного откоса, текучесть и т.д.) определяли в соответствии с рекомендациями [129]. Разделение сухих препаратов на компоненты (сорбент и биокомпонент) проводили на вибростенде Laborette-20 Fritch или вибросите Vipo с использованием мини сита с размером ячеек 100 мкм. Фракционно-дисперсный состав распылов суспензий и порошкообразных материалов определяли лазерным анализатором размеров частиц Master Particle Sizer М3.1 Malvern Instruments 2600C по методике производителя и методом микроскопии в соответствии с руководством [81].
Стерилизацию питательных, защитных и разводящих сред осуществляли автоклавированием при 121С и избыточном давлении 0,11 МПа [213]. Стерилизацию аэросила и сорбентов с одновременным обезвоживанием проводили в сухо-жаровом шкафу SUP-4 и ШСВЛ-80 при температуре 120-140С с выдержкой в установившемся тепловом режиме не менее 2 часов.
Устройство для приготовления микрокапельных порошков
Существенной особенностью магнитоожиженного слоя ФМТ является то, что он может быть создан как при избыточном давлении, так и разрежении, в жидкой, газообразной и гетерогенной среде. При этом в аппарате отсутствуют механические приводы, валы и динамические уплотнения, что обеспечивает возможность полной герметизации реакционной зоны. Такой способ обработки материалов позволяет эффективно осуществлять различные технологические процессы (эмульгирование, диспергирование, экстрагирование, дезинтеграцию, ферментативный гидролиз и др.) и их комбинации, массообмен в которых протекает на микроуровне. Заложенная конструктивно возможность регулирования интенсивности воздействия ферромагнитных тел за счет варьирования целого ряда параметров (напряженность магнитного поля, масса, размеры и количество ФМТ и др.) позволяет подбирать щадящие режимы обработки материалов, содержащих биологическое начало.
В исследованиях периодического процесса получения микрокапелыгых порошков использовали рабочую камеру (рис. 9), выполненную из полиметилметакрилата или пищевой нержавеющей стали марки 12Х18Н10Т. В камеру через штуцер 1 загружали требуемые навески ферромагнитных тел и аэросила. Закрывали штуцер крышкой 2 и устанавливали камеру в зазор между индукторами аппарата (рис. 7).
К патрубку 3 стыковали шланг перистальтического насоса (при автоматической подаче жидкости) или поршневой дозатор (при ручной подаче). Включали аппарат, дозировали жидкость и после обработки компонентов в течение заданного времени останавливали процесс отключением питания аппарата. Камеру извлекали для выгрузки и анализа полученного порошка. V B
Разработка технологии получения биопрепаратов затруднительна без четкого представления об основных свойствах, которыми должен обладать биокомпонент препарата. В порошкообразных биопрепаратах к таким свойствам в первую очередь относятся содержание биологически активного начала (концентрация живых микроорганизмов или продуктов их жизнедеятельности, иммунных белков, цитокинов и др.) и размер частиц.
В отличие от сухих пылевидных вакцинных препаратов [96] при разработке препаратов пробиотиков вышеуказанные требования отсутствуют. В работах, посвященных конструированию биопрепаратов бифидобактерий и лактобацилл для перорального применения, размеры частиц лиофилизированной биомассы определялись с технологической точки зрения (при протирке через сито с размером отверстий 3 мм) для удобства последующего включения полученной однородной массы в твердые дозированные формы [69, 219, 289, 293, 337, 370].
Использование нами технологического подхода к обоснованию размеров микрокапель в порошке позволило прийти к следующему.
Каплю жидкости (воды) в воздухе сжимает лапласовское давление, величина которого возрастает с уменьшением размера капли. Движущей силой процесса обезвоживания капли является разница в давлении пара (ДР) над поверхностью капли и в окружающем ее газе (воздухе). Для микронных капель величина ДР достигает огромных значений, чем объясняется высокая скорость испарения капель малых размеров (табл. 3).
Время полного испарения капель воды в неподвижном воздухе [385]. Радиус капли, мкм Время испарения, с Способ распыливания 1000 3060,0 Распыление насадками придавлении воды 3-5 атм. 500 760,0 100 30,6 50 7,6 10 0,3 Капли в порошке покрыты одним или несколькими слоями аэросила. Следовательно, скорость их испарения будет заведомо меньше, чем капель в воздухе, так как потребуется время на диффузию паров воды от поверхности капли через «шубу» аэросила к поверхности частицы порошка. Таким образом, для увеличения скорости испарения и интенсификации процесса высушивания порошка нужно стремиться получать порошок с минимально возможным размером капель.
В литературе [59, 63, 66, 107, 225, 281, 367, 469] отмечается, что на качество распыливания жидкости оказывают влияние как внутренние, так и внешние факторы, и что получить однородный по величине капель распыл в реальных установках практически невозможно. Это обусловлено тем, что наряду с основными каплями в распыле образуются сопутствующие капли, диаметр которых значительно меньше. Подобное явление имеет место и при получении микрокапельных порошков в электромагнитном диспергаторе.
В результате проведения серии экспериментов было определено, что независимо от сочетания режимных параметров процесса получения порошка, массового соотношения аэросила и жидкости, вида (вода, растворы солей, белков, суспензии микроорганизмов) и физико-химических свойств диспергируемых жидкостей распределение капель по размерам в получаемых порошках подчиняется логарифмически нормальному закону (рис. 10, 11).
Исследование основных закономерностей процесса с использованием модельного микроорганизма
Третье состояние системы аэросил-жидкость (пена) наблюдается в случае, когда количество перерабатываемой жидкости значительно превышает диспергирующую возможность магнитоожиженного слоя ферромагнитных тел. При этом вместо дробления происходит интенсивное перемешивание жидкости с внедрением в ее объем пузырьков воздуха, который начинает выполнять роль дисперсной фазы.
Причина превращения порошка в пасту на наш взгляд кроется в следующем. В результате интенсивного механического воздействия ферромагнитных рабочих тел происходит срыв аэросильной оболочки (или ее части) с капли и/или внедрение частиц аэросила в каплю. Жидкость капли при этом выходит на поверхность защитного слоя аэросила, что приводит к частичной потере гидрофобности частицы порошка. При столкновении двух таких частиц происходит их слипание (агрегация) с увеличением размера агрегата. Следует сразу сказать, что этот процесс имеет место с самого начала процесса диспергирования жидкости и протекает параллельно с образованием микрокапель. Однако вплоть до момента завершения формирования порошка tmin преимущественно происходит дробление жидкости (рис. 12). После достижения каплями минимального медианного диаметра, когда дальнейшее дробление жидкости становится невозможным, начинает преобладать процесс разрушения частиц порошка (рис. 13). Количество агрегатов и их размер растут, и при длительности процесса обработки тп происходит качественное изменение вида материала - часть порошка превращается в пастообразную массу. При этом движение ферромагнитных рабочих тел практически прекращается.
Следует отметить, что пасто - или пенообразование системы аэросил-жидкость является свойством именно этой системы. Подтверждением служит тот факт, что с образованием пенообразной массы и превращением порошка в пасту мы сталкивались при испытаниях всех вышеописанных диспергирующих устройств (см. разд. 3). Превращение порошка в пасту происходит тем быстрее, чем интенсивнее осуществляется воздействие рабочего органа аппарата на перерабатываемую систему.
Исходя из изложенного, при оценке процесса образования порошка могут быть использованы следующие технологические параметры: т„ и г„„„. Первый параметр характеризует предельно допустимую длительность нахождения системы аэросил-жидкость в камере аппарата, после которой из компонентов образуется паста, а второй — продолжительность процесса, при которой образуется порошок с наименьшим возможным медианным диаметром капель. На характер связи г„ и г„„„ не оказывают влияния ни физико-химические характеристики биосуспензий, ни режимные параметры работы ЭМД.
В результате проведения многочисленных экспериментов установлено, что между технологическими параметрами т„ и гш/л при переработке в ЭМД композиции аэросил-модельная жидкость (дистиллированная вода) существует прямая связь. Причем максимальное дробление модельной жидкости достигается в том случае, когда время переработки компонентов составляет 45 % от длительности перехода порошка в пасту
Естественно, что при переработке жидкостей, содержащих биологическое начало (клетки микроорганизмов, молекулы белков и др.), физико-химические характеристики которых в значительной степени отличаются от таковых модельной жидкости, следует ожидать некоторого отклонения от найденного соотношения.
Основными физико-химическими характеристиками биологических суспензий являются поверхностное натяжение, вязкость и плотность. Причем каждый из этих параметров может оказывать существенное влияние на различные стороны процесса получения микрокапельных порошков. Так поверхностное натяжение (а) определяет смачивающую способность жидкости, которая может сказываться на устойчивости стабилизации микрокапель частицами гидрофобного аэросила. Вязкость жидкости (v), находящаяся в прямой зависимости от плотности, характеризует усилие, которое необходимо приложить к жидкости для сдвига се слоя, то есть может оказаться важной для процесса дробления и образования микрокапель.
Из исследованных в следующей серии экспериментов указанных физико-химических свойств жидкости существенное влияние и только на длительность процесса до перехода порошка в пасту оказывала вязкость: с ее увеличением г„ возрастало.
Супериатанты (фугаты), полученные центрифугированием бактериальных суспензий с различным содержанием клеток, вели себя аналогично модельной жидкости (воде), и поэтому справедливым остается выражение (4.1). При переработке содержащих бактериальные клетки суспензий (концентраты отмытых клеток Е. faecium и смешанная с защитной средой концентрированная суспензия S. marcescens) с увеличением концентрации клеток происходило снижение величины г„. При этом длительность достижения каплями минимального медианного диаметра ттіп оставалась неизменной. Это приводило к увеличению коэффициента пропорциональности в выражении (4.1), который составлял: для Е. faeciiim с концентрацией клеток 5 % - 0,54, 10 % - 0,70 и 15 % - 0,76, а для S. marcescens -0,73.
Найденные особенности следует учитывать при выборе оптимальной длительности обработки компонентов в процессе получения микрокапельного порошка. Однако окончательный выбор режима работы ЭМД должен основываться на сохранении жизнеспособности микроорганизмов.
Как указывалось выше, предложенный способ обработки материалов позволяет осуществлять различные технологические процессы, в том числе с использованием субстанций, содержащих биологическое начало. Причем это начало может быть разной природы (ферменты, клетки микроорганизмов, включая вегетативные формы, спорообразующие бациллы, вирусы и др.). Так, нами показаны положительные результаты при дезинтеграции клеток дрожжей с экстракцией белка щелочью, при получении устойчивых суспензий Bacillus thuringiensis, сухой высокодисперсной вакцины вируса болезни Ньюкасла, высокодисперсной эмульсии противоящурной вакцины и др. Процесс получения микрокапельного порошка так же, как и эмульсии, основан на диспергировании жидкости (кинетический фактор устойчивости) с тем отличием, что в качестве структурно-механического фактора устойчивости образующихся микрокапель применяют не жидкий стабилизатор, а сухой порошок с наноразмерными частицами. Поскольку при получении микрокапельного порошка для дробления жидкости используется кинетическая энергия вращающихся с большой скоростью ферромагнитных рабочих тел, необходимо было оценить степень их возможного влияния на
