Введение к работе
1.1.Актуальность темы
Репродуктивный и респираторный синдром свиней (РРСС) и цирковирозы (в основном, синдром послеотъемного мультисистемного истощения свиней – СПМИ) наносят большой экономический ущерб промышленному свиноводству во всем мире.
Этиологическими агентами этих заболеваний являются повсеместно распространенные вирус РРСС и цирковирус свиней второго типа (ЦВС-2). Часто наблюдается одновременное инфицирование животных этими вирусами, причем наличие у положительных по ЦВС-2 свиней вируса РРСС инициирует проявление клинических симптомов СПМИ.
Сходство клинических проявлений РРСС и цирковирозов требуют дифференциальной диагностики этих заболеваний и определения серологического статуса свиней, в частности, с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА).
При нашем участии ранее были разработаны и внедрены в ветеринарную практику РФ диагностические иммуноферментные наборы «РРСС-СЕРОТЕСТ» и «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ» для выявления антител к вирусу РРСС и ЦВС-2 в сыворотке крови свиней. В качестве специфических компонентов этих наборов использованы полученные нами рекомбинантные антигены вируса РРСС и ЦВС-2, синтезированные в прокариотической (нуклеокапсидный белок «N» вируса РРСС) и эукариотической (капсидный белок «С» ЦВС-2) системах экспрессии. Однако, эти антигены синтезировались в клетках хозяина, в основном, в нерастворимой форме (в, виде телец включения); для их очистки были необходимы денатурирующие условия, что нарушало пространственную структуру белка и усложняло процедуру его очистки. В связи с этим, нами была изучена возможность получения растворимых форм рекомбинантных антигенов вируса РРСС и ЦВС-2.
1.2.Цель и задачи исследования
Цель исследования - разработка технологии синтеза и очистки рекомбинантных антигенов вируса РРСС и ЦВС-2 для получения на их основе диагностических иммуноферментных тест-систем, предназначенных для выявления антител к этим вирусам в сыворотке крови свиней
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
1.Сконструировать рекомбинантную плазмиду для синтеза растворимой формы рекомбинантного нуклеокапсидного белка «N» вируса РРСС в прокариотической системе экспрессии в виде химерного белка слияния с протяженным, содержащим два полигистидиновых пептида и тиоредоксин, аффинным лигандом.
2.Сконструировать рекомбинантную плазмиду для синтеза растворимой формы рекомбинантного капсидного белка «С» ЦВС-2 в прокариотической системе экспрессии в виде химерного белка слияния с протяженным, содержащим два полигистидиновых пептида и тиоредоксин, аффинным лигандом.
3.Разработать технологию очистки синтезированных в прокариотической системе экспрессии рекомбинантных белков вируса РРСС и ЦВС-2 методом металло-хелатной аффинной хроматографии.
4.Провести оценку очищенных растворимых рекомбинантных белков: «N» вируса РРСС и «С» ЦВС-2 при использовании их в качестве антигенов в непрямом ИФА для выявления антител к вирусам РРСС и ЦВС-2 в сыворотке крови свиней в сравнении с антигенами, применяемыми в диагностических наборах «РРСС-СЕРОТЕСТ» и «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ».
1.3. Научная новизна работы
Проведены синтез растворимых форм рекомбинантных антигенов вируса РРСС и ЦВС-2 в прокариотической системе экспрессии и их очистка методом металло-хелатной аффинной хроматографии. Эти антигены пригодны для использования в качестве специфических компонентов в иммуноферментных тест-системах для выявления антител к вирусу РРСС и ЦВС-2.
1.4.Практическая значимость и реализация результатов исследований
На основе очищенных рекомбинантных антигенов разработаны и внедрены в ветеринарную практику РФ диагностические иммуноферментные наборы «РРСС-СЕРОТЕСТ» и «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ» для выявления антител к вирусу РРСС и ЦВС-2 в сыворотке крови свиней. Нормативно-техническая документация на изготовление наборов утверждена Россельхознадзором Минсельхоза России в установленном порядке (Инструкция по применению набора реагентов «РРСС-СЕРОТЕСТ» б/н от 12.08.05; ТУ № 9388-012-42418073-04; Инструкция по применению набора реагентов «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ» б/н от 27.07.05; ТУ № 9388-010-42418073-04). Использование растворимых форм рекомбинантных антигенов вируса РРСС и ЦВС-2 в качестве специфических компонентов диагностических наборов снизит стоимость их производства.
1.5.Апробация работы
Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных научно-исследовательских конференциях: «ВЕТЕРИНАРНАЯ МЕДИЦИНА 2005: Современное состояние и актуальные проблемы обеспечения ветеринарного благополучия» - Крым, г. Ялта, 2005 г.; «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ ГЕНЕТИКИ» - Беларусь, Минск, 2005 г., и на заседаниях ученого совета НПО НАРВАК (2002-2007г.г.).
1.6. Публикации
По теме диссертации опубликовано 6 научных работ
1.7. Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту
-
Конструирование рекомбинантной плазмиды, содержащей ген ORF7 нуклеокапсидного белка «N» вируса РРСС, на основе вектора pET32b+ для синтеза целевого продукта в виде химерного белка слияния с протяженным, содержащим два полигистидиновых пептида и тиоредоксин, аффинным лигандом («tag») в прокариотической системе экспрессии.
-
Конструирование рекомбинантной плазмиды, содержащей ген ORF2 капсидного белка «С» ЦВС-2, на основе вектора pET32b+ или pET32a+ для синтеза целевого продукта в виде химерного белка слияния с протяженным, содержащим два полигистидиновых пептида и тиоредоксин, аффинным лигандом («tag») в прокариотической системе экспрессии.
-
Технология очистки рекомбинантных белков нуклеокапсида «N» вируса РРСС и капсидного белка «С» ЦВС-2, синтезированных в прокариотической системе экспрессии, металло-хелатной аффинной хроматографией
-
Оценка возможности использования очищенных растворимых рекомбинантных белков: «N» вируса РРСС и «С» ЦВС-2 в непрямом ИФА для выявления антител к вирусам РРСС и ЦВС-2 в сыворотке крови свиней в сравнении с используемыми в диагностических наборах «РРСС-СЕРОТЕСТ» и «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ» антигенами.
1.8. Объем и структура диссертации
Материалы диссертации изложены на 139 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения. Список литературы включает 218 источников, в том числе 19 отечественных и 199 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 38 рисунками и 6 таблицами.
