Содержание к диссертации
Введение
1. Роль селена в процессах жизнедеятельности 7
1.1. Типы селенопротеинов и механизм их синтеза 10
1.1.1. Основные специфические селенопротеины и их функция 11
1.1.2. Синтез селенопротеинов 15
1.2. Влияние селена на рост и жизнедеятельность цианобактерий и микроводорослей 17
1.2.1. Эссенциальность и токсичность селена 18
1.2.2. Особенности ассимиляции и метаболизма селена 19
2. Роль цинка в процессах жизнедеятельности 24
2.1. Цинк в жизнедеятельности животных организмов 24
2.2. Соединения цинка и их функции в растительной клетке 25
2.3. Механизмы аккумуляции цинка и других тяжелых металлов пркариотической клеткой 29
2.3.1. Адсорбция металла на поверхности клеток 31
2.3.2. Механизмы поглощения ионов цинка 31
2.3.3. Способы связывания и локализация тяжелых металлов внутри клетки 35
2.3.4. Механизмы транспорта ионов цинка из клетки 37
Объект и методы исследований 41
3.1. Объект исследования и условия культивирования Spirulina platensis 41
3.2. Измерение ростовых характеристик 43
3.3. Определение биохимического состава S. platensis 44
3.4. Фракционирование биомассы S. platensis 45
3.4.1. Выделение белковой фракции 45
3.4.2. Хроматографическое разделение белков S. platensis 45
3.4.3. Электрофоретическое разделение белков S. platensis 46
3.4.4. Выделение липофильной фракции 46
3.5. Количественное определение микроэлементов 47
3.5.1. Количественное определение внутриклеточного селена 47
3.5.2. Количественное определение внутриклеточного цинка 47
3.6. Статистическая обработка результатов 48
Результаты и обсуждение 49
4 Накопление селена клетками Spirulina platensis 49
4.1. Исследование роста S. platensis на средах, содержащих селенит-ионы 49
4.2. Изменение биохимического состава биомассы S. platensis, выращенной в 52 присутствии Se(IY)
4.3. Влияние селенита натрия на фосфорный обмен S. platensis и внутриклеточный рН 54
4.4. Динамика накопления селена клетками S. platensis 56
4.5. Влияние содержания серы в среде культивирования на накопление селена 58
клетками S. platensis
5. Накопление цинка клетками S. platensis 59
5.1. Влияние соединений цинка на рост S. platensis 59
5.2. Изменение биохимического состава S. platensis, выращенной в присутствии ионов цинка
5.3. Динамика накопления цинка клетками S. platensis 63
5.4. Влияние света на внутриклеточное накопление цинка клетками S. platensis 67
5.5. Адсорбция цинка сухой биомассой S. platensis 69
5.6. Металл-связывающие соединения S. platensis 71
Заключение 75
Выводы 77
Список литературы 78
- Типы селенопротеинов и механизм их синтеза
- Цинк в жизнедеятельности животных организмов
- Объект исследования и условия культивирования Spirulina platensis
Введение к работе
Современные продукты содержат значительно меньше жизненно важных питательных веществ, чем продукты, производимые еще 50 лет назад. Методы ведения сельского хозяйства привели к истощению почв, снижению содержания минеральных веществ в почвах многих регионов России. В сельском хозяйстве используются гибридные сорта повышенной продуктивности, лучшего внешнего вида, хорошо хранящиеся, но отнюдь не с повышенным содержанием питательных веществ. Более того, перевозки, длительное хранение урожая до его реализации также снижает количество питательных веществ в продуктах. В то же время исследования последних лет показывают, что повысившийся уровень стресса в результате загрязнения окружающей среды и особенностей стиля жизни современного человека увеличивает наши потребности в некоторых питательных компонентах. Другими словами, для сохранения питательной ценности продуктов человечество стало перед необходимостью их балансировки. Один из наиболее перспективных способов достижения этой цели - использование биологически активных добавок (БАД).
Витамины и минеральные вещества в пище находятся в связанной форме в естественном комплексе с белками, углеводами и липидами. Организм человека распознает этот пищевой комплекс в целом. Многие добавки, однако, являются синтетическими аналогами витаминов и минеральных веществ, они не связаны с каким-либо биологическими комплексами, и могут иметь иную структуру, чем натуральные витамины. Коммерческие лекарственные формы также могут не учитывать антагонистические и синергидные эффекты витаминов и минеральных веществ как при адсорбции в пищеварительном тракте, так и во время реакций клеточного обмена. Справедливо считается, что лучшим источником питательных веществ являются биологически активные добавки, полученные из натуральных растительных источников.
В последнее время в качестве таких источников используются одноклеточные фотосинтезирующие микроорганизмы (Richmond, 1 986; Borowitzka & Borowitzka, 1988; Цоглин и Габель, 2000), среди которых наиболее перспективной, следует считать цианобактерию Spirulina platensis. Сравнительный анализ биохимического состава микроводорослей, проведённый с использованием широкого круга объектов, показал преимущество S. platensis перед многими продуцентами (Трубачёв и др., 1976; Richmond, 1986). Благодаря богатству белкового состава, наличию витаминов и высших жирных кислот, S. platensis находит применение в качестве ценной пищевой и витаминной добавки как в рационе человека, так и в рационе животных.
Кроме того, пластичность метаболизма микроводорослей позволяет управлять качеством биомассы путем направленного изменения условий культивирования и использовать их для транспорта в организм физиологически важных элементов в биологически активной форме (Клячко-Гурвич, 1966; Семененко, 1985). Этот подход используется, в частности, для получения биомассы S. platensis, обогащенной микроэлементами (Тамбиев и др., 1998; Varga et al., 1999; Градова и др., 2001; Пронина и др., 2000; 2002). Среди последних, несомненный интерес представляют селен и цинк, которые поступают в пищевые цепи человека и животных через растения и играют значительную роль в метаболических функциях, нарушающихся при их дефиците.
Задача получения препаратов с высоким содержанием микроэлементов на сегодняшний день остаётся актуальной, в частности, в ряде регионов земного шара недостаток некоторых микроэлементов в традиционных продуктах питания является причиной возникновения очагов заболеваний связанных с дефицитом этих микроэлементов.
Но все еще остаются неясными вопросы - в каких же формах органических или неорганических соединений накапливаются микроэлементы в клетках S. platensis, зависимость соотношения органических и неорганических соединений, содержащих микроэлементы от содержания микроэлементов в среде культивирования, а также влияние вводимых микроэлементов на метаболизм цианобактерии.
Из литературных источников известно, что избыточные концентрации микроэлементов в среде могут приводить к включению их не только в органические соединения, но и к накоплению в клетках в виде токсических неорганических соединений (Упитие, 1983; Бекасова и др., 1999,2000).
Вопрос о влиянии различных микроэлементов на клеточный метаболизм цианобактерии остается пока открытым и представляет интерес для исследования в связи с тем, что введение в культуральную среду повышенных концентраций микроэлементов может спровоцировать нежелательное изменение состава биомассы.
В данной работе для нас представляло интерес исследовать внутриклеточное накопление селена и цинка в клетках Spirulina platensis с целью изучения устойчивости цианобактерии к этим элементам и поиска путей оптимизации их накопления в органических соединениях для получения биомассы, обогащенной данными микроэлементами.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
Изучение влияния различных концентраций селена и цинка на рост S. platensis;
Исследование биохимического состава S. platensis при росте на модифицированных средах, обогащенных селеном и цинком;
Исследование способности клеток & platensis накапливать селен и цинк;
Исследование включения селена и цинка в состав органических соединений клетки;
Оптимизация условий культивирования, позволяющих получить биомассу с высоким содержанием микроэлементов.
Типы селенопротеинов и механизм их синтеза
Как уже отмечалось выше, селен, поступая в организм в виде селенита или селенсодержащих аминокислот, включается в большое число белков - селенопротеинов (Bamsal et al.,1991; Sunde, 1999). Так, при введении 75Se (в форме селенита) крысам метка включалась в тканевые белки с молекулярными массами 10,14,20,23,57 (или 58), 65 и 77 кД, а по данным другой группы авторов - 6,7,12,15,18,19,22,23,28,33,56,60,65,70 и 75,4 кД (Sunde, 1999). Современная классификация разделяет все селенопротеины на 3 группы:
1) Неспецифические тканевые селенсодержащие белки. К ним относится селеногемоглобин и многие другие, в которые включается метка при введении Se-Met. Их особенностями, как указано выше, являются неопределенные стехиометрические соот ношения при включении селена и зависимость их от обеспеченности организма серой (Beilstein & Whanger, 1986). Характер связи селена в этих белках - прочный, ковалентный: это связь селен-углерод (Beilstein & Whanger, 1986).
2) Селенсвязывающие протеины, активно соединяющиеся с селеном при его поступлении в неорганической форме. Их главной особенностью является отсутствие экспрессии их синтеза в широком диапазоне концентраций селена в рационе (от 0,02 до 2 мг/кг рациона) (Bamsal et al., 1991; Sunde, 1999). У млекопитающих в их числе селенопротеин спермы (17 кД), белок, связывающий жирные кислоты (14 кД) (Sunde, 1999) и тканевые селенопротеины (56 и 58 кД) (Jamba et al., 1996). Форма связи селена в этих белках неясна. Высказывается предположение, что селен, может быть соединен с некоторыми белками этого класса посредством образования смешанной селенсульфидной (Se-S) связи (Pallud et al., 1997).
Биологическая роль селенсвязывающих белков, помимо того, что они могут служить депо селена в тканях, точно не установлена. Предполагается, однако, что белок с молекулярной массой 17 кД ответственен за поддержание жизнеспособности сперматозоидов, а белок печени с молекулярной массой 56 кД участвует в предотвращении развития опухолей под действием химических канцерогенов (Bamsal et al., 1991). Считается, что селен, включающийся в эти белки, может проявлять функции своеобразной простетической группы при реализации этих видов активности.
Кроме этого, селен связывается с большим числом других транспортных белков за счет слабых нековалентных (Ван-дер-Ваальсовых) связей.
3) Специфические селенопротеины. К настоящему времени у эукариот идентифицировано и выделено в чистом виде 12 селенспецифических селенопротеинов
(Holben & Smith, 1999; Тутельян и др., 2002). Их общей особенностью является, во первых, строго стехиометрическое ковалентное включение селена (и всегда в виде селеноцистеина) в строго определенные места полипептидной цепи и, во-вторых, особый характер экспрессии под воздействием селена пищи.
При глубоком дефиците селена (менее 0,02 мг/кг рациона) синтез этих белков глубоко подавлен, причем, как правило, отсутствует не только активная форма фермента, но и его мРНК (Knight & Sunde, 1988; Swanson et al., 1991). По мере возрастания содержания селена в рационе их синтез увеличивается вплоть до некоего оптимального уровня (это, по разным данным, порядка 0,2 мг/кг рациона для глутатионпероксидаз и 0,1 мг/кг рациона для селенопротеинов Р и W) (Deagen et al., 1987; Hill et al., 1987). Далее уровень экспрессии большинства селенспецифических селенопротеинов выходит на плато и при последующем увеличении потребления селена (как в неорганической, так и в органической форме) не увеличивается.
Цинк в жизнедеятельности животных организмов
Уже в 1926г. было показано, что высшие организмы нуждаются в цинке. К настоящему времени известно более 200 содержащих цинк и цинк зависимых ферментов (Valle, 1983; Hambidge et al., 1986). Уже одно это объясняет широту влияния цинка на жизнь растений и животных. Цинк содержат представители всех основных 6 классов ферментов: оксидоредуктаз, трансфераз, гидролаз, лиаз, изомераз, лигаз.
В организме животных и человека цинка содержится п 10 2% на сухую массу (Valle, 1983). Суточная потребность человека в цинке составляет 12-50 мг (Скальный и др., 2000). Цинк участвует в обмене белков, углеводов, жиров и нуклеиновых кислот, а также в синтезе некоторых гормонов. Избыток и недостаток цинка вызывает функциональные и морфологические изменения в деятельности органов и систем (Hambidge et al., 1986).
В разных количествах цинк содержится во всех органах, типах и элементах тканей, причем его распределение неравномерно не только в органах, но и в одном и том же органе (Авцын и др., 1991). Цинк преимущественно накапливается в цитоплазме клеток с эндокринной функцией, мышечных тканях и волокнах, в клеточных мембранах эпителия, выполняющего функции всасывания и пристеночного пищеварения, в синапсах центральной нервной системы. Содержание цинка в перечисленных выше структурах зависит от состояния их функциональной активности, и, наоборот, их функциональная активность зависит от содержания цинка (Hambidge et al., 1986).
Цинк при физиологических условиях существует в растворе в виде гидратированного иона Zn, который в силу наличия у него заряда и высокой гидрофильности не способен проходить непосредственно через липидные слои биологических мембран. В этой связи рассматривается роль различных белков-переносчиков и агентов хелаторов в трансмембранном переносе цинка. При физиологических условиях всасывание Zn осуществляется в проксимальных отделах тонкой кишки (двенадцатиперстной и тощей), где, по современным данным, присутствует белок - специфический транспортер цинка Znl (McMahon & Cousins, 1998). В пользу его роли в транспорте цинка говорит его способность к индукции при повышенных поступлениях в организм данного микроэлемента, а также наличие специфического Zn-связывающего домена, содержащего 8-кратно повторяющийся мотив Gly-His. Однако, данный белок по данным иммуноморфологаческого исследования экспрессирован не на апикальных, а на базальных мембранах энтероцитов, что ставит его физиологическую роль во всасывании цинка под сомнение. Высказывается предположение, что Znl в действительности определяет не всасывание Zn, а его экскрецию из организма, осуществляющуюся с калом при избыточном, потенциально токсичном поступлении этого элемента. Помимо рассматриваемого переносчика известно еще несколько трансмембранных транспортеров Zn, которые, однако, обладают узкой тканевой специфичностью и не имеют, по-видимому, отношения к его кишечному всасыванию (McMahon & Cousins, 1998).
Некоторые авторы (Whanger et al., 1981; Берзинь, 1989; Алексеева-Попова, 1991) считают, что регуляция всасывания цинка в организме осуществляется металлотионеинами. Она коррелирует с активностью синтеза этих белков - лигандов при введении в организм изменяющихся концентраций цинка (Whanger et al., 1981; Берзинь, 1989). Авторы данных работ также полагают, что металлотионеины представляют и депонирующую и транспортную формы металла. Металлотионеины полифункциональны, и некоторые исследователи (Катрич, 1989) предполагают, что они причастны к трансмембранному переносу цинка. Среди металлотионеинов у животных доминирующей формой являются связывающие цинк металлотионеины. Для различных функций в клетке присутствуют металлотионеины с разной координационной геометрией. Металлотионеины кодируются мультигенным семейством. Отдельные элементы этого семейства индуцируются разными индукторами, т.к. обладают различными промоторами (Катрич, 1989).
Одним из белков, связывающих цинк, является витамин А-зависимый белок, участвующий в трансэпителиальном переносе цинка (Whanger et al., 1981). На усвоение цинка в кишечнике влияют и другие жирорастворимые витамины - D и Е, при дефиците которых баланс цинка в организме становиться отрицательным. На усвоение цинка, по-видимому действует витамин Вб, а также избыточное содержание Са и Р в пище и воде в случае их одновременного поступления в кишечник (Whanger et al., 1981).
Выделение цинка из организма осуществляется через кишечник и почки (Whanger et al, 1981).
Объект исследования и условия культивирования Spirulina platensis
В качестве объекта исследования использовали одноклеточную термофильную нитчатую цианобактерию Spirulina platensis (Nordst.) Geitl. IPPAS B-256 из коллекции культур микроводорослей Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской Академии Наук (IPPAS) (Семененко, 1991).
Выбор штамма S. platensis в качестве объекта основывали на рекомендациях по их применению для фундаментальных исследований (Семененко, 1991), а также в связи с интересом к этой культуре как продуценту множества БАД. (Richmond, 1986).
S. platensis - источник множества ценных для человека соединений, получивших широкое применение. Эта цианобактерия содержит в больших количествах витамины группы В: В1, В2, В6 и В12; провитамин А (Р-каротин); фикоцианин; полисахариды и целый ряд ненасыщенных жирных кислот, наиболее важная из которых у-линоленовая. Фармацевтические компоненты S. platensis являются активной составляющей антисептических средств для обработки ран. Энзиматические гидролизаты ускоряют метаболизм, поэтому применяются в косметике. Помимо указанных областей применения, уже сейчас препараты спирулины широко используются в качестве ценной пищевой добавки в рационе человека, в парфюмерии, в сельском хозяйстве и в животноводстве (Мещерякова и Воронкова, 1985; Richmond, 1986).
Культивирование проводили согласно Владимировой и Семененко (1962) в стерильных условиях при круглосуточном освещении люминесцентными лампами БС-60 с интенсивностью светового потока 30 Вт/м2 и непрерывном барботировании газовоздушной смесью, содержащей 1,7-2,0% СОг, при 33-35С, в цилиндрических культуральных сосудах объёмом 250 мл с толщиной слоя суспензии 40 мм.
В качестве стандартной (контроль) использовали среду Заррука (Семененко, 1991), содержащую (г/л): 16,8 NaHC03, 2,5 NaN03, 1,0 NaCl, 1,0 К2НР04, 1,0 K2S04, 0,2 MgS04 7H20, 0,04 СаСЬ, а также FeSC +EDTA и микроэлементы в концентрациях, указанных в (Семененко, 1991), рН около 9.
Селенит натрия добавляли в стандартную среду Заррука до внесения посевного инокулята в количестве 10,20, 30,50,100,150 и 170 мг/л.
Для изучения влияния серы на накопление селена S. platensis выращивали в присутствии 20 мг/л селенита натрия при снижении в 10 раз содержания серы (10% K2SO4 от стандартной среды Заррука).
Нитрат и сульфат цинка вводили в питательные среды либо до внесения посевного инокулята, либо при выходе культуры на линейную фазу в концентрациях 10, 20, 30 и 40 мг/л. Хлорид цинка вносили в питательные среды вместе с инокулятом в тех же концентрациях.
Во всех экспериментах в течение первых двух дней после засева S. platensis, культивирование проводилось при одностороннем освещении согласно рекомендациям Абдуллаева и Семененко (1974), так как выращивание культур в разбавленных суспензиях при высокой интенсивности света приводит к увеличению продолжительности лаг-периода.
С целью масштабирования результатов, полученных при культивировании культуры S. platensis на лабораторной установке, нами использовался полупромышленный фотобиореактор «Прибой» (рис.2). Эта установка разработана Цоглиным с соавт. (1996) с целью лабораторного культивирования широкого ряда фотосинтезирующих организмов, однако заложенные конструктивные решения позволяют использовать ее также для целей полупромышленного производства биомассы. Толщина слоя суспензии в «Прибое» может варьировать от 5 до 12 см, при этом объем культивируемой суспензии меняется от 40 до 100 л. Режим колебаний выбран таким образом, что в кювете возникает эффект прибойной волны, обеспечивающий интенсивное перемешивание суспензии и массообмен по СОг и Ог. Для освещения суспензии фотобиореактор снабжен съемным облучателем с лампой ДНаТ-400, при помощи которого возможно варьировать интенсивность освещения. Для предотвращения попадания в среду спор микроорганизмов из воздуха, а также с целью насыщения внутреннего объема воздуха углекислотой, кювету накрывали слоем прозрачной пленки, выполняющей роль защитного экрана.
