Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Исследование регуляторных элементов ретротранспозона copia и влияния его инсерций на приспособленность Drosophila melanogaster Морозова Татьяна Викторовна

Исследование регуляторных элементов ретротранспозона copia и влияния его инсерций на приспособленность Drosophila melanogaster
<
Исследование регуляторных элементов ретротранспозона copia и влияния его инсерций на приспособленность Drosophila melanogaster Исследование регуляторных элементов ретротранспозона copia и влияния его инсерций на приспособленность Drosophila melanogaster Исследование регуляторных элементов ретротранспозона copia и влияния его инсерций на приспособленность Drosophila melanogaster Исследование регуляторных элементов ретротранспозона copia и влияния его инсерций на приспособленность Drosophila melanogaster Исследование регуляторных элементов ретротранспозона copia и влияния его инсерций на приспособленность Drosophila melanogaster Исследование регуляторных элементов ретротранспозона copia и влияния его инсерций на приспособленность Drosophila melanogaster Исследование регуляторных элементов ретротранспозона copia и влияния его инсерций на приспособленность Drosophila melanogaster Исследование регуляторных элементов ретротранспозона copia и влияния его инсерций на приспособленность Drosophila melanogaster Исследование регуляторных элементов ретротранспозона copia и влияния его инсерций на приспособленность Drosophila melanogaster
>

Данный автореферат диссертации должен поступить в библиотеки в ближайшее время
Уведомить о поступлении

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - 240 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Морозова Татьяна Викторовна. Исследование регуляторных элементов ретротранспозона copia и влияния его инсерций на приспособленность Drosophila melanogaster : Дис. ... канд. биол. наук : 03.00.15 Б. м., Б. г. 137 с. РГБ ОД, 61:04-3/593

Содержание к диссертации

Введение

Обзор литературы 8

1. Ретротранспозон copia Drosophila mefanogaster 13

1.1 Особенности строения и транскрипции 13

1.2 Механизм транспозиции ретротранспозона copia 18

2. Молекулярные механизмы регуляции активности copia 21

2.1 Исследование регуляторных последовательностей МЭ с помощью трансгенных конструкций 22

2.1.1 Однокомпонентные вектора на основе Р-элемента 22

2.1.2 Система векторов GAL4/UAS 24

2.1.3 Система векторов FLP/FRT 27

2.1.4 Тетрациклин-зависимая система 28

2.1.5 Система векторов Cre/loxP и FLP/FRT 30

2.1.6 Репортерные гены, используемые в векторах при изучении D. melanogaster 32

2.2 Регуляторные области ретротранспозона copia 35

2.3 Геномные факторы, взаимодействующие с регуляторными элементами copia 39

3. Влияние МЭ на приспособленность 47

Материалы и методы 53

4.1 Основные растворы 53

4.2 Лабораторные линии, использованные в работе 53

4.3 Определение индекса конкуренции 56

4.4 Определение выживаемости яиц 57

4.5 Р-зависимая трансформация эмбрионов 58

4.5.1 Оборудование для инъекций 58

4.5.2 Получение и анализ трансформантов 59

4.5.3 Сбор эмбрионов после инъекций 60

4.6 Репортерные конструкции, использованные в работе 61

4.7 Гистохимическая окраска органов на активность р-галактозидазы 63

4.8 Количественное определение активности /?-галактозидазы 63

4.9 Молекулярно-биологические методы 65

4.9.1 Выделение геномной ДНК D. mefanogaster. 65

4.9.2 Выделение плазмидной ДНК 66

4.9.3 Ферментативная обработка ДНК 66

4.9.4 Гель-электрофорез фрагментов ДНК 66

4.9.5 Трансформация бактериальных клеток 67

4.9.6 Саузерн-блот гибридизация 68

4.9.6.1 Перенос ДНК из агарозных гелей на нейлоновый фильтр Hybond N 68

4.9.6.2 Мечение ДНК методом рассеянной затравки 68

4.9.6.3 Гибридизация с меченым зондом 69

4.10 Определение сайтов локализации МЭ на хромосомах 70

4.10.1 Приготовление давленых препаратов политенных хромосом слюнных желез D. melanogaster. 70

4.10.2 Приготовление ДНК зондов, меченых биотином 70

4.10.3 Проведение гибридизации in situ 71

4.11 Оценка числа копий и частоты транспозиций МЭ в геноме 72

4.11.1 Оценка гаплоидного числа копий 72

4.11.2 Измерение частоты транспозиций МЭ 73

4.12 Обработка результатов 74

Результаты и обсуждение 75

5.1 Регуляторные последовательности ретротранспозона copia 75

5.2 Влияние числа копий ретротранспозона copia на приспособленность ... 101

5.2.1 Изменение частоты транспозиций, числа копий сор/а и приспособленности особей в инбредных сублиниях линии 2Ь 102

5.2.1.1 Изменение числа копий copia 103

5.2.1.2 Изменение паттерна сайтов локализации copia 109

5.2.1.3 Изменение приспособленности в условиях инбридинга и ослабленной селекции в линиях с различной частотой транспозиций copia 111

5.2.3 Число копий ретротранспозонов и приспособленность в линиях 2Ь 112

Выводы 119

Список литературы

Введение к работе

Актуальность темы

Мобильные элементы (МЭ) являются обязательной составной частью генома большинства исследованных эукариот и одним из существенных источников мутационных изменений. Благодаря особенностям жизненного цикла, большому разнообразию лабораторных линий, относительно небольшому числу МЭ, а также наличию политенных хромосом, на которых можно прямо определить местоположение копий МЭ с помощью гибридизации in situ, в качестве модельного объекта при изучении МЭ широко используется плодовая мушка Drosophila melanogaster. На долю МЭ Drosophila melanogaster приходится более 20% геномной ДНК, и половина всех спонтанных мутаций вызвана инсерциями МЭ в различные локусы.

Несмотря на широкое распространение МЭ и множество работ по исследованию их структуры, особенностей регуляции и поведения в природных популяциях, многие аспекты их взаимодействия с геномом хозяина остаются до сих пор не понятыми или не изученными.

Можно выделить три уровня взаимодействия МЭ - геном хозяина (Пасюкова и др., 1999). Прежде всего, взаимодействие МЭ - хозяин осуществляется на молекулярно-генетическом уровне. С одной стороны, активность МЭ зависит от их собственных нуклеотидных последовательностей, которые не только кодируют ключевые белки их жизненного цикла, но также, благодаря присутствию различных цис-регуляторных элементов (промотора, энхансеров, инсуляторов) обеспечивают взаимодействие с геномом хозяина. С другой стороны, в геноме хозяина присутствуют гены, управляющие активностью МЭ. В процессе совместного существования хозяин вырабатывает защитные механизмы, сдерживающие транспозиции МЭ. Наконец, активность МЭ может регулироваться на популяционном уровне. Известно, что транспозиции МЭ приводят к появлению инсерционных мутаций, что способствует образованию генетической и фенотипической изменчивости на уровне популяции, создавая материал для естественного отбора. Если инсерции вредны и накапливаются в организме, приспособленность особи падает, и она элиминируется отбором.

МЭ неотделимы от генома, в котором они находятся. Чем больше мы узнаем о природе взаимодействий, которая существует между этими элементами и геномом, тем лучше мы сможем воссоздать процессы, лежащие в основе коэволюции МЭ - геном хозяина.

Цель и задачи работы

Целью работы было исследование молекулярных и популяционных механизмов регуляции активности МЭ, на примере ретротранспозона соріа. Для этого предполагалось, во-первых, исследовать роль регуляторных районов соріа в контроле экспрессии ретротранспозона и, во-вторых, оценить селективную значимость его инсерции в геноме Drosophila melanogaster.

Выбор соріа в качестве модельного МЭ для исследования обусловлен рядом причин. Во-первых, проведенный ранее (Sneddon, Fiavell, 1989) детальный анализ роли регуляторных районов ретротранспозона соріа в регуляции его экспрессии в культуре клеток в системе in vitro является хорошей отправной точкой для перехода к изучению функциональной значимости регуляторных областей соріа в системе in vivo. Во-вторых, в отделе молекулярной генетики животных РАН была получена уникальная коллекция близкородственных изогенных линий D. melanogaster (Пасюкова, Нуждин 1992), различающихся по числу копий и частоте транспозиций ретротранспозонов copia и Doc, а также разработана уникальная методика прямого определения частоты транспозиций. Система этих линий является удобной моделью для изучения популяционных механизмов регуляции активности МЭ, в частности copia, и влияния инсерций МЭ на приспособленность.

В работе были поставлены следующие задачи: 1. Получить трансгенные линии, содержащие репортерныи ген под контролем различных регуляторных районов ретротранспозона copia. 2. Исследовать значение регуляторных районов ретротранспозона copia в контроле его экспрессии в разных тканях и у особей разного пола. 3. Проанализировать изменение числа копий и частоты транспозиций copia в условиях инбридинга и ослабленной селекции в линиях с исходно различной частотой транспозиций. 4. Оценить влияние инсерций ретротранспозона copia на приспособленность в системе близкородственных линий, различающихся числом копий copia в геноме.

Ретротранспозон copia Drosophila mefanogaster

Так как данная работа посвящена популяционному и молекулярному исследованию ретротранспозона copia, рассмотрим более подробно его строение (рисунок 2). Полная длина ретротранспозона copia равна примерно 5.2 т.п.н. На концах расположены длинные концевые повторы (ДКП) в прямой ориентации. Длина одного ДКП равна 276 н.п. ДКП имеет обычное для ретровирусов U3-R-U5 строение. Полноразмерный 5 т.п.н. транскрипт инициируется на 5 -конце R сегмента 5 ДКП и терминируется (и полиаденилируется) на З -конце R сегмента З ДКП. Показано, что точка инициации транскрипции copia варьирует в пределах 20 нуклеотидов (127-147 н.п.) и 5 -концевые районы различных молекул мРНК copia имеют различную длину (Flavell et al., 1981). Далее полноразмерный транскрипт copia либо упаковывается в вирусоподобные частицы, либо используется для синтеза вирусных белков.

Полноразмерный транскрипт содержит две перекрывающиеся рамки считывания (Emory et al., 1985; Mount, Rubin, 1985). Первая рамка соответствует Gag и Pol белку, последний обладает активностями протеазы, интегразы и обратной транскриптазы ретровирусов. Вторая рамка, видимо, соответствует белку оболочки ретровирусов (Env), однако ее последовательность не имеет гомологии с Env белками. Считается, что copia не имеет последовательности, кодирующей Env белок (Bingham, Zachar, 1989).

В культуре тканей Drosophila melanogaster обнаружены транскрипты длиной 2 и 5 т.л.н. (Emory et al., 1985). С большего транскрипта синтезируется единый 162.77 кДа полипептид, саморазрезающийся на два белка, обладающих несколькими активностями (Varmus, Brown, 1989). Меньший транскрипт образуется путём сплайсинга (сайты сплайсинга: 1605 и 4500) из большего транскрипта. Сплайсированный транскрипт кодирует единый 48 «Да поли пептид, саморазрезающийся на 31 «Да (Gag) и 17 кДа белки (Yoshioka et al., 1990). Gag белок представляет собой основной белок вирусоподобных частиц copia, обнаруживаемых в культуре тканей (Emory et al., 1985) и в линиях D, melanogaster, имеющих повышенную активность copia (Nuzhdin et al., 1996).

В отличие от многих других ретровирусов и ретротранспозонов, copia имеет одну единую рамку считывания для Gag и Pol белков. Это должно приводить к получению примерно одинакового количества этих белков в клетке. Однако ретровирусный жизненный цикл требует значительно большего количества Gag белка по сравнению с Pol белком, и для других ретротранспозонов соотношение Gag:Pol варьирует от 10:1 до 30:1 (Atwood, 1996). В случае copia это частично компенсируется экспрессией сплайсированного транскрипта, однако, даже принимая в расчет лишь максимальные оценки соотношения 2 т.п.н.: 5 т.п.н. транскриптов, количество Gag белка будет превышать количество Pol белка лишь вдвое. По-видимому, для copia решение этой проблемы достигается с помощью посттранскрипционной регуляции. Изучение трансляция in vitro 2 и 5 т.п.н. транскриптов copia показала, что 2 т.п.н. транскрипт транслируется значительно эффективнее 5 т.п.н. транскрипта (Flavell et al., 1980). Совместная трансляция обоих транскриптов (Schwartz et al., 1982) проходила эффективно, однако, при анализе белковых продуктов был обнаружен лишь продукт 2 т.п.н. транскрипта. В то же время, 5 т.п.н. транскрипт copia, выделенный из вирусоподобных частиц, транслировался достаточно эффективно (Shiba, Saigo 1983). Таким образом, в случае copia проблема соотношения Gag и Pol белков решается с помощью неизвестной модификации 5 т.п.н. транскрипта, приводящей к пониженной трансляционной эффективности этого транскрипта. Причем, модификации подвергаются лишь те молекулы мРНК copia, которые переносятся в цитоплазму для трансляции. Природа подобной модификации не выяснена. С помощью делеционного картирования репортерных конструкций удалось локализовать район последовательности copia, ответственный за подобную посттранскрипционную регуляцию (Thomson, 1996).

Исследование регуляторных последовательностей МЭ с помощью трансгенных конструкций

В основе метода Р-зависимой трансформации лежит способность Р-элемента - транспозона D. melanogaster - встраиваться в геном, перенося при этом любую конструкцию, заключенную между его концевыми повторами (Rubin, Spradling, 1982). Для того чтобы произошла интеграция вектора в геном, необходимы два условия: наличие активной транспозазы и интактные концевые повторы Р-элемента.

В первых экспериментах в качестве векторов использовали полноразмерные Р-элементы. Но из-за того, что они были способны кодировать транспозазу и перемещаться по геному, линии трансформантов не обладали стабильностью. Для решения этой проблемы в дальнейших работах стали конструировать специальные векторы - транспозоны, которые обладают следующими свойствами: 1) наличие интактных концевых повторов, необходимых для встраивания в геном; 2) полилинкер с набором рестриктных сайтов для клонирования в вектор интересующей последовательности трансгена; 3) доминантные селективные маркеры для отбора трансформантов. 4) Релортерный ген, экспрессия которого исследуется у трансформантов.

В таком векторе отсутствует внутренняя часть Р-элемента, кодирующая транспозазу (Karres, Rubin, 1984). Вектор способен встраиваться в геном благодаря сохраненным концевым повторам Р-элемента, но только в присутствии (при совместной инъекции) Р-элемента-помощника (Steller, Pirrotta, 1986). В качестве помощника используется Р-элемент, внутренняя часть которого сохранена, но присутствует делеция в одном или обоих концевых повторах, которая не позволяет помощнику встраиваться в геном. В тоже время транспозаза, синтезируемая помощником, вносит разрывы в ДНК реципиента, осуществляя трансформацию вектора.

Одним из примером векторов, созданных на основе Р-элемента, может служить вектор pCaSpeR-AUG-0-gal, размером около 12 т.п.н., который имеет в своей основе плазмиду pUC 8, несущую селективный маркер устойчивости к ампициллину (Thummel et al., 1988). Вектор содержит концевые последовательности Р-элемента, необходимые для встройки конструкции в геном дрозофилы, нормальный аллель маркерного гена white D. melanogaster, используемого для отбора трансформантов, релортерный ген lacZ Е. coll с присоединенным к нему стартовым кодоном трансляции AUG гена Adh D. melanogaster и лолилинкер с уникальными сайтами рестрикции (рисунок 4).

Р-элемент зависимая трансформация с использованием подобных векторов была первым методом введения ДНК в геном D. melanogaster. Она широко используется для исследования регуляторных элементов генома, определения пространственного и временного паттерна экспрессии изучаемых трансгенов.

Основным недостатком данного метода является влияние на экспрессию репортерного гена эффекта положения, то есть геномных регуляторных последовательностей, расположенных в месте встройки. Контролировать место встройки невозможно. Для того чтобы преодолеть этот недостаток, как для исследуемой конструкции, так и для контроля (пустого вектора), необходимо получать в среднем 5-10 независимых трансгенных линий.

GAL4/UAS - элегантная система, созданная Brand and Perrimon (1993; Phelps, Brand, 1998), и используемая в основном для получения тканеспецифичной экспрессии исследуемого трансгена. Принцип работы этой системы заключается в создании и последующем объединении в геноме двух типов векторов на основе Р-элемента. 1) Вектор-источник фактора GAL4. Вектор несет ген, кодирующий белок GAL4, который является транскрипционным активатором у дрожжей. Было показано, что у GAL4 нет известных генов-мишений у дрозофилы и он может быть экспрессирован в различных ее тканях и органах без вреда для организма. Экспрессия GAL4 в таких векторах находится под контролем универсального (actinSC, h$p70) или тканеспецифичного промотора. Примером таких векторов могут служить pGaTB и pGawB (рисунок 5; Brand, Реггіглоп, 1993).

Вектор-мишень, несет повторенную 5 раз 17 нуклеотидную последовательность UAS {upstream activation system), которая является мишенью для GAL4, выступает одновременно в качестве энхансера и содержит базальный промотор. В этой конструкции в одной рамке считывания с UAS находится исследуемый трансген. Наиболее часто используемым вектором-мишенью является pUAST вектор (рисунок 5; Brand, Perrimon, 1993).

Лабораторные линии, использованные в работе

Все линии Drosophila melanogaster (D, melanogaster) поддерживали при 25С на обычной дрожжевой среде.

Линия 2Ь - изогенная лабораторная линия, синтезированная в 1986 году (Pasyukova, Nuzhdin, 1993). Она является одной из производных линии НА (Кайданов и др., 1969): X и третья ее хромосомы идентичны хромосомам линии НА, а вторая хромосома представляет собой хромосому НА, сайты локализации МЭ в которой изменились в результате транспозиций и эксцизий. Линия не имеет фенотипических маркеров (Пасюкова, Нуждин, 1992).

В 1988 году линия 2Ь была разделена на три независимо ведущиеся отводки: 2Ы, 2Ь2 и 2ЬЗ. Эти отводки далее в течение нескольких лет разделялись на дочерние отводки (рисунок 12), которые затем поддерживались как малые массовые культуры, примерно 20 пар мух на поколение. 2ЬЗ;2Ь2;2Ь2.1 и 2ЬЗ;2Ь2;2Ь2.М -линии с хромосомными замещениями, которые были получены в результате совмещения хромосом разных исходных отводок; они содержат Х-хромосому от сублинии 2ЬЗ, а вторую и третью хромосомы от сублинии 2Ь2 (Pasyukova et al., 1998). Сублиния 2Ь3.1.1.2 была получена от индивидуального самца сублинии 2Ь3.1.1; сублинии 2ЬЗ.изо1 и 2ЬЗ.изо2 были получены в результате изогенизации с помощью стандартных генетических методов, основанных на использовании хромосом-балансеров (Pasyukova, Nuzhdin, 1993). У всех особей всех сублиний фиксировано 24 сайта локализации copia (4EF, 18С, 33F, 34EF, 35С, 38А, 40А, 41 А, 42А, 42В, 47В, 52D, 53Е, 64Е, 66С, 71 С, 73С, 80А, 82С, 87F, 94Е, 96В, 98В, 99В) и 27 сайтов локализации Doc (4В, 24D, 27АВ, ЗЗА, 33D, 35А, 36Е, 37С, 37D, 38EF, 41АВ, 41С, 41F, 42А, 44CD, 45А. 65А, 67В, 67Е, 70А, 75С, 77Е, 78Е, 80А. 86А, 92F, 93F). Полиморфизм по этим сайтам отсутствовал на протяжении 10 лет (Pasyukova et al., 1997). Наличие этих сайтов проверялось во всех экспериментах и использовалось как контроль против засорения линий.

В тоже время, в дополнение к фиксированным сайтам, в разных сублиниях присутствует от 5 до 30 новых полиморфных сайтов copia и от 25 до 85 новых полиморфных сайтов локализации Doc, появившихся в результате транспозиций. Для всех сублиний, используемых в данной работе, ранее была измерена частота транспозиций copia, которая варьировала от 10"4 до 10"2 транспозиций на копию на поколение {Pasyukova etal., 1998).

В этих же сублиниях была проанализирована локализация и других МЭ -мдг2, Mds4(gypsy), 297, H.M.S.Beagle, roo, Doc, jockey, /-элемента, FB4. Локализация всех МЭ в сублиниях линии 2Ь оказалась одинаковой. Р-элемент в линии 2Ь отсутствует (Pasyukova et al., 1998).

Таким образом, в сублиниях 2Ь происходят транспозиции copia и Doc, в то время как остальные элементы остаются стабильными. Частота транспозиций copia у самцов оказалась высокой, в то время как эксцизий выявлено не было. Транспозиции у самок обнаружены не были. Для Doc были выявлены транспозиции только у самок, но не у самцов. Соматических транспозиций соріа в клетках слюнных желез обнаружено не было, в то время как у самок 2Ь были зарегистрированы соматические транспозиции Doc (Pasyukova et al., 1993; Pasyukova et al., 1998).

Линия Oregon RC-изо - изогенная отводка линии Oregon RC маркированная геном spa. В течение 7 лет (1991-1997 гг.) в линии сохранялась стабильная локализация МЭ соріа {11С, 21D, 34ВР 34EF, 42В, 42С, 47А, 52В, 57Е, 59D, 68В, 75С, 86Е, 96А) и Doc (ЗА, 4Е, 5D, 7С, 10F, 11С, 14В, 17В, 19Е, 32F, 34EF, 53В, 35Е, 36DE, 38Е, 39Е, 41АВ, 41D, 56F, 64Е, 65А, 67F, 74А, 76В, 77А, 79А, 79D, 80А, 81F, 83D, 85F, 95В, 96D, 97АВ, 98В, 99Е). Различия по локализации МЭ между особями выявлены не были. Частота транспозиций соріа и Doc в линии меньше 10"4 на поколение на копию элемента (Pasyukova, Nuzhdin, 1993).

Линия C(2L)RM, dp; C(2R)RM, px - несет сцепленные левые и правые плечи второй хромосомы, RM описывает характер сцепления: ревертированный метацентрик, а ф и рх являются видимыми маркерами: укороченные крылья и дополнительная жилка на крыльях, соответственно (Lindsley, Zimm 1992).

Линия у1\А 7с23 -лабораторная линия D. melanogaster, используемая для эмбриональной трансформации; #6599 — номер линии в коллекции из Блюмингтона.

Влияние числа копий ретротранспозона copia на приспособленность

Предполагается, что в популяциях небольшой численности отбор, действующий на различные аллельные варианты генов, ослаблен. Известно также, что частота эксцизий примерно на два порядка ниже частоты транспозиций. В результате инсерции МЭ, в том числе и вредные, могут накапливаться в популяциях небольшой численности, в то время как в популяциях большого размера они были бы элиминированы отбором. Популяции малой численности, таким образом, предоставляют экспериментальную возможность изучения свойств возникающих инсерции, в том числе их влияния на приспособленность. Такой экспериментальный подход был использован нами для изучения взаимных изменений частоты транспозиций, числа копий ретротранспозона и приспособленности особей.

Разные сублинии линии 2Ь имеют разную частоту транспозиций сорїа. В 1994 году Пасюковой Е. Г. были выбраны три сублинии, 2Ь3.1.1.2, 2ЬЗ.изо1 и 2ЬЗ.изо2 (рисунок 12), различающиеся по частоте транспозиций (Р 0,05, таблица 11): 2х10 2, 2х10"3 и бхЮ"4 транспозиций на поколение на копию copia, соответственно. Из каждой линии были взяты самец и самка и скрещены между собой. Часть потомков каждой пары дала основание двум отводкам. Первая отводка поддерживалась жестким инбридингом (скрещивания брат х сестра; отводки 2Ь3.1.1.2,и, 2ЬЗ.изо1.и, 2ЬЗ.изо2.и). Вторая отводка поддерживалась как маленькая массовая культура скрещиванием 10 самцов х 10 самок (отводки 2Ь3.1.1.2.м, 2ЬЗ.изо1.м, 2ЬЗ.изо2.м). Таким образом, каждая пара особей исходных трех линий дала начало двум линиям, впоследствии поддерживавшимся строгим или умеренным инбридингом в течение (2Ь3.1.1.и), 30 (2Ь3.1.1.м) и 42 (2ЬЗ.изо1.и, 2ЬЗ.изо1.м, 2ЬЗ.изо2.и и 2ЬЗ.изо2.м) поколений.

У другой части потомков каждой исходной индивидуальной пары, а также у потомков от скрещивания каждого исходного самца с самками линии Oregon RC-изо была проанализирована локализация сор/а на политенных хромосомах. На основании этого была получена исходная характеристика локализации copia в исследуемых линиях: точно оценено число эухроматических копий copia, их позиции и исходные частоты (таблицы 7, 8, 9). В дальнейшем число эухроматических копий будет называться просто числом копий copia в геноме, количество гетерохроматических копий учитываться не будет. В исходных линиях 2ЬЗ.изо1 и 2ЬЗ.изо2 был также измерен индекс конкуренции. Исходные линии не различались по этому признаку (таблица 10).

Таким образом, в нашем распоряжении имелось 3 пары линий, в которых исходно был охарактеризован набор сайтов локализации copia, частота транспозиций, а в двух из них приспособленность, и которые далее подвергались тесному или умеренному инбридингу. После этого в линиях повторно была охарактеризована локализация и частота транспозиций copia, а также приспособленность.

Рассмотрим сначала характер изменений новых сайтов, которые появились в линиях в ходе эксперимента (таблица 7, 8, 9). В линии 2ЬЗ.изо2 с самой низкой частотой транспозиций (5x10"4 транспозиций на поколение на копию copia) накопления copia в геноме не наблюдается. Исходя из частоты транспозиций, можно примерно посчитать, сколько добавочных копий copia на гаплоидный геном должно было появиться в этой линии за 42 поколения. Для этого частоту транспозиций надо умножить на число копий и на число поколений. Такой ориентировочный подсчет показывает, что в линии 2ЬЗ.изо2 у каждой особи должна была прибавиться примерно одна добавочная копия copia. Сравнивая фактическое число копий видно, что в линиях 2ЬЗ.изо2.и и 2ЬЗ.изо2.м число копий увеличилось с 29 до 31 на гаплоидный геном, что сходно с ожидаемым.

В линии 2ЬЗ.изо1, характеризующейся относительно более высокой частотой транспозиций (2x10"3 транспозиций на поколение на копию copia) продолжительный инбридинг привел к накоплению copia в геноме. Среднее число сайтов в линиях 2ЬЗ.изо1.и и 2ЬЗ.изо1.м достоверно возросло по сравнению с исходной линией (таблица 10; Р 0,01и Р 0,001, соответственно), но не отличается между двумя линиями. В этом случае ориентировочный подсчет, сделанный исходя из частоты транспозиций, показывает, что за 42 поколения в линии 2ЬЗ.изо1 должно было прибавиться около 3 новых копий copia на гаплоидный геном. В действительности, число копий в нашем эксперименте увеличилось с 34 до 39-40 на гаплоидный геном (таблица 10), что несколько выше ожидаемого.

Среднее число копий copia в линиях 2Ь3.1.1.2.и и 2Ь3.1.1.2.м достоверно возросло по сравнению с исходной линией 2Ь3.1.1.2, характеризующейся максимальной частотой транспозиций 2х10"2 (Таблица 11; Р 0,01 и Р 0,01, соответственно). В то же время, эти две линии не различаются между собой по числу копий. Ориентировочные подсчеты, аналогичные сделанным для двух других групп линий, показывают, что, исходя из частоты транспозиций, в линии 2Ь3.1,1.2 за 26-30 поколений должно было появиться по 20-23 добавочных копий copia на гаплоидный геном. Однако фактическое увеличение числа копий оказалось существенно меньшим, с 42 до 51-52 на гаплоидный геном.

Похожие диссертации на Исследование регуляторных элементов ретротранспозона copia и влияния его инсерций на приспособленность Drosophila melanogaster