Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 10
1. Хромосомные перестройки в природных популяциях . 10
Внутривидовой полиморфизм хромосом у дрозофилид 10
Межвидовые различия хромосомной организации у дрозофилид 14
Биологическое значение хромосомных перестроек у дрозофилид 16
2. Хромосомные перестройки и экспрессия ГЄНОЕ у представителей рода Drosophila 19
Фенотипические проявления последствий изменения генного порядка 19
Гетерохроматин 22
Закономерности мозаичного проявления приз наков при эффекте положения у Drosophila 25
Биохимические признаки и эффект положения у Drosophila 30
Гипотезы, объясняющие эффект положения у Drosophila 33
3. Ген Pgd и 6-фосфоглюконатдегидрогеназа 37
ГЛАВА II. Методика...44
1. Описание линий D.melanogaster 44
2. Приготовление гомогенатов 47
3. Проведение электрофореза 48
4. Проведение изоэлектрофокусирования 50
5. Гистохимическое выявление активности ФГД 52
6. Математическая обработка результатов денситометрирования 52
ГЛАВА III. Эксеперментальная часть
1. Анализ потомства от скрещивания мух из линии группы "рп" с линией М 56
2. Сравнение влияния различных хромосомных перестроек на экспрессию аллеля PguA 60
3. Причины, вызывающие изменение активности аллеля PgdA при различных перестройках 67
а) влияние У-гетерохроматина на экспрессию PgdA 67
б) дозовая компенсация и перенос аллеля PgdA 78
в) гистохимическое выявление активности ФГД 81
4. Стадиеспецифичность проявления действия некоторых перестроек на активность аллеля PgdA 84
5. Органоспенифичность мозаичного эффекта положения гена Pgd 93
ГЛАВА ІV. Обсуждение 112
1. Эффект транспозиции гена Pgd 112
2. Стадие- и органоспецифичность влияния перестроек на экспрессию Pgd 120
3. Экспрессия Pgd в клетках половых орга нов мух 125
Выводы 130
Список литературы
- Хромосомные перестройки в природных популяциях
- Хромосомные перестройки и экспрессия ГЄНОЕ у представителей рода Drosophila
- Описание линий D.melanogaster
- Анализ потомства от скрещивания мух из линии группы "рп" с линией М
Введение к работе
Любой эукариотический организм представляет собой систему, состоящую из огроглного числа элементов,находящихся в сложной функщональной связи друг с другом. Природа элементов и их связей, являясь продуктом длительного эволюционного процесса, такова, что обеспечивает организму, с одной стороны, состояние гомеостазиса, с другой стороны, способность приспосабливаться к определенному спектру изменений условий обитания. Какими бы не были сложными эти элементы и их взаимодействия, будь то на клеточном, организменном или популядионном уровне, в основе их структурной организации и функционирования лежат генетические процессы. Не удивительно, поэтому, что вопрос о механизмах функционирования генов постоянно находится в центре внимания широкого круга исследователей. Наиболее важной и интересной проблемой, в этом отношении, является проблема управления генетической экспрессией - проблема дифференциальной генной активности. Именно дифференциальная генная активность приводит к возникновению того многообразия клеточных типов, какое имеет место у эукариот. идет постоянный поиск моделей пригодных для изучения этой проблемы.
Изменение экспрессии, генов при различных хромосомных перестроек у D.melanogaster и представителей других видов рода Drosophiia может оказаться одной из таких моделей. В частности, наиболее хорошо изученным феноменом изменения генной экспрессии при зухроматин-гетерохроматиновых хромосомных перестройках у некоторых видов рода Drosophila является мозаичный эффект положения (Spofford, 1976). Феномен заключается в инактивации в части клеток организма гена (или группы генов), перенесенного в непосредственную близость к гетерохроматину. Клональное проявление признака, контролируемого транспозиро-ванным геном, а также раннее, в ходе индивидуального развития, определение его функционального состояния дает основание для предположения о, возможно, сходных механизмах репрессии генов при эффекте положения и процессов активации-инактивации генов в ходе развития в норме. Таким образом, изучение закономерностей репрессии генов при мозаичном эффекте положения может оказаться удобной моделью для исследования механизмов регуляции активности генов.
Этим, однако, не ограничивается интерес исследования функционирования генов при изменении их положения в геноме. Хорошо известно, что эволюционные события, приводящие к видообразованию в роде Drosophila, часто сопровождаются фиксацией специфических инверсий, а также изменением количества гетерохроматина В геноме (Sturtevant and Dobzhansky, 1936).
Инверсии, кроме их влияния на рекомбинационные события, возможно влияют на активность генов вовлеченных в перестройку. Адаптивное значение инверсионного полиморфизма в природных популяциях Drosophila обсуждалось еще Добжанским (Dobzhansky, 1962). Однако, до сих пор нет удовлетворительного объяснения того, чем же обусловлена эта адаптивность. Недавние работы Нормана и Пракаша (Жоппап and Prakash, 1980а, 19806) 'указывают на сеязь величины активности некоторых ферментов с определенными инверсиями, изолированными из природных популяции D.pseudohscura и D.persimilis. Остается, однако, неясным является ли изменение ферментативной активности в этих случаях следствием изменения экспрессии структурного гена при изменении его позищи в хромосоме, или следствием эволюционного изменения самого структурного гена. Интересно ис- следовать этот вопрос на модели с "недавно" возникшими хромо-сомными перестройками, .для того чтобы исключить возможность дивергентной эволюции изучаемых генов. Такой моделью может быть набор хромосомных перестроек, полученных в лабораторных условиях.
Изучение влияния различных воздействий на экспрессию гена может быть проведено на нескольких уровнях: на уровне синтеза FEK, на уровне синтеза белкового продукта, а также на уровне выражения морфологического признака, контролируемого изучаемым геном.
Дяя исследования блеяния различных хромосомных перестроек на генную экспрессию у D.melanogaster нами был выбран ген Pgd локализованный в X хромосоме (1-0.6; 2D3-4) (Doane and Treat-Ciemons, 1981) и яеляющийся структурным геном саермента 6~фосфоглюконатдегидрогеназы (ФГД). Проводили злектрофорети-ческий анализ спектроЕ ШГД у особей D.melanogaster гетерозиготных по двум аллелям гена Pgd, определяющих синтез изофер-ментов с различной электрофоретической подвижностью. Аллель PgdA определяет синтез быстрого варианта (ФГД-А), PgdB - медленного варианта (ФГД-В). 6-Фосфоглюконатдегидрогеназа - ди-мерный фермент, поэтому в спектре сЩ?Д из мух генотипа PgdA/ PgdB присутствует третий изофермент (ШГД-АВ) с промежуточной электрофоретической подвижностью (Коган и др., 1977; Lucch-esi et al., 1979; Young, 1966). Актішность одного из аллелей гена Pgd, вовлечённого в хромосомную перестройку, оценивали на основании измерения относительных ферментативных активностей трех изоферментов.
ФГД является ферментом пентозного шунта гликолиза и обнаруживает свою активность в большинстве тканей D.melanogaster (Ленинджер, 1974; Kankel and Hall, 1976). Это дает воз- можность исследоЕать влияние хромосомных перестроек на активность гена Pgd на различных стадиях развития организма и в различных органах.
Актуальность настоящего исследования заключается в поиске ноеых экспериментальных моделей, пригодных для решения некоторых аспектов вопроса о механизмах регуляции генной активности. Изучение закономерностей изменения экспрессии гена pgd при различных хромосомных перестройках у D.melanogaster епол-не может явиться одной из таких моделей. Известная достаточно точная патогенетическая локализация гена Pgd; наличие большого числа хромосомных перестроек, изменяющих положение этого гена в геноме D.melanogaster; а также возможность использования биохимического признака (активность фермента ФГД, структурным геном которого является ген Pgd) в качестве показателя величины активности гена Pgd, делает особенно заманчивым проведение такого исследования. Информация, полученная в результате такого исследования может оказаться полезной не только .для решения вопросов касающихся механизмов генной регуляции, но и может быть использована при . . обсуждении вопроса о значении хромосомного полиморфизма, широко распространенного в природных популяциях дрозофилид, для процессов видообразования и адаптации.
Таким образом, цель настоящей работы состояла в количественном описании влияния большого набора хромосомных перестроек на экспрессию гена Pgd, а также е выявлении среди них наиболее удобных для изучения закономерностей изменений функционирования гена при этих перестройках. Для достижения этой цели были поставлены следующие конкретные задачи: I. Анализ хромосомных перестроек в связи с их влиянием на экспрессию гена Pgd.
Количественная характеристика изменения экспрессии этого гена при различных перестройках.
Определение характера изменения экспрессии гена Pgd (мозаичный и немозаичный типы нарушения нормаяьной экспрессии) при различных перестройках.
Исследование вопроса о стадиеспепифичности проявления действия перестроек на экспрессию гена pgd.
Выяснение вопроса о существовании органной специфичности действия различных перестроек на экспрессию гена Pgd.
Научная новизна. Б ходе проведенного исследования впервые на количественном уровне изучено влияние большой выборки хромосомных перестроек на экспрессию гена Pgd. Полученные данные свидетельствуют о том, что перестройки могут иметь различный эффект на экспрессию гена - от полного исчезновения или уменьшения активности гена Pgd, до увеличения его активности при некоторых перестройках.
Изучение органоспещфичного действия некоторых перестроек на экспрессию изучаемого гена позволяет сделать вывод о существовании органоспепифических "сигналов", модулирующих либо влияние гетерохроматина на зухроматиновый локус, либо влияющих непосредственно на сам локус, делая его частично резистентным к влиянию гетерохроматина.
Практическая ценность. Продемонстрирована перспективность использования биохимических признаков как для исследования степени влияния различных хромосомных перестроек на генную экспрессию, так и для изучения закономерностей функционирования гена при отдельных перестройках, что важно .для понимания механизмов регуляции экспрессии генов у зукариот.
Г л а в a I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
Хромосомные перестройки в природных популяциях
Внутривидовой полиморфизм хромосом у дрозоюил.
Среди особей одного вида вряд ли возмошю найти .двух представителей генетически идентичных.Такую генетическую "неоднородность" на внутрипопуляционном уровне принято обозначать термином "полиморфизм". Более строго, полиморфизм - это наличие внутри одной популяции дискретных, генетически обусловленных фенотипов (Майер, 1974).
Особое место среда полиморфных признаков занимает питоге-нетический полиморфизм. Особенность заключается прежде всего в том, что в качестве признака здесь выступает организация самого генетического материала.Под патогенетическим, хромосомным, полиморфизмом следует понимать полиморфизм по числу хромосом; существование внутри одной популяции различных порядков генов, обусловленных наличием различных хромосомных перестроек; полиморфизм по длине хромосом как следствие различного содержания околоцентромерного гетерохроматина и так далее, то есть те изменения генетического материала, которые отражаются на его структурной организации. Примеры форм щтогенетического ползшорюизма у различных видов животных подробно рассмотрены Уайтом (white, 1954). Здесь же мы рассмотрим некоторые примеры внутривидового хромосомного полиморфизма у дрозофил.
Используя технику анализа гигантских политенных хромосом клеток слюнных желез некоторых представителей порядка Diptera (роды Drosophila,Sciara и Chironomus ),был ДОВОЛЬНО детально изучен хромосомный полиморфизм в природных популяциях этих насекомых. Наиболее полная и подробная информация в этом отношении доступна для представителей рода Drosophila . Внутршгопу-ляционный хромосомный полиморфизм у Drosophila обусловлен наличием Е природных популяциях, по крайней мере, трех типов хромосомных перестроек: парацентрических инверсий, перицентрических инверсий и транслокаций. Первый тип - парацентрические инверсии (не меняющие локализации центромеры) наиболее широко распространен. Среди изученных видов Drosophila , D.wiiiistoni является гидом, у которого инверсионный полиморфизм распространен наиболее значительно, чем у остальных ВИДОЕ. В различных популяциях ЭТОГО ЕИДа насчитывается более 50 инверсий (Dobzhansky et al., 1950). Однако и другие виды Drosophila обладают хромосомным полиморфизмом, хотя и не столь выраженным. Примером могут служить D.pseudobscura - 17 генных порядков, D.persirailis - 15 генных порядкоЕ, D.robusta - 5 генных порядков и .другие (White,
. 1954). Не исключение и D.nelanogaster - инверсионный полиморфизм описан в популяциях этого вида как на территории Советского Союза (Dubinin et al.,1936, Дубинин и др.,1937), так и на территории Северной Америки (warters ,1944).
Широкое распространение инверсионного полиморфизма в популяциях рода Drosophila , однако, не является всеобщим. Так исследование в зтом отношешш видов D.virilis (Patterson and Crow, 1940) и D.novomexicana (Hsu , 1952) не выявило множественных форм организации генетического материала, хотя у видов комплекса montana, филогенетически близко связанными с предыдущими видами, наблюдается инверсионный полиморфизм. Виды датой группы (repleta ) - D.repleta , D.meridiana И D.bifurca - также не обнаруживают хромосомного полиморфизма. Только по одной инверсии в составе генофонда популяций имеют виды этой же группы -D.hidei , D.canapalpa и D.raelanapalpa (Wharton ,1942).
Как отмечалось выше, почти весь инверсионный полиморфизм у Drosophila представлен разнообразием парацентрических инверсий. Однако, имеются указания на наличие и перицентрических инверсий в популяциях некоторых видов. Так было показано, что одна из аутосом D.aigonquin отличается от другой гомологичной аутосомы парой перекрещивающихся инверсий, одна из которых перицентрическая (Miller , 1939). При этом перицентричес-кая инверсия не была обнаружена в "свободном" виде - без парацентрической. Карсон И Сталкер (Carson and Stalker , 1947,1949) обнаружили две перицентрические инверсии в популяциях D.robusta . Одна из них была обнаружена только в популяциях одного ареала обитания, .другая, имеющая один из разрывов в области прицентромерного гетерохроматина, имела более широкое распространение и достаточно часто встречалась в гетерозиготном (со стандартной хромосомой) состоянии в рааличных ареалах обитания.
Еще менее распространен в природных популяциях Drosophila транслокационный полиморфизм. Только у .двух видов -D.ananassae и D.prosaitans , и только в единичных популяциях,были обнаружены особи несущие транслокапии в гетерозиготном состоянии (между .двумя аутосомами в первом случае и между аутомосой и X хромосомой EO втором) (Dobzhansky and Dreyfus ,1943;Dobzhansky and Pavan , 1943).
Кроме инверсионного и транслокационного полиморфизма некоторые виды Drosophila , например D.ananassae, полиморфны по небольшим делениям или дуплжапиям (одного-даух дисков) на концах хромосом (Dobzhansky and Dreyfus , 1953).
Обнаружен также полиморфизм лсасащийся У хромосомы. Например, в популяциях D.pseudobscura найдено, по крайней мере, пять -ТИПОЕ Y хромосом различающихся по длине и позиции центромеры (Dobzhansky and Epling , 1944).
Таким образом, большинство, если не все, видов рода Droso-phiia обладают внутривидовым полиморфизмом по организации порядка генов в хромосомах. Наиболее широко распространен полиморфизм по парацентрическим инверсиям. Возможное значение хромосомного полиморфизма для популяционной адаптации и видообразования будет рассмотрено ниже. Здесь же следует коснуться вопроса о возникновении хромосомных перестроек в природных популяциях. В этом отношеш-ш представляют интерес работы Хинтона с соавторами (Hinton et al. , 1952) и Ямагучи її Мукаи (Yamaguchi and Mukai , 1974). При анализе природных популяций D.melanogaser в некоторых из них были обнаружены хромосомы,содержащие локусы - мутаторы,повышающие частоту возникновения хромосомных аббераций. Хинтон и др. описал локус hi локализованный в 3 хромосоме и индуцирущий возникновение инверсий в .других хромосомах. При этом, при образовании инверсий в X хромосоме, одна из точек разрьша наиболее часто была расположена в околоцентромер-ном гетерохроматине. Ямагучи и Мукаи исследовали пять вторых хромосом из природных популяций D.meianogaster «, Две из них, AW и JH (названия по месту отлова мух), вызывали спонтанные перестройки в гомапогпчной второй хромосоме с частотой 4.3-20.4 ІСГ4 за:генерацию. Было обнаружено неслучайное распределение точек разрьша при образовании перестроек.
Хромосомные перестройки и экспрессия ГЄНОЕ у представителей рода Drosophila
Впервые влияния хромосомных перестроек на экспрессию ге -НОВ у D.melanogaster было опиоано Мёллером (Muller , 1930) и обозначено терміном "eversporting displacement " - "хромосомные перестройки, обуславливающие мозаичное проявление признака". Во введении к описанию этого феномена Мёллер писая: "Наиболее удивительным является, то, что далее тогда когда тран-слокащи и «другие хромосомные перестройки не нарушают правильной дозы хроматина, а лишь приводят к его перераспределению-фенотшшческий результат не всегда оказывается нормальны!". Необычное поведение нормальных генетических локусоЕ при изменении мест их локализации привлекло внимание многих исследователей и уже в 1936 г. Добжанский ( Dobzhansky , 1936) и позже Льюис ( Lev/is , 1950), суммируя результаты первых работ Е этом направлении, приходят к выводу о непосредственной связи нарушения нормального функционирования локуса с близостью к нему точки разрыва при перестройке. Добжанский,обобщив случаи нарушения экспрессии генов при различных перестройках (включая и случаи подобные с мутацией Баг ), предложил назьшать этот феномен эффектом положения. Льюис,принимая определение феномена как эффекта положения, разделил его на два типа: v -ТИП Эффекта положения ( Variegate ) И S -тіш ( Stable ). Первый тип эффекта положения заключается в мозаичном проявлении признака, второй- не приводит к мозаичности и менее распространен у Drosophila . Мозаичный эффект положения у Dro-sopniia наиболее полно изучен, результаты работ в этом направлении суммированы в обзорах Бакера ( Baker , 1968), Споф-форда ( Spofford , 1976), Беккера ( Becker , 1978). Бакер ( Baker , 1968) Епервые указал на цис-транс взаимодействия между геном ( g+ ), проявляющим мозаичность,и точкой разрыва (Ър ), а именно: особи генотипа g+bp/g bp+ - показывают мозаичное проявление признака,контролируемого геном g+ ; -у g+bp+/g Ър - нозаичность отсутствует (если только g+/s генотип обуславливает дикий фенотип). Таким образом, мозаичный эффект положения - это мозаичное проявление гена перенесенного из своего нормального места локализации в хромосоме в непосредственную близость от точки разрыва при перестройке. При этом,эта точка разрыва дожша находиться в гетерохроматиновой области этой же или другой хромосомы ( Spofford, 1976). Беккер,_ однако, считает необходимым введение дополнительных критериев для точного отнесения случаев мозаичного проявления признаков у Drosophila к эффекту положения ( Becker , 1978). Он предлагает следующие критерии: 1. (входит в определение) - одна из точек разрыва перестройки ледит Е гетерохроматине, другая - в эухроматине, вблизи от гена,проявляющего мозаичность. 2. супрессирующее действие перестройки распространяется от точки разрыва - гены близко расположенные к точке разрыва испытывают большее судрессирующие влияние, чем более удаленные гены. 3. рекомбинация между перенесенным, геном и точкой разрыва Еозращает ген в нормальное функциональное состояние. 4. обратная перестройка также снимает мозаичное проявление гена. 5. дополнительная Y хромосома сдвигает мозаичное проявление в сторону нормального фенотипа, удаление Y хромосомы - в сторону мутантного. 6. увеличение температуры содержания мух в ходе развития приводит к частичной нормализации фенотипа, уменьшение -к усилению мозаичности. 7. степень мозаичности может модулироваться генотипом родителей.
Некоторые из этих критериев заключают в себе принципиальные моменты,без рассмотрения которых невозможно построение и обсуждение гипотез,касающихся механизмов эффекта положения. Гетерохроматин,как индуктор и модулятор мозаичного проявления ГЄНОЕ при перестройках,в первую очередь заслуживает более подробного рассмотрения.
Описание линий D.melanogaster
В работе использовали лабораторные линии D.melanogaster, несущие различные хромосомные перестройки. Таблица I содержит сведения о типе перестроек и новом порядке хромосомных районов. Хромосомные перестройки группы "рп" были получены и описаны Ильиной с соавт. (Iljina et ai., 1980); поддерживались в культуре зд рп/МЛб, y31d sc8 dm В хх cfo Жб,у 1(і sc8 dm B/Y . Самки жб/жб, появляющиеся в потомстве, были стерильны вследствие гомозиготности по dm. Перестройки ТЕЮО ж ТЕЮ1 получены в лаборатории Гвоздева В.А. (Институт молекулярной генетики АН СССР, Москва) в результате рекомбинации при скрещиваниях о_о_ рп2 (или рпЗ)/жб пс dc/y ас sc w/Y и в дальнейшем поддерживались В ВИДЄ С(1)ВМ,у v f/Y х TE100/Y И С(1)НМ, w f/Y х TE101/Y . Остальные линии были взяты из фонда Института, их подробное описание можно найти у Линдсли и Грела (Lindsley and Grell, 1968).
Перестройка wvc0 поддерживалась в линии ІШ: у ас sc w/y ас sc w; Dp(1,3)wvc0/D xx d# у ас sc w/Y; DpO,3)wVCO/D . Кроме линий несущих перестройки перечисленные в таблице I, в работе использовали следующие линии D.melanogaster: линия М - имела X хромосому с маркерами у ас sc w; линия Oregon - дикого типа;
ЛИНИЯ J63 - зд C(1)BM,w f/Y хх defy ас sc Pgd" Zw /Y (Pgd , Zw" -гены, обуславливающие нулевую ферментативную активность ферментов 6-фосфоглюконатдегидрогеназы и глюкозо-6-фосфатде-гидрогеназы);
-ЛИНИЯ №7 - оо у ас sc w/y ас sc w; T(Y,2),y+ Bs/+ xx dVy ac sc w/Y; T(Y,2),y+ Bs/+. Транслокация T(Y,2)A87 представляет собой вторую хромосому, "разорванную" в районе 40 (патогенетическая локализация на политенной хромосоме) и "подвешенными" к образовавшимся концам короткого (Ys) и длинного (YL) плеч Y хромосомы. Ys маркирован геном у+, YL - геНОМ Bs (Lindsley et al., 1972).
Все перечисленные линии, кроме М и Д8, имели X рхомосо-му, несущую аллель гена Pgd (PgdA),определяющий синтез фермента ЕГД с высокой электрофоретической подвижностью; х(у ас sc w ) хромосома несла аллель PgdB, определяющий синтез медленного варианта ФГД. Перестройки ТЕЮО и ТЕ101 несли оба аллеля. Самцы и самки линии Ш несли также оба аллеля гена pgd - PgdA в дупликации, PgdB - в маркированной X хромосоме.
Зяектрофоретическому анализу подвергались особи полученные при скрещивании: зд R,PgdA/EH6 хх /cf у ас sc PgdB w/Y (R - перестройка), ИМеЮЩИХ ГеНОТИП R,PgdA/PgdB.
На личиночной стадии особей с генотипами R,PgdA/y ас sc PgdB w и жб,у PgdA/y ас sc PgdB w различали по окраске ротового крючка (фенотипически различали генотипы у+/у и у/у). Из линий с перестройками ТЕЮО и ТЕЮ1 анализировались самцы, из линии Ш - самцы и самки без предварительного скрещивания.
Поддержание линий и скрещивания проводились при температуре 25С.
Приготовление гомогенатов.
Отдельных мух или личинок конца третьего возраста гомогенизировали в 10-12 мкл раствора следующего состава: 0.25 М трис-HCl буфер, рН 8.3, 0.8 шМ ЭДТМа2, 0.01$ 2-меркаптоэта --нола, 0.1 М НАДФ, % сахарозы. Гомогенат центрифугировали на центрифуге К-24 при IOOOOg 15-20 минут. Супернатант использовали для электрофоретического анализа спектра ФГД.
При анализе ШГД из личиночных органов на указанный выше объем раствора собирали отдельные органы из следующего числа личинок конца третьего возраста: жировые тела - 2-4, слюнные железы - 15-20, имагинальные диски - 30-40, нервные ганглии -30-40. Дяя анализа 5ГД из частей тела и яичников взрослых мух брали 10-12 голов, 1-2 брюшка и 7-Ю яичников.
Гомогенизирование, центрифугирование, а также сбор органов проводили при температуре 4-6С.
3. Проведение электрофореза.
Зяектрофоретический анализ спектров ШГД проводили в плоских 1% полиакриламидных блоках геля размером 130x130x2 мм. Одновременно можно было проводить анализ 12 образцов. Для приготовления раствора для полимеризации использовали следующие растворы: раствор А: 40$ (w/w) акриламид 1.3% (\7//)бисакриламид раствор Б: 0.5 М трис-HCl буфер 0.016 М ЭДШа2 раствор В: IC$ (v/v) ТШЕЩ
Для приготовления 25 мл раствора для полимеризации брали 4.4 мл раствора А, 2.5 мл раствора Б, 0.19 мл раствора В, .дистиллированной воды до 25 мл и. добавляли 13 мг персульфата аммония. Полтлеризащя геля продолжалась 20-25 минут, блоки до использования могли храниться во влажной камере до 7 дней при температуре 4-8С.
Анализ потомства от скрещивания мух из линии группы "рп" с линией М
В работе электрофоретическому анализу подвергались о с нормальным фенотипом полученные при скрещивании: оо R,PgdA/PM6, у ас sc to В за dc/ y sc PgdBw/Y(R - В данном случае перестройка группы "рп" ). При анализе спектров (ЕГД из личиночных органов было необходимо отличать личинок с фенотипом у+ . Однако, сложный характер некоторых перестроек сделал необходимым проверку такой возможности.
Таблица 2 содержит результаты подсчета мух с различным фенотипом полученных при приведенном выше скрещивании.
Результаты скрещиваний показывают, что только в случаях с перестройками рп2 и рпз можно уверенно различать нужные генотипы на личиночной стадии.
Что же касается появления "дополнительных" фенотшшчес-ких классов в других случаях, то представляется возможным следующее объяснение. Если принять следующие обозначения хромосомных фрагментов при перестройке pn25 : Df(1),y+ ас+ PgdA = 1A-2E1-2/20A-F Tp(1,3),w В dm = 61-70A5-6/2E1-2-20A1-2/70A5-6-100F т ж обозначить у ас sc Pgd w - хромосому как X,, а шб,у sc PgdA в dm как шб , то таблица 3 даст представление о возможных генотипических и фенотипических классах в Р1 при скрещивании зд рп25/Ш xs dRfWA фенотипами из потомства от рассматриваемого скрещивания. Результаты электрофоретического анализа хорошо согласуются с предлагаемым объяснением расщепления в БЧ и, в частности, доказывают существование в одном фенотипическом классе (орв/в+) двух генотипических - Df (1 )/жб/х4 , Df (1 )/EM6/Y; Тр( 1, з)/+ .
На рисунке 3 представлены электрофоретические спектры ФГД из взрослых мух,несущих различные хромосомные перестройки. На рисунке 4 показаны результаты денситометрирования некоторых из этих спектроЕ. Для сравнения влияния различных хромосомных перестроек на экспрессию аллеля Pgd у самок или самцов D.melanogaster генотипа R,Pgd /Pgd были оценены процентные доли активности этого аллеля по отношению к р активности аллеля Pgd . Таблица 4 дает представление об этих величинах для изучаемых перестроек. Данные приведенные Е таблице 4 были получены на основании не менее 12 измерений соотношения активностей изоферментов ФГД .для каждого случая. В таблице 4 приведены также вероятности различия величин активности аллеля Pgd при различных перестройках и его активности у мух не несущих перестроек (генотип: Oregon, PgdA/PgdB ). Кроме этого в таблице приведены величины дефицита гетеродимерного изофермента ФГД-АВ в спектрах щгд из мух несущих эти перестройки.
Среди 21 исследованной перестройки, две из них ( рп38 и рп45 ) обуславливают полную потерю активности аллеля PgdA . Перестройка рп38 является делецией по району, содержащему ген Pgd, рп45 - цитологически определена как инверсия (iiji-па,1979 » таблица 1 ), однако, возможно также содержит делецшо по этому гену.
Сравнение величин активности аллеля PgdA в случае остальных перестроек с его активностью у самок Oregon,PgdA/PgdB позволяет разделить все перестройки на две группы. В первую группу попадают перестройки и4, wvc0 (у самцов)., рп1, рп2, рпЗ, pn20, pn25, pn40, ТЕ100, И3101 И sc10 . АКТИВНОСТЬ аллеля PgdA у мух несущих эти перестройки достоверно отличается (сравнение по t - критерию Стыодента) от активности PgdA У мух не несущих перестроек. Интересно отметить, что в одном случае (га4 ) наблюдается достоверное повышение активности аллаля. Ко второй группе перестроек, не вызывающих заметного влияния на экспрессию аллеля PgdA,относятся следующие: з 105, ваб, wvco (у самок), рп7, рп24, рпЗб, scv2, в Ь8 ап260-22 SC , SC
Перестройка Dp(l,3)wvco попадает в обе группы, в зависимости от того на каком генетическом фоне (самца или самки) определялась активность аллеля Pgd .
Следует особо отметить перестройку рп40 . Индивидуальный анализ самок генотипа pn40,PgdA/PgdB выявил у них значительное колебание активности аллеля Pgd . Как видно из результатов приведенных в таблице 5 , представляющей результат анализа 13 самок, величина активности аллеля колебалась от 25 до 83$. Индивидуальной изменчивости была подвержена также величина дефицита изофермента ФГД-АВ в спектрах ФГД из этих мух ( 2.3 - 23.0$). Столь значительных колебаний этих величин не было обнаружено ни при одной другой исследованной перестройке.
