Содержание к диссертации
Введение
I. Введение З
II. Обзор литературных данных 7
ІІ.1. Введение 7
П.2. Антибактериальные эффекты ионов серебра 8
11.2,1. Механизмы действия ионов серебра 8
П.2.2. Резистентность к ионам серебра 11
Действие наночастиц серебра 13
11.3.1. Механизмы действия НЧС 14
на ингибирование наночастицами микроорганизмов при облучении светом 19
П.4.1. Фотокаталитический механизм 19
II. 4.2. Фототермальный эффект 27
11.5. Синтез наночастиц 29
П.5.1. Биосинтез паночастиц с использованием бактерий 30
11.6. Заключение 45
III. Материалы и методы 47
ПІЛ. Среды и условия культивирования бактерий Exoli, Pseudomonas, Serratia 47
Ш.2. Штаммы, плазмиды и олигонуклеотиды 47
Ш.З. Используемые наночастицы серебра, ионы серебра и золота 50
III.4. Определение минимальных ингибирующих концентраций (МИК) 50
Ш.5. Кинетика роста Е. coli АВ1157 в присутствии наночастиц серебра 51
III.6. Определение образования биопленок 51
Ш.7. Влияние соединений серебра и золота на деградацию зрелых биопленок 52
111.8. Определение живых и мертвых клеток в составе биопленок 52
111.9. Влияние соединений серебра и золота на выживаемость клеток бактерий в стационарной и логарифмической фазах роста, а также в аэробных и анаэробных условиях роста 53
ШЛО. Передача плазмид рМЕ6863 и рМЕбООО 53
ПІЛ 1. ПЦР — амплификация 54
III. 12. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле 54
111.13. Определение продукции АГЛ 55
III. 14. Условия получения наночастиц золота для оптоперфорации клеточной стенки Anabaenasp.PCClUO 55
111.15. Оптоперфорация клеточной стенки цианобактерий и биопленок бактерий Е. coli 55
111.16. Биогенез наночастиц серебра и золота 56
і III.17. Спектрофотометрия суспензии клеток с наночастицами серебра и золота 57
III. 18. Электронная микроскопия 57
IV. Результаты 58
IV. 1. Изучение действия ионов и наночастиц серебра на клетки бактерий 58
IV.1.1. Влияние ионов и наночастиц серебра па рост бактерий 59
IV. 1.2. Действие ионов и наночастиц серебра на формирование биопленок бактериями 61
IV. 1.3. Влияние НЧС на деградацию биопленок бактерий и гибель клеток в них .63
IV. 1.4. Изучение механизмов повышенной резистентности биопленок E.coli к действию ионов и наночастиц серебра 65
IV. 1.5. Чувствительность к серебру клеток Е. coli с мутациями в генах, участвующих в репарации ДНК, глобальной регуляции экспрессии генов бактерий, синтезе транспортных белков поринов 67
IV. 1.6. Quorum Sensing регуляция и действие ионов и наночастиц серебра на бактерии 72
IV.2. Изучение действия ионов и наночастиц золота на клетки бактерий 74
IV.2.1. Влияние ионов золота на рост бактерий 74
W.2.2. Действие ионов золота на формирование биопленок бактериями 75
W.2.3. Влияние ионов золота на деградацию биопленок бактерий и гибель клеток в них 76
IV.2.4. Изучение механизмов повышенной резистентности биопленок E.coli к действию ионов золота 78
W.2.5. Чувствительность к ионам золота клеток Е. coli с мутациями в генах, участвующих в глобальной регуляции экспрессии генов бактерий, репарации ДНК, синтезе транспортных белков поринов 79
IV.2.6. Влияние наночастиц золота нарост бактерий 81
IV.3. Фемтосекундная оптоперфорация стенки цианобактерий Anabaena sp. РСС 7120
wtB присутствии наночастиц золота 81
IV.4. Разработка метода разрушения биопленок с помощью лазерного облучения наночастиц золота 85
IV.5. Получение наночастиц металлов биологическими способами 87
V. Обсуждение результатов 92
VI. Выводы
VII. Список литературы 101
VIII. Благодарности 119
- Антибактериальные эффекты ионов серебра
- Фототермальный эффект
- Используемые наночастицы серебра, ионы серебра и золота
- Действие ионов и наночастиц серебра на формирование биопленок бактериями
Введение к работе
Актуальность проблемы
В последние годы все увеличивающееся внимание исследователей привлекают вопросы, связанные с биомедицинским использованием наночастиц металлов. Это объясняется, прежде всего, насущной необходимостью разработки принципиально новых лекарственных препаратов против инфекций микроорганизмов, что обусловлено широким распространением форм патогенных бактерий - возбудителей различных острых и хронических инфекций, устойчивых к антибиотикам и другим антибактериальным средствам. Кроме того, существенные перспективы может дать в будущем применение лекарственных средств на основе наноматериалов в онкологии и многих других важных областях медицины. Основой этого послужили значимые успехи, достигнутые в разработке методов получения наночастиц металлов различной формы и размера, нанокомпозитов и покрытий устройств медицинского назначения. Активно проводятся исследования перспектив использования наночастиц (НЧ) с адресной доставкой лекарств для антираковой терапии, конструируемых на основе магнитных наночастиц и наночастиц золота, активируемых светом, что обуславливает их фототермальный эффект.
Наиболее изученными и используемыми в биомедицинских исследованиях являются наноматериалы на основе серебра. Соединения серебра проявляют высокую токсичность по отношению к широкому ряду микроорганизмов, и в силу этого они эффективно применяются в медицине против разнообразных инфекций, в том числе в виде наночастиц, покрытий различных имплантируемых устройств, дезинфицирующих фильтров и т. п. Несмотря на то, что бактерицидные свойства соединений серебра хорошо известны и давно используются человеком, биохимические механизмы их действия изучены лишь частично.
В настоящее время развернут широкий фронт исследований наночастиц металлов и полупроводников, их действия на микроорганизмы и другие живые клетки, а также перспектив их использования в биомедицине.
Большую проблему для медицины представляет способность патогенных бактерий формировать биопленки - сообщества бактерий, прикрепленные к различным поверхностям и окруженные матриксом, состоящим из внеклеточных полисахаридов, белков, нуклеиновых кислот и др. Устойчивость бактерий, обитающих в биопленках, к лекарственным препаратам многократно повышена по сравнению с планктонно растущими бактериями. К настоящему времени действие НЧС на биопленки исследовано крайне мало.
Кроме изучения свойств и использования наноматериалов, исследования многих авторов направлены на разработку биологических подходов к синтезу НЧ различных металлов. Изучение биогенеза НЧ с помощью экстрактов растений, грибов, дрожжей, водорослей, бактерий становится все более важным, поскольку такой процесс их получения дает высокий процент выхода готовых НЧ, практически нетоксичен, экономически выгоден, позволяет контролировать их размер и форму. Следует отметить, что перечисленные биологические объекты используются в биосинтезе НЧ как для восстановления ионов металлов до наночастиц, так и для стабилизации образующихся частиц за счет продуцируемых белков, полисахаридов, липидов клеточной стенки и т.д.
Данная работа посвящена изучению действия ионов и наночастиц серебра и золота на бактериальный рост, образование биопленок и разрушение зрелых биопленок. Получены данные о некоторых аспектах механизмов действия соединений серебра и золота на клетки. Кроме того, проведены исследования, направленные на получение наночастиц металлов биологическим способом с использованием различных штаммов цианобактерий и Azotobacter. Разработан метод оптоперфорации клеточной стенки цианобактерий в присутствии наночастиц золота. Этот метод был использован для разрушения бактериальных клеток и биопленок наночастицами золота, облученными лазерным импульсом ближнего ИК диапазона.
Цели и поставленные задачи
Целью работы было сравнительное исследование антибактериальных эффектов ионов и наночастиц серебра и золота, изучение некоторых аспектов механизма их действия и разработка методов получения наночастиц золота с помощью бактерий.
Конкретными задачами работы были:
изучение влияния ионов и наночастиц серебра (НЧС) и золота (НЧЗ) на рост бактерий, формирование и деградацию биопленок;
изучение чувствительности к ионам серебра, золота и НЧС клеток E. coli с мутациями в генах, участвующих в репарации ДНК, с целью выяснения роли разных типов репарации ДНК в защите клеток при действии этих соединений;
определение роли транспортных белков поринов в антибактериальном действии соединений серебра и золота;
исследование влияния ионов и наночастиц серебра и золота на клетки бактерий, дефектные по глобальным регуляторам экспрессии генов;
разработка метода и изучение оптоперфорации стенки цианобактерий и биопленок в присутствии НЧЗ;
разработка методов получения НЧ металлов биологическим способом с использованием бактерий.
Научная новизна и практическая ценность работы
Определены концентрационные закономерности ингибирующего действия ионов серебра, золота и НЧС на рост и формирование биопленок грамотрицательными бактериями. Показано, что эти соединения вызывают деградацию зрелых биопленок Escherichia coli и гибель клеток в них в концентрациях значительно более высоких, чем те, которые подавляют планктонный рост бактерий и формирование биопленок. В работе были исследованы механизмы повышенной резистентности биопленок E. coli к действию НЧС и ионов серебра и золота.
Проведены исследования некоторых аспектов механизмов действия соединений серебра и золота на бактериальные клетки. Впервые показано, что мутации в генах, ответственных за репарацию окислительных повреждений ДНК (mutY, mutS, mutM, mutT, nth), увеличивали чувствительность клеток E. coli к ионам серебра и НЧС; повидимому, эти гены вовлечены в восстановление окислительных повреждений ДНК, связанных с действием соединений серебра. Однако, мы не обнаружили подобных эффектов при действии ионов золота. Полученные результаты показывают, что механизмы бактерицидного действия ионов золота и соединений серебра (ионов и НЧС) на бактериальные клетки существенно различаются.
Не наблюдалось различий в чувствительности к ионам серебра, золота и НЧС у штаммов E. coli дикого типа и штаммов, дефектных по эксцизионной репарации (uvrA, uvrB мутанты), SOS-репарации и рекомбинации (recA, lexA, recBC, umuC и umuD мутанты). Это показывает, что чувствительность бактерий к соединениям серебра и золота не связана с повреждениями ДНК, которые могут быть восстановлены при участии этих систем. Не обнаружено значительных различий в чувствительности штаммов, дефектных по сигме S субъединице РНК-полимеразы и Quorum Sensing регуляции, т.е. эти глобальные регуляторы не играют существенной роли в контроле чувствительности/ устойчивости к исследуемым веществам.
Впервые показано, что мутантные штаммы E. coli, лишенные белков поринов OmpF или OmpC, были существенно более устойчивыми к НЧС по сравнению со штаммом дикого типа. Поры, образуемые поринами OmpF и OmpC, имеют размер 1 - 1,1 нм, поэтому через них могут проходить ионы серебра, выделяемые наночастицами, но не исследованные НЧС (8,3 ± 1,9 нм). Эти данные свидетельствуют о том, что антибактериальное действие НЧС на клетки E. coli связано, главным образом, с проникновением ионов серебра через клеточную стенку.
Полученные в данной работе результаты расширяют наши представления о механизмах действия соединений серебра и золота на бактериальные клетки.
Разработан метод оптоперфорации фемтосекундными (~ 100 фс) лазерными импульсами ближнего ИК диапазона клеточной стенки цианобактерий и биопленок E. coli в присутствии НЧЗ. Показано, что наночастицы золота за счет плазмонного резонанса понижают порог оптоперфорации, и при этом формируются субмикронные отверстия в стенке бактерий и биопленках.
Проведены эксперименты по получению наночастиц металлов с помощью бактерий. Получены стабильные НЧЗ при культивировании цианобактерий и Azotobacter в среде, содержащей соль золота. Была исследована возможность получения НЧ золота при варьировании условий культивирования.
Практическая значимость работы связана, прежде всего, с перспективностью использования наночастиц серебра и золота в качестве антибактериальных агентов. Полученные закономерности действия этих соединений на рост бактерий и биопленки могут быть полезны для разработки методов их применения в антибактериальной терапии и других областях их использования. Представляют интерес для практики также данные о получении стабильных НЧЗ биологическим методом, с помощью бактерий.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на конференции «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах», Москва (26-29 мая 2009 г.); I и II Международном конкурсе научных работ молодых ученых в области нанотехнологии, Москва (3-5 декабря 2008 и 6-8 октября 2009 г.); международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова, Москва-Пущино (28 сентября -1 октября 2009 г.); 3 Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика - 2010», Москва (21-25 июня 2010 г.); 5 Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой», Саратов (сентябрь, 2010 г.); XXIV Зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии»,
Москва (7-9 февраля 2012 г.); 7th European meeting on solar chemistry and photocatalysis: environmental applications, Porto, Portugal (17-20 июня 2012); II International Conference on Antimicrobial Research (ICAR2012), Lisbon, Portugal (21-23 ноября 2012); ежегодных отчетных научных конференциях ИМГ РАН (2009-2012 г.), а также регулярных семинарах Лаборатории регуляции экспрессии генов микроорганизмов ИМГ РАН.
Публикации
По теме работы опубликованы 4 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем работы
Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы. Работа изложена на
страницах машинописного текста, включая таблиц, рисунков. Список
цитируемых литературных источников включает работ.
Антибактериальные эффекты ионов серебра
Антимикробные свойства соединений серебра хорошо известны и используются очень давно. Ионы и наночастицы серебра проявляют широкий спектр действия, они активны против патогенных бактерий, вирусов, грибов. С давних времен соединения серебра использовались в медицине, в основном, для местного применения - при лечении ран, ожогов, хронических язв, для профилактики инфекций глаз, в стоматологии и т.д. Об антимикробной активности ионов серебра впервые заговорили в XIX веке, и уже к 1920 году раствор коллоидного серебра был в перечне лекарственных средств США (FDA) (Russell, Hugo et al. 1982). Интерес к серебру несколько снизился после открытия и введения в медицинскую практику антибиотиков, которые стали применяться как основные лекарственные препараты в антимикробной терапии. Однако, внимание к соединениям серебра, как лекарственным средствам, в скором времени резко возросло в связи с широким распространением форм патогенных бактерий, резистентных к антибиотикам. Патогенные бактерии, устойчивые к соединениям серебра, в клинике встречаются редко, в гораздо меньшем количестве, чем формы, устойчивые к другим лекарственным препаратам. В связи с этим широкое применение серебра (в форме 0,5% раствора AgNOs) возобновилось вновь в 60-е годы XX века (Моуег, Brentano et al. 1965; Price and Wood 1966). В 1968 году впервые нитрат серебра в смеси с сульфамидным антибиотиком стал выпускаться в виде сульфадназин крема и использоваться в виде запатентованного лекарственного препарата (SSD), который обладал широким спектром действия и, в основном, применялся при лечении ожогов. Изучение действия ионов серебра на микроорганизмы показало, что серебро убивает около 650 видов болезнетворных микроорганизмов (Klasen 2000; Dibrov, Dzioba et al. 2002; Silver 2003; Sondi and Salopek-Sondi 2004; Silver, Phung le et al. 2006; Chopra 2007; Singh, Singh et al. 2008).
В настоящее время соединения серебра входят в состав антиссптическігх повязок, масок, стелек, прокладок. Создаются стерильные материалы для изготовления спецодежды для работы в операционных; ведется антисептическая обработка медицинских имплантантов, включая катетеры, протезы, подкожные сенсоры, которые обычно подвергаются обрастанию бактериальными пленками (Dubas, Kumlangdudsana et al. 2006; Li, Leung et al. 2006; Maneerang, Tokura et al. 2008). Кроме медицины, соединения серебра используются как биоциды для очистки и дезинфекции питьевой воды, при хранении продуктов и пр. Результаты применения соединений серебра в качестве антимикробного средства рассмотрены в обзорах (Russell and Hugo 1994; Silver 2003; Silver, Phung Ie et al. 2006; Chopra 2007; Rai, Yadav et al. 2009; Sharma, Yngard et al. 2009; Singh, Singh et al. 2008).
Особое внимание в последние годы было обращено на изучение наночастиц серебра (НЧС). Последние, как и другие наночастицы, характеризуются уникальными свойствами, связанными с высоким отношением их поверхности к объему, что способствует большой эффективности их действия. В многочисленных литературных источниках описано бактерицидное действие НЧС, показано, что они обладают также антивирусными и фунгицидными свойствами (Sondi and Salopek-Sondi 2004; Morones, Elechiguerra et al. 2005; Sun, Chen et al. 2005; Panacek, Kvitek et al. 2006; Kim, Kuk et al. 2007; Pal, Так et al. 2007).
К настоящему времени получено весьма большое количество новых композитных материалов, разработаны различные покрытия, содержащие НЧС и оказывающие антимикробное действие (Balogh, Swanson et al. 2001; Егорова, Ревина et al. 2001; Zhang, Yu et al. 2003; Furno, Morley et al. 2004; Yuranova, Rincon et al. 2006; Zaporojtchenko, Podschun et al. 2006; Gong, Li et al. 2007; Roe, Karandikar et al. 2008). Для успешного использования соединений серебра в качестве антибактериальных агентов необходимо проведение детальных экспериментальных исследований их действия на микроорганизмы.
Известно, что НЧС высвобождают ионы серебра (Furno, Morley et al. 2004; Pal, Так et al. 2007; Roe, Karandikar et al. 2008). Относительно ингибирующего действия НЧС на бактериальную клетку обсулсдается вопрос, связан ли ігх эффект только с влиянием выделяемых ионов серебра, или НЧС действуют также и независимо от них.
Несмотря на то, что действие ионов серебра в составе различных химических соединений изучается уже давно, механизм антимикробных эффектов серебра еще не полностью понят. Было установлено, что очень низкие концентрации AgN03 легальны как для грамположительных, так и для грамотрицательных бактерий (Bragg and Rainnie 1974; Schreurs and Rosenberg 1982; Ghandour, Hubbard et al. 1988). Известно, что ионы серебра оказывают плейотропное действие на различные клеточные процессы; однако, не ясно, имеется ли одна главная мишень действия, или ионы серебра взаимодействуют со многими клеточными мишенями. D;;.«4 i Наиболее существенные изменения при действии на клетки ионов серебра наблюдаются в цитоплазматической мембране. Было обнаружено, что ионы серебра вызывают массовое вытекание протонов, в том числе, ионов калия, через мембрану. В результате действия ионов серебра цитоплазматическая мембрана становится проницаемой для протонов, меняется их градиент скорости протекания (Schreurs and Rosenberg 1982; Ghandour, Hubbard et al. 1988; Dibrov, Dzioba et al. 2002; Jung, Koo et al. 2008). Ионы серебра подавляли дыхание клеток Escherichia coli, причем интересно, что бактерии, обработанные серебром, проявляли характерную начальную стимуляцию дыхания, но в дальнейшем дыхание прерывалось и клетка погибала. Влияние Ag+ на дыхание определяли по изменению концентрации кислорода в суспензиях клеток в присутствии ионов серебра и без них. Кроме того, для изучения взаимодействия Ag+ с дыхательной цепью Е. coli измеряли превращение феррицианида (как акцептора электронов) в ферроцианид бактериями при дыхании; эти эксперименты подтвердили, что действие на клетки Ag+ приводит к нарушению дыхательной цепи, которое препятствует эффективному прохождению электронов в электрон-транспортной цепи (Holt and Bard 2005). Неконтролируемое дыхание может вызывать также образование супероксидных и гидроксильных радикалов, которые крайне вредны для клетки.
Согласно различным литературным источникам, ионы серебра разобщают дыхательную цепь и окислительное фосфорнлирование (Schreurs and Rosenberg 1982), нарушают протон-движущую силу цитоплазматической мембраны (Dibrov, Dzioba et al. 2002).
Многочисленные электронно-микроскопические исследования позволили установить, что при действии на клетки ионов серебра цитоплазматическая мембрана, содержимое цитоплазмы и наружная оболочка клеток грамотрицательных и грамположительньгх бактерий претерпевали структурные изменения, при этом ипгибировалось клеточное деление, цитоплазматическая мембрана отделялась от клеточной стенки, клеточная оболочка повреждалась и цитоплазма начинала вытекать из клеток (Belly and Kydd 1982; Feng, Wu et al. 2000; Yamanaka, Hara et al. 2005).
Фототермальный эффект
К настоящему времени убедительно продемонстрировано, что металлические наночастицы и наночастицы широкозонных металлоксидных полупроводников способны эффективно ингибировать болезнетворные организмы при облучении светом видимого или ближнего ультрафиолетового диапазонов (УФ-А). Бинарные наночастицы, состоящие из металлической и полупроводниковой частей, проявляют синергизм в фотоцидном эффекте. В отличие от бактерицидного эффекта, вызванного жестким ультрафиолетовым излучением УФ-С диапазона, используемого при УФ-дезинфскции, свет ближнего УФ-А диапазона не приводит к гибели бактериальных клеток и почти не опасен для высших организмов. Механизмы фотоцидного действия наночастиц, активированных светом для ингибирования бактерий, различны для разных наночастиц. В случае широкозонных полупроводников, таких как ТіОг, основным механизмом ингибирования бактерий является фотокаталитический механизм. В случае наночастиц золота ингибирование происходит, по-видимому, за счет фототермального эффекта.
Одним из первых сообщений об инактивации болезнетворных бактерий в присутствии наночастиц ТіОг под действием УФ-А света в диапазоне от 360 нм до 400 нм стала публикация японских исследователей в 1985 году (Matsunaga, Tomoda et al. 1985). Впоследствии было установлено, что под действием рассеянного солнечного света в присутствии ТіОг происходит инактивация грамотрицательных и грамположительных бактерий (Ireland, Klostermann et al. 1993; Kikuchi, Sunada et al. 1997; Shchukin, Ustinovich et al. 2004; Coleman, Marquis et al. 2005; Ogino, Farshbaf Dadjour et al. 2006; Raulio, Pore et al. 2006; Subba Rao, Zhuo et al. 2006), вирусов (Watts, Kong et al. 1995; Lee, Nakamura et al. 1998) и раковых клеток (Kubota, Shuin et al. 1994; Blake, Maness et al. 1999). Было показано, что если ТіОг используется в виде суспензии наночастиц, то возможно проникновение наночастиц внутрь бактерии и последующее повреждение клетки (Kubola, Shuin et al. 1994). Гибель клеток бактерий происходила и при использовании пористых пленок ТІО2 (Kikuchi, Sunada et al. 1997; Kiwi and Nadtochenko 2005; Nadtochenko, Rincon et al. 2005).
К настоящему времени накоплен богатый экспериментальный материал относительно действия наночастиц ТіОг на бактерии при возбуждении первых УФ-А светом. Одним из доказательств фотокаталитического механизма их действия является тот факт, что увеличение концентрации фотокатализатора ТЮг и интенсивности УФ-А света ускоряет гибель Bacillus anthracis (Prasad, Agarwal et al. 2009). Экспериментально продемонстрировано, что существенное возрастание гибели бактерий S. aureus и Е. coli наблюдается при достижении спектральной границы фундаментальной полосы поглощения полупроводника ТЮг (около 380-400 нм). Эти факты указывают на фотокаталитический механизм ингибирования бактериальных клеток в системе ТЮг при облучении их светом УФ-А диапазона. В дальнейшем было установлено, что эффективная инактивация грамотрицательных и грамположительных бактерий достигается при условии контакта между наночастицами ТЮг и стенкой клетки (Bui, Pigeot-Remy et al. 2008). В случае суспензии ТіОг эффективность гибели клеток возрастает, если наночастицы Ті02 адсорбируются на поверхности клетки. Соответственно, при использовании наноструктурированных пленок ТЮг бактериальные клетки должны сорбироваться на поверхности пористой пленки ТіОг, чтобы достичь высокой эффективности ингибирования при УФ-А облучении, либо необходимо сшивать частицы ТіОг с антителами с помощью различных лигандов, тем самым осуществляя адресную доставку исследуемых соединений. Адсорбция бактериальных клеток и диоксида титана существенно зависит от поверхностного заряда наночастиц ТіОг и стенки бактерии. Поверхностный заряд наночастиц определяется рядом факторов - изоэлектрической точкой, зависящей от метода приготовления ТіОг, рН и состава электролита. Таким образом, свойства ТіОг и окружающая среда существенно влияют на эффективность фотобактерицидного эффекта.
Фотокаталитнческая инактивация бактериальных клеток схематически представлена на рис. 1. Поглощение кванта света с энергией, превышающей ширину запрещенной зоны в ТіОг, приводит к парной генерации электрона в зоне проводимости и дырки в валентной зоне.
Используемые наночастицы серебра, ионы серебра и золота
Наночастицы металлов монетной группы, особенно серебро, золото и медь, имеют высокую экстинкцию в видимом диапазоне света, связанную с локализованным поверхностным плазменным резонансом (ППР). Это свойство наночастиц металлов находит применение в медицине и биологии. Высокие сечение поглощения и рассеяния света металлических наночастиц, наряду с высокой поляризуемостью и нелинейной восприимчивостью, позволяют предложить новые подходы в визуализации биотканей (Jain, Huang et al. 2007). Поглощение металлическими наночастицами кванта света в области прозрачности биологической ткани позволяет использовать наночастицы металлов в методе фототермальной терапии (Jain, Huang ct al. 2007) (рис. 2). Показано, что поглощение квантов света лазерного излучения наночастицами золота различной формы и размером до 100 нм обеспечивает их разогрев, который может составлять от нескольких градусов до многих сотен градусов (Zharov, Mercer et al. 2006). Использование импульсного режима облучения светом обеспечивает локальный разогрев области вблизи наночастицы. Характерная толщина слоя разогрева с использованием импульсного лазера с длительностью импульса 8 нсек может достигать 40 нм (Zharov, Mercer et al. 2006). Таким образом, благодаря точечному разогреву в области нахождения наночастицы обеспечивается направленное действие на клетку-мишень. лазер
Это свойство используется для разрушения раковых клеток, адсорбировавших наночастицы золота; показано, что разогрев от 43 градусов и выше вызывает апоптоз раковой клетки (Jain, Huang et al. 2007). К поверхности золотых наночастиц можно успешно присоединить молекулы антител, таким образом можно достичь их афинного связывания с клеткой-мишенью. Опыт, достигнутый в фототермальной терапии рака, в последнее время стал переноситься на направленное разрушение бактериальных клеток (Zharov, Mercer et al. 2006; Pissuwan, Valenzuela et al. 2007; Norman, Stone et al. 2008). В условиях высоких потоков лазерного излучения была изучена гибель грамположительных бактерий S. aureus при селективной адсорбции на стенке бактерий 10-, 20-, и 40-нм золотых наночастиц (Zharov, Mercer et al. 2006). Наночастицы золота были конъюгированы с антителами против белка А стафилококка. Помеченные таким образом бактерии облучали сфокусированным лазерным светом (420-570 нм, 12 нсск, 0.1—5 Дж/см2, 100 импульсов). В таких условиях разогрев был высоким, и в пристеночном слое воды происходило закипание с образованием нанопузырьков. Разрушение клетки наблюдали микроскопически с использованием оптической и электронной микроскопии. При этом происходила ускоренная гибель бактерий.
Принципы фототермальной терапии были использованы также для разрушения микропаразитов Toxoplasma gondii (Zharov, Mercer et al. 2006). НЧЗ были коньюгированы с антителами Т. gondii. Для облучения использовали лазерный диод на длине волны 650 нм мощностью 100 мВт. Статистически значимый эффект действия излучения достигали при потоке мощности 0,7 Вт/см . При потоке мощности 50 Вт/см2 скорость гибели Т. gondii возрастала в 4-5 раз для клеток, помеченных наночастицами золота, по сравнению с контрольными клетками (клетки без обработки золота и клетки, обработанные НЧЗ без антител). Была продемонстрирована гибель бактерий P. aeruginosa при использовании наночастиц золота в виде нанопалочек с полосой ППР около 800 нм (Norman, Stone et al. 2008). НЧЗ были коныогированы с поликлональным иммуноглобулинами. При облучении светом 785 нм и мощностью 50 мВт с использованием острой фокусировки рамановского микроскопа наблюдался 4-5-кратный эффект ускорения гибели клеток по сравнению с контрольным вариантом (клетки без обработки золота и клетки, обработанные НЧЗ без антител).
Основополагающие работы Фарадея (Faraday 1857), Туркевича с соавторами (Turkevich, Stevenson et al. 1951) по синтезу и изучению механизма роста наночастиц нашли развитие в многочисленных разработках протоколов синтеза и исследованиях коллоидов золота и серебра; результаты многих из этих исследований суммированы в книгах и обзорах (Roucoux, Schulz et al. 2002; Wang, Liu et al. 2003; Rao, Muller et al. 2007; Ferrando, Jellinek et al. 2008).
Существует несколько подходов к химическому синтезу наночастиц металлов; все эти способы можно свести к двум альтернативным направлениям: так называемый способ «сверху вниз» и «снизу вверх» (Thakkar, Mhatre et al. 2010). Первый способ включает размельчение более крупной структуры до наноразмерной структуры. Этот способ крайне затратен энергетически и не позволяет получить конечное вещество нужной формы и размеров. Второй способ подразумевает формирование наночастиц с помощью отдельных атомов, молекул или кластеров. Наибольшее распространение получили методы, основанные на восстановлении солей металлов (предшественников наночастиц). Используются как химические методы восстановления донорами электронов, так и фотохимические, электрохимические, радиохимические методы восстановления. При синтезе наночастиц определенного размера и формы строго контролируются параметры кинетики их роста: используется низкая концентрация предшественника; подбирается подходящий растворитель; предпочтительно применяется восстановитель, медленно восстанавливающий ионы металла; используются стабилизаторы наночастиц. Быстрый и неконтролируемый рост наночастиц, как правило, приводит к образованию полидисперсного коллоида с широким распределением частиц по форме и размерам. Уменьшение размера наночастицы увеличивает отношение поверхности к объему и увеличивает поверхностную энергию. Без специально принятых мер по стабилизации коллоида нередко происходит агломерирование наночастнц. Молекулы стабилизатора, связанные с поверхностью металлической наночастицы, играют роль молекул, функционализирующих наночастицу. Додекантиол, стабилизирующий золотые наночастицы, одновременно с этим повышает растворимость их в органических растворителях (Brust, Walker et al. 1994). Подобные подходы к функционализации поверхности используются и при применении других органических молекул, содержащих, например, циано (-CN), меркапто (-SH), карбокси (—СООН) и амино (-NH2) группы, которые обладают сродством к серебру или золоту. Вопросы стабилизации наночастнц благородных металлов с целью их различного применения рассмотрены в обзорах (Flink, Veggel et al. 2000; Burda, Chen et al. 2005). Следует отметить, что химические методы получения наночастнц металлов сопряжены с высокими финансовыми вложениями, включают использование токсичных реагентов и в процессе реакций могут высвобождаться ядовитые промежуточные вещества.
Действие ионов и наночастиц серебра на формирование биопленок бактериями
Для определения чувствительности к ионам и наночастицам серебра штаммов Е. coli дикого типа и мутантов мы сравнивали минимальные ингибирующие концентрации (МИК) при действии этих соединений.
BER репарация ДНК (base excision repair) восстанавливает геномную ДНК после повреждений, вызванных действиями реактивных форм кислорода ROS (reactive oxygen species) и алкилирующих агентов. ROS, образовываясь внутриклеточно, могут повреждать структуру ДНК, белков и липидов. Основания ДНК крайне восприимчивы к окислительным повреждениям. Наиболее часто встречающимся и стабильным из таких повреждений является 8-оксогуанин (8-oxoG). В присутствии таких повреждений нарушается целостность двойной спирали ДНК и блокируется ее репликация (Fair and Kogoma 1991). У Е. coli существует целый ряд ферментов, которые инициируют выщепление модифицированных азотистых оснований путем гидролиза N-гликозидной связи.
MutM ДНК гликозилаза удаляет основания 8-oxoG, находящиеся в ДНК. Ферменты MutY и MutS удаляют адениновое основание из неканонических пар A:8-oxoG и предотвращают мутагенез, связанный с появлением в ДНК таких гетеродуплексов. MutY ДНК гликозилаза удаляет аденин из пар нуклеотидов, содержащих неправильно спаренные основания, путем вырезания небольшого участка ДНК (short-patch base excision repair pathway), a MutS гликозилаза связывается с неканоническими парами оснований и инициирует репарацию большого числа оснований дочерней цепи ДНК (long-patch mismatch repair). MutT гндролизует 8-oxodGTP, удаляя его из пула нуклеотидов, в результате чего он не может быть включен полимеразами в ДНК (Lu, Li et al. 2001; David, O Shea et al. 2007).
Было показано, что ионы серебра могут ингибировать дыхательные ферменты, способствуя синтезу активных форм кислорода, и тем самым вызывать окислительные повреждения бактериальной клетки (Holt and Bard 2005). С целью выяснения роли репарации окислительных повреждений ДНК в устойчивости клеток к действию AgNCb и НЧС нами было проведено сравнение величин МИК при действии этих соединений для изогенных штаммов Е. coli дикого типа и ряда мутантов, дефектных по белкам, участвующим в репарации ДНК этого типа. Nth и XthA белки являются эндонуклеазой III и экзонуклеазой III, соответственно, они вовлечены в репарацию ДНК. Было показано, что Nth эндонуклеаза участвует в удалении 8-oxoG преимущественно из неправильных 8-oxoG/G пар (Imlay and Linn 1987). Ген dam кодирует ДНК-аденин-метилтрансферазу, которая принимает участие в пост-репликативной метил-направляемой репарации неправильно спаренных оснований. Мутации, инактивирующие ген dam, вызывают мутаторный эффект.
Было показано, что инактивация генов mutS, mut Y, mutM и mutT приводит к уменьшению значения МИК при действии AgNC 3 по сравнению с клетками дикого типа (рис. 106), т.е. клетки этих мутантов становятся более чувствительными к AgNCb-Мутации в генах xthA, nth и dam почти не влияли на чувствительность клеток к AgNCh BW2S113 JW1738 JW 1628 BW38761 BW 38752 BW38783 BW38754 BW38755 BW25113 JW1738 JW1625 BW38751 BW38752 BW387БЗ BW3875 BW38755 л Ып #M..AWJ nmr.km mAS fcin mAY::k»n тШ:±шп rm T:kan ікпхЛяп HtaMn iffiA.fcwi no\ m mutS: an mut ] тЛЫап mutT: an damon
В случае действия различных концентраций НЧС инактивация генов mut Y, mutS, mutM, mutT, а также xthA и nth приводила к уменьшению резистентности мутантных клеток по сравнению с клетками дикого типа (рис. 10а). Мутация в гене mut Y оказывала наибольшее действие - понижала устойчивость клеток при действии НЧС до 10 раз. На основании этого, можно предположить, что эти гены могут быть вовлечены в восстановление окислительных повреждений ДНК, связанных с действием ионов и наночастиц серебра.
В наших опытах не наблюдалось существенных различий в чувствительности к ионам серебра и НЧС, штаммов Е. coli дикого типа и мутантных штаммов, дефектных по эксцизионной репарации (uvrA, uvrB мутанты), SOS-репарации и рекомбинации (гесА, lexA, итиС, umuD, гесВС мутанты) (таб. 7). По-видимому, указанные системы репарации ДНК не играют заметной роли в защите клеток от действия соединений серебра. Сигма S субъединица РНК-полимеразы, кодируемая геном rpoS, является глобальным регулятором, контролирующим транскрипцию большого количества генов при различных стрессовых воздействиях (Hengge-Aronis 2002). Можно было ожидать поэтому, что rpoS мутанты будут более чувствительными к действию ионов и наночастиц серебра, однако, мы не наблюдали подобного эффекта этой мутации (таб. 7).
Другой глобальный регулятор транскрипции, сигма N субъединица РНК-полимеразы (ее кодирует ген rpoN), участвующая в контроле азотного обмена бактерий (Magasanik 1994), также не оказывала заметного влияния на чувствительность Е. coli к соединениям серебра. Инактивация гена глобального регулятора белка CRP, участвующего в контроле катаболитной репрессии и экспрессии большого количества генов бактерий, не вызывала существенного изменения чувствительности клеток Е. coli к ионам серебра и НЧС. Lon протеаза играет важную роль в деградации дефектных (денатурированных) и ряда короткоживущих регуляторных белков (Gottesman 1999) и также относится к глобальным регуляторам транскрипции генов бактерий. Сравнительное изучение чувствительности к соединениям серебра клеток Е. coli АВ1157 и изогенного Ion мутантного штамма AB 1899 не обнаружило различия между этими штаммами.
Антимикробные агенты, включая тяжелые металлы, должны войти в клетку, чтобы подействовать на соответствующие мишени. В проникновении различных низкомолекулярных соединений в клетки бактерий и выведении их из клеток участвуют порины - белки клеточной стенки бактерий, обладающие способностью образовывать заполненные водой поры (каналы). Топологически порины занимают трансмембранное положение. Они пронизывают липидньш бислой наружной клеточной стенки и проникают через периплазматическое пространство до пептидогликана, но не взаимодействуют с ним. Таким образом, порины способствуют неспецифическому прохождению через внешнюю мембрану веществ с относительно невысокой молекулярной массой. В работе (Pugsley and Schnaitman 1978) было показано, что мутанты Е. coli, дефектные по поринам, были более устойчивыми к ионам серебра. Авторами (Li, Nikaido et al. 1997) были получены мутанты Е. coli, резистентные к серебру; у всех пяти исследованных мутантов отсутствовали основные порины, OmpF или OmpF и OmpC. Мутанты были в 4 раза более устойчивы к ионам серебра, чем исходные штаммы. Однако, как отмечали авторы, поскольку мутанты были получены в результате многоступенчатого процесса селекции при увеличивающихся концентрациях серебра, они могли содержать дополнительные изменения, кроме потери поринов. Поэтому авторами было проведено также изучение действия серебра на описанные ранее мутантные штаммы, лишенные поринов; не было обнаружено различий в чувствительности к ионам серебра мутантных и изогенных штаммов дикого типа. Таким образом, вопрос об участии поринов в транспорте ионов серебра в клетки Е. coli оставался открытым.
Похожие диссертации на Взаимодействие клеток бактерий с соединениями серебра и золота: влияние на рост, образование биопленок, механизмы действия, биогенез наночастиц
