Содержание к диссертации
Введение
Глава 1: Обзор литературы «Целлюлозосодержащие отходы как сырье для получения БАВ» 9
1.1. Биотехнология переработки целлюлозосодержащих материалов 9
1.2. Характеристика зерновой дробины как сырья для получения кормовых белково-углеводных БАД 11
1.3. Способы биодеградации целлюлозосодержащих отходов 19
1.3.1.Грибы рода Trichoderma как биодеструкторы лигноцеллюлозных материалов 19
1.3.2. Мультиэнзимные композиции. Область применения и перспективы использования в сельском хозяйстве 24
1.3.3. Алкилоксибензолы как регуляторы активности ферментов 28
1.4.1. Биологически активные добавки для кормления сельскохозяйственных животных 32
1.4.2. Способы обогащения микробной биомассы селеном и йодом 33
1.5. Пробиотики, роль в организме животных и людей и способы их получения39
Глава 2. Экспериментальная часть 48
Объекты и методы исследования 48
Глава 3. Исследование ферментативных гидролизатов зерновой дробины как основы для получения белково-углеводных кормовых добавок 58
3.1. Исследование способов предподготовки зерновой дробины 58
3.1.1. Биодеградация зерновой дробины грибом Trichoderma viride 59
3.1.3. Ферментативный гидролиз зерновой дробины мультиэнзимными композициями 67
3.1.5. Биодеградация зерновой дробины бактериями рода Bacillus 90
Глава 4. Гетерофазное культивирование микроорганизмов на ферментативных гидролизатах зерновой дробины 100
Глава 5. Получение белково-углеводных кормовых добавок, обладающих пробиотическими свойствами 110
5.2. Аэробно-анаэробный способ получения белково-углеводной кормовой добавки с пробиотическими свойствами 117
5.3. Двухстадийная последовательная твердофазная ферментация на дробине штамма бактерий Bacillus cereus БП-46 и молочнокислых культур 122
Заключение 129
Выводы 132"
Список литературы 134
- Способы биодеградации целлюлозосодержащих отходов
- Биологически активные добавки для кормления сельскохозяйственных животных
- Биодеградация зерновой дробины грибом Trichoderma viride
- Двухстадийная последовательная твердофазная ферментация на дробине штамма бактерий Bacillus cereus БП-46 и молочнокислых культур
Введение к работе
Актуальность темы. Разработка способов получения биологически активных соединений и белково-углеводных кормовых продуктов из целлюлозосодержащих материалов является одним из актуальных направлений развития современной биотехнологии. Опыт, накопленный в России, показывает эффективность использования методов микробиологического синтеза для решения проблемы обеспечения животноводства высокоценным белком при использовании в качестве сырья целлюлозосодержащих отходов сельского хозяйства, лесной, деревообрабатывающей, пищевой промышленности и др. [Л.К. Эрнст, 1988].
К настоящему времени разработан ряд биотехнологических способов переработки целлюлозосодержащих отходов, основанных на предварительном их гидролизе с последующим глубинным, поверхностным, твердофазным или гетерофазным культивированием микроорганизмов [В.И. Шарков и др., 1973; В.А. Быков, Ф.А. Прищепов, 1985; Е.Г. Борисенко и др., 2003; В.И. Панфилов, 2004].
Широкое использование антибиотических и других фармацевтических средств в настоящий период развития человечества в условиях напряженного состояния окружающей среды обусловило важность использования пробиотических препаратов для сохранения здоровья человека. Большое внимание исследователей и практиков уделяется получению пробиотических продуктов для животноводства, что связано, в первую очередь, с проблемами отечественного кормопроизводства. В последние годы структура фуражных кормов в стране претерпела значительные изменения, которые привели к вынужденному введению в комбикорма трудно перевариваемых и низкокалорийных компонентов (отруби, рожь, овес, ячмень, просо, пивная дробина и др.). При этом отрицательное влияние на биологическую ценность фуражных кормов оказывает также использование в их составе белков, в основном, растительного происхождения (соевый, подсолнечный и рапсовый шроты, горох и др.), что приводит к увеличению доли трудно перевариваемых компонентов в кормах [Э.В. Удалова и др., 2004]. Разработка способов повышения степени усвояемости этих компонентов - одна из важных биотехнологических задач.
Одним из промышленных крупномасштабных трудноусвояемых целлюлозосодержащих отходов является зерновая дробина - отходы пивоваренного и спиртового производства (до 35 млн. т/год в РФ), которые в настоящее время направляются либо на очистные сооружения, либо сливаются на поля орошения и в водоемы, что наносит экологический ущерб окружающей среде.
Дробина в нативном состоянии не является биологически ценным кормовым продуктом, так как в ее составе преобладают целлюлоза, гемицеллюлозы и трудноперевари-ваемый протеин. Она является источником лишь ряда питательных веществ, в частности, углеводов и минеральных веществ. Однако дробина не обладает токсичными свойствами, что, несмотря на ее низкую усвояемость и биологическую ценность, определяет возможность ее непосредственного использования в кормовых целях [И. Егоров и др., 2006; Е. Калошина и др. , 2006; В. Двалишвили и др., 2007].
Анализ литературы, касающийся исследований и разработки способов повышения биологической ценности зерновой дробины, показывает, что эффективность биотехнологических способов получения биологически активных кормовых добавок на ее основе может быть повышена за счет совершенствования способов биоконверсии целлюлозосодержащих компонентов сырья и биосинтетической активности культивируемых на гидро-лизатах микроорганизмов.
Целью настоящей работы явилось исследование способов получения белково-углеводной кормовой добавки с пробиотическими свойствами на основе зерновой дробины.
В задачи работы входило: - изучение гидролиза зерновой дробины при использовании нативных целлюлолитических ферментов микроорганизмов и промышленных мультиэнзимных композиций;
разработка режимов гетерофазного глубинного культивирования дрожжей на ферментативных гидролизатах зерновой дробины с целью получения белково-углеводной кормовой добавки и добавки, обогащенной селеном и йодом;
твердофазное культивирование бактерий рода Bacillus на зерновой дробине;
культивирование молочнокислых бактерий и их ассоциаций на нативной дробине и ее ферментолизатах;
- исследование возможных способов получения БАД, обладающих пробиотическими
свойствами.
Научная новизна результатов исследований. Исследована возможность получения БАД с различными функциональными свойствами (белково-углеводная добавка, белково-углеводная добавка, обогащенная селеном и йодом и белково-углеводная добавка, обладающая пробиотическими свойствами) на основе зерновой дробины при культивировании дрожжей и молочнокислых бактерий. Впервые изучено влияние культуральной жидкости гриба Trichoderma viride, целевых мультиэнзимных композиций и бактерий рода Bacillus на ферментативную деструкцию зерновой дробины. Исследовано стабилизирующее действие химических аналогов факторов микробного анабиоза - алкилоксибензолов - на комплекс ферментов, входящих в состав мультиэнзимной композиции. Исследован углеводный состав ферментативных гидролизатов дробины, показано, что наибольшую долю углеводов составляют пентозы. Впервые показан активный рост молочнокислых микроорганизмов на ферментолизатах дробины, обогащенных автолизатом предварительно культивируемых микроорганизмов (дрожжей, грибов и бактерий). Показана наибольшая активность инокулята ассоциативных культур кефирных грибков при культивировании на ферментативных гидролизатах зерновой дробины.
Практическая значимость. Разработаны технологические режимы переработки зерновой дробины - отходов пивоваренного производства - для получения белково-углеводной кормовой добавки, исследованы двухстадийные процессы культивирования дрожжей и молочнокислых культур на ферментолизатах дробины, включающих стадию автолиза дрожжевых клеток, а также показана возможность переработки дробины в анаэробных условиях при использовании штамма бактерий Bacillus cereus БП-46, обладающего целлюлолитической активностью.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы обсуждены на Всероссийской научно-технической конференции «Наука-производство-технологии-экология» (Киров, 2006); на IV съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Пущино, 2006); на VI международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения». (Москва, 2007.); и Российской школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященной 40-летию института ГосНИИгенетика (Москва - Пущино, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 4 тезисов.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 146 страницах машинописного текста, содержит 48 таблиц и 33 рисунка. Работа состоит из введения, обзора литературы и 4 глав экспериментальных исследований. Список литературы включает 168 источников, из них 38 на иностранных языках.
Способы биодеградации целлюлозосодержащих отходов
Учитывая сложность строения целлюлозосодержащих субстратов, присутствие биополимеров различного строения и их трудную доступность для использования микроорганизмами [К. Е. Eriksson, 1982; В. И. Билай и др., 1982; В. И. Огарков и др., 1985], важное значение для разработки эффективных биотехнологических процессов имеет разработка стадии подготовки субстрата для культивирования микроорганизмов.
Широкие научные исследования в области изучения разных способов подготовки целлюлозосодержащего сырья и их практического использования показали, что эффективность тех или иных способов предобработки сырья для культивирования микроорганизмов зависит от ряда факторов: от химического состава и объемов используемого сырья, от назначения и требований к качеству получаемого продукта, от энергетических ресурсов и инженерно-технического оснащения производства и др.
Специфичность действия ферментов такова, что позволяет осуществить весьма тонкие перестройки молекул органических соединений с использованием простых технологических схем. Преимущества ферментативного гидролиза заключаются в возможности осуществления превращений веществ, недоступных для реализации химическими методами, использований мягких условий биотрансформации (комнатная температура, водные растворы), в малоотходное технологии.
Целлюлазные комплексы, производящие расщепление целлюлозы в зависимости от физиолого-биохимических особенностей и таксономической принадлежности продуцента, значительно различаются по компонентному составу. Образование глюкозы в ходе ферментативного гидролиза целлюлозы в значительной степени зависит от того, какой из ферментов целлюлазного комплекса лимитирует этот процесс. Повышая или снижая активность отдельных компонентов целлюлазного комплекса, можно изменять стадию, лимитирующую скорость образования глюкозы из целлюлозы. Поэтому одним из основных факторов успешного проведения ферментативного разрушения целлюло-зосодержащих субстратов является подбор сбалансированного по компонентному составу ферментного комплекса. Эта задача может быть решена как путем комбинирования отдельных ферментов, так и в результате скрининга или конструирования определенных микроорганизмов, способных синтезировать нужный ферментативный комплекс [А.П. Синицын и др., 1995].
В настоящее время как в России, так и за рубежом достигнуты успехи в промышленных способах получения ферментных препаратов, что открывает широкие возможности для их использования в процессах подготовки целлю-лозосодержащих субстратов для культивирования микроорганизмов.
Характеристика зерновой дробины как сырья для получения кормовых белково-углеводных БАД
Отходы пивоваренной и спиртовой промышленности представляют собой в основном водянистые, скоропортящиеся продукты, что определяет трудность их эффективной утилизации и требует наличия сушильных установок и разработок технологий их консервирования и транспортировки.
Основным отходом пивоваренной и спиртовой промышленностей является зерновая дробина. На предприятиях пивоваренной промышленности России (более 400 предприятий) ежегодно скапливается большое количество дробины (до 35 млн. т/год) влажностью 70-80%, которая содержит в среднем более 20% сухих веществ с достаточно высоким уровнем протеина (12-15%), превышающим почти в 3 раза его содержание в ячмене.
Солодовая дробина [ОСТ 18-341-79, ОСТ 10-1-86] образуется как остаток после отделения жидкой фазы - пивного сусла в процессе фильтрации затора. Дробина состоит из жидкой (45 %) и твердой (55 %) фаз. Твердая фаза дробины содержит оболочку и нерастворимую часть зерна. Состав дробины зависит от качества солода, количества несоложенного сырья, а также сорта изготовляемого пива.
Традиционно технология пивоваренных заводов в России отличается от технологии развитых стран, в технологической цепочке которых включается стадия сушки пивной дробины. Высушенная пивная дробина может быть использована в животноводстве в качестве кормовой добавки.
На полигонах пивоваренных предприятий России в настоящее время скопились сотни тысяч тонн пивной дробины. Эта смесь растительных и микробных белков, сложных углеводов, органических кислот и других веществ, складированная на открытых площадках и в котлованах полигонов, уже на третий день подвергается воздействию микроорганизмов, которые выделяют в биосферу продукты гидролиза и гниения, в том числе ядовитые газы с дурными запахами - скатол, индол, аммиак. Химические продукты распада, постепенно проникая в почву, загрязняют грунтовые воды, земли становятся непригодными для хозяйственного использования на десятки лет (причем с непредсказуемыми экологическими последствиями).
В то же время зерновая дробина является источником комплекса веществ, обладающих пищевой ценностью и биологической активностью.
Пивная дробина может быть использована в качестве нетрадиционной добавки к кормам животного происхождения. По данным Всероссийского института животноводства, питательная ценность 1 кг свежей пивной дробины составляет 0,17-0,23 кормовых единиц, причем в нем содержатся (в %) перевариваемого протеина 3,9-4,2, жира 1,3-1,5, безазотистых экстрактивных веществ 5,5-5,6. Однако дробина бедна минеральными веществами и водорастворимыми витаминами и поэтому пригодна, в основном, в корм КРС.
Жидкая пивная дробина как кормовое средство имеет ряд недостатков: во-первых, малая стойкость при хранении (при температуре 15-30С от 48 до 72 часов), возможно также накопление в ней микотоксинов (например, афлаток-син В1, ДОН, зеараленон и др.), вызывающих у животных гепатотоксический эффект [Е.Ю.Руденко, 2007], во-вторых, плохая усвояемость скотом отдельных ее ингредиентов. Так, усвояемость безазотистых экстрактивных веществ составляет 60%, жира — 88%, клетчатки - 40 %.
Биологически активные добавки для кормления сельскохозяйственных животных
Лигнинразрушающие грибы, помимо целлюлозосодержащих соединений растения, разлагают и лигнин.
Величина рН субстрата влияет на рост и метаболизм грибов так же, как и на растения. В соответствии с литературными данными целлюлозоразрушаю-щие грибы снижают кислотность среды до более низких значений рН, чем лигнинразрушающие [Н.М. Коваленко, Г.Д. Коваленко, 1993].
Определено, что целлюлозоразрушающие грибы в течение трехмесячного роста используют заметно меньше воды, чем лигнинразрушающие. Первые выделяют большее количество «метаболической» воды, что приводит не только к уменьшению количества воды в процессе культивирования, но даже к активному увлажнению субстрата. Влажность сырья, разлагаемого лигнинразрушаю-щими грибами, не увеличивается.
Авторы делают вывод, что при разрушении растительного сырья вначале освобождаются вещества, растворимые в щелочах, которые в дальнейшем постепенно расходуются или перерабатываются грибами. Часть простых веществ гриб ассимилирует, остальные соединяются в новые высокомолекулярные вещества, преимущественно гумусового характера [Н.М. Коваленко, Г.Д. Коваленко, 1993].
Грибы рода Trichoderma - типичные сапрофитные организмы. Они распространены в природе широко, основным местом их обитания является почва. Благодаря особенностям роста и физиологическим свойствам, эти сапрофиты играют важную роль в формировании микробиоценозов ризосферной почвы, а также в росте и развитии растений. Чаще всего грибы рода Trichoderma встречаются на различных растительных, в особенности богатых целлюлозой субстратах, в почве, на грубых кормах, в основном, на более старых стеблях растений [Т.К. Лиепинып, М.Э. Дунце, 1986]. Главным фактором, регулирующим распространение грибов рода Trichoderma, является температура и влажность почвы. Нормально споры прорастают только в условиях оптимальной влагообеспеченности субстрата 70-100 % [Т.Г. Мирчник, 1976]. Оптимальная для роста и развития температура от 25 до 27С [В.И. Билай, 1961].
Грибы рода Trichoderma обладают тремя формами антагонизма: способностью продуцировать антибиотические вещества, гиперпаразитической активностью и способностью быстро усваивать субстрат, вытесняя медленно растущие организмы.
Грибы образуют хорошо развитую грибницу, в начале белого, затем зеленого цвета. Размножаются спорами (конидиями), которые образуются на ответвлениях грибницы - конидиеносцах. Конидиеносцы - разветвленные споры шаровидной формы, от 2,5 до 3,75 мкм в диаметре, собраны в головки по 10-12 штук на концах конидиеносцев. Кроме конидий-спор гриб нередко образует покоящиеся споры (хламидоспоры), они бесцветные от 7,5 до 15 мкм в диаметре [Г.Ш. Сейкетов, 1982]. Гриб является аэробом, что объясняет его быстрое развитие в хорошо аэрируемых почвах, богатых органическими веществами.
Возможность использования грибами рода Trichoderma практически любого органического субстрата с высоким выходом биомассы оправдывает их применение в самых разнообразных биотехнологических процессах [В:А. Тюльпанова, 1994]. Для выращивания грибов рода Trichoderma обычно используют жидкие и твердые (агаризованные) синтетические среды (сусло-агар, среда Чапека, среда Захарченко, пивное сусло), а также естественные материалы-отходы или побочные продукты пищевой, перерабатывающей промышленности, богатые органическими веществами (гидролизаты древесины, меласса, барда, жом, зерноотходы, виноградная выжимка, торф и др.) [В.И. Билай, 1987].
Культивирование грибов рода Trichoderma проводится как поверхностным, так и глубинным способами.
Способ поверхностного культивирования обладает следующими недостатками: во-первых, малая скорость роста грибов, во-вторых, затруднена механи 22 зация ряда процессов, в-третьих, большие затраты и требуется больше субстрата. Тем не менее, он имеет и ряд преимуществ перед глубинным способом культивирования: проще технологическая схема; при высушивании продукта не требуется больших затрат энергии, так как влажность перед сушкой составляет 34-45 % и выход спор по сравнению с глубинным способом значительно выше [И.Л. Работнова, 1990].
Одним из важнейших факторов, определяющих нормальный рост грибов рода Trichoderma, является реакция среды. При изменении ее в неблагоприятную сторону грибы перестают расти даже в тех случаях, когда все остальные условия окружающей среды будут благоприятны для их развития. Характер питательных веществ, входящих в состав среды, оказывает существенное влияние на качественное и количественное состояние гриба. Установлено, что в условиях глубинного культивирования, в зависимости от состава питательной среды могут образовываться либо конидии, либо хламидоспоры [Н.С. Мануковский, 1990].
Грибы рода Trichoderma, развиваясь на субстратах, содержащих целлюлозу в большом количестве, могут успешно конкурировать с другими видами. Грибы рода Trichoderma входят в ограниченную группу разрушителей лигнина. Способность осуществлять глубокое разрушение лигнина представляет собой уникальное явление. Однако антагонистические свойства гриба снижаются на субстратах с меньшим содержанием целлюлозы даже при более благоприятных условиях.
Обострившаяся в мире проблема дефицита пищевого белка способствовала возникновению нового направления работ с микромицетами рода Trichoderma как продуцентами белка. Представители рода Trichoderma способны к биоконверсии целлюлозы в белки, этот процесс осуществляется в два этапа. На первом этапе происходит гидролиз целлюлозного субстрата до Сахаров, осуществляемый комплексом целлюлолитических ферментов. На втором этапе происходит накопление биомассы при использовании этих Сахаров.
Биодеградация зерновой дробины грибом Trichoderma viride
В последнее десятилетие в отечественной практике в области промышленного биокатализа получили развитие исследования, связанные с созданием специализированных комплексных ферментных систем для использования в сельскохозяйственном производстве.
Использование отдельных ферментов в процессах кормопроизводства не обеспечивает устранение негативных факторов, используемых зерновых компонентов из-за отсутствия или неоптимального соотношения в них активных ферментных систем, участвующих в биологическом процессе деградации различных природных полимеров. Исходя из этого, очевидна целесообразность использования комплексных ферментных препаратов, способных решить эту проблему.
Ввиду сложного биохимического состава обрабатываемого сырья, а также с учетом литературных данных по ферментативному гидролизу целлюлозосо-держащих материалов [Синицьш А.П., 1981, Клесов А. А., 1988, Калунянц К.А., 1990, Синицьга А. П., Клесов А.А., Гусаков А. В., Черноглазов В. М., 1995, Удалова Э.В. и др., 2004], очевидно, что ферментолизаты пивной дробины мо 68 гут быть эффективно использованы как основа для получения белково углеводных кормовых добавок и препаратов сельскохозяйственного назначения с пробиотическими свойствами.
Для более эффективной конверсии дробины были проведены исследования по изучению ферментативного гидролиза указанного сырья с применением новых комплексных ферментных препаратов (Ф-ПД-1, Ф-ПД-2 и Ф-ПД-3), содержащих в своем составе гидролитические ферменты: ксиланазу, целлюлазу, (3-глюканазу, а также протеазу грибного происхождения. Препараты были разработаны специалистами НТЦ «Лекбиотех».
Выбор ферментов, входящих в состав мультиэнзимных композиций, был обусловлен присутствием в трудногидролизуемой зерновой дробине природных полимеров: целлюлозы, гемицеллюлоз типа ксиланов, арабиноксиланов, прочно связанных с целлюлозой, нерастворимого протеинового комплекса, а также следовых количеств непрогидролизованного р-глюкана.
Подбор соотношения дробины и мультиэнзимной композиции Ф-ПД-1 для проведения ферментативного гидролиза и его влияние на прирост редуцирующих Сахаров. Поскольку известно, что растворимые редуцирующие вещества способны оказывать репрессирующее и ингибирующее действие на активность ферментов, опыты по ферментативному гидролизу проводили на подсушенной и измельченной дробине, освобожденной от присутствия редуцирующих Сахаров, легко экстрагируемых в водной фазе, путем отмывания дробины трехкратным объемом воды.
Подбор фермент-субстратного соотношения проводили следующим образом:
Для ферментолиза были подготовлены водные суспензии пивной дробины при гидромодуле от 1,0 до 15,0% при концентрации мультиэнзимного препарата Ф-ПД-1 в дозе 0,1 и 1,0%.
Данные, представленные в табл. З.1.З.2., показывают, что максимальный выход редуцирующих Сахаров, 15,3 г/дм3 наблюдался при обработке 10%-ной суспензии дробины 1,0%-ным раствором Ф-ПД-1. Следует отметить, что при введении препарата в дозе 0,1% уровень прироста редуцирующих Сахаров (11,4 г/дм3 оказался достаточно высоким, и повышение дозы ферментного препарата до 1,0% не обеспечивало адекватного прироста Сахаров. Причем, дальнейшее увеличение концентрации субстрата до 15% и выше, приводило к заметному снижению прироста Сахаров на 16,0-54,0%, что связано с затруднением процесса перемешивания вследствие повышения вязкости среды и ухудшением массообменных характеристик в инкубируемой системе.
Поэтому дальнейшие исследования процесса ферментативного гидролиза сырья препаратом Ф-ПД-1 проводили с использованием 10 %-ной суспензии дробины.
Изучение влияния различных концентраций Ф-ПД-1 на дробину. Поскольку по результатам ферментативного гидролиза пивной дробины была по 70 добрана 10%-ная рабочая концентрация данного субстрата, то в дальнейшем изучалось влияние разных избыточных концентраций мультиэнзимного препарата на прирост редуцирующих Сахаров, образующихся при ферментативном гидролизе зерновой дробины, а также на содержание «сырой» клетчатки и протеина в прогидролизованном сырье. Для этого были использованы следующие концентрации Ф-ПД-1: 0,1; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 и 5,0%.
Как видно из табл. З.1.З.З., при введении в реакционную смесь как низких доз (0,05 - 0,1%), так и избыточных концентраций препарата Ф-ПД-1 (1,0 -5,0%) не отмечено существенного накопления редуцирующих Сахаров, поскольку при увеличении дозировки препарата прирост Сахаров фактически возрастает в 1,1-1,7 раза (табл. З.1.З.З.). Данные о содержании в гидролизате пивной дробины (твердая фаза) «сырой» клетчатки, представленные в табл. З.1.З.З., свидетельствуют о том, что клетчатка под воздействием ферментов гидролизо-валась лишь на 3,0% при введении 0,1% Ф-ПД-1, и степень ее конверсии не возрастала при введении повышенных концентраций фермента. Аналогичная тенденция наблюдалась и по содержанию нерастворимого сырого протеина - снижение на 2,0 - 3,0%. Возможно, низкая эффективность действия Ф-ПД-1 может быть связана с недостаточной предобработкой данного субстрата (механическое измельчение), а также, возможной репрессией ферментов как продуктами гидролиза, так и уже имеющимися в инкубируемой системе легко экстрагируемыми редуцирующими веществами. Также необходимо отметить, что отсутствие целлобиазы в полиферментном препарате, возможно, не обеспечивает более эффективной работы целлюлаз.
Таким образом, было показано, что оптимальным соотношением «фермент-субстрат» для дальнейших исследований является ОД % Ф-ПД-1 и 10%-ная суспензия зерновой дробины. При этом суммарная концентрация редуцирующих Сахаров в гидролизате определялась на уровне 12,3 г/дм3.
Определение влияния условий на ферментативный гидролиз дробины препаратом Ф-ПД-1. Известно, что на эффективность воздействия ферментов на субстрат оказывают влияние такие факторы, как продолжительность ферментативного гидролиза, температура, рН, массообменные характеристики, концентрация субстрата, степень сорбции ферментов на субстрате и др.
В данной работе с целью выявления оптимальных условий для ферментативной обработки исследуемого сырья было изучено влияние продолжительности времени воздействия Ф-ПД-1 на накопление редуцирующих Сахаров в инкубируемой системе «дробина-Ф-ПД-1», а также определение оптимального значения рН, в рамках которого воздействие мультиэнзимной композиции на субстрат была бы наиболее эффективной, учитывая целевые критерии оценки.
Определение оптимального времени гидролиза под действием ферментов, содержащихся в мультиэнзимном препарате Ф-ПД-1, проводили на основе динамики накопления редуцирующих Сахаров в инкубируемой системе «дробина-Ф-ПД-1».
Двухстадийная последовательная твердофазная ферментация на дробине штамма бактерий Bacillus cereus БП-46 и молочнокислых культур
Таким образом, данные таблицы 5.1.1.3. показали, что при увеличении в среде содержания этилового спирта прирост «сырого» протеина и растворимого белка повышался. По сравнению с контрольным образцом содержание «сырого» протеина при добавлении на стадии автолиза этилового спирта в концентрациях 1,0, 2,0 и 3,0% (об.) повышалось, соответственно, с 25,0% до 25,5, 27,0 и 29,0% а.с.в. Причем, дальнейшее повышение массовой концентрации этанола в среде нецелесообразно, поскольку при выделении продуктов для использования их в качестве кормовых или пищевых добавок (с точки зрения их безвред 114 ности) предпочтительнее автолиз проводить в присутствии этанола в концентрации не более 3 % [Н.В. Аладашвили и др., 1991].
Полученные в результате исследований данные показывают, что при поверхностном культивировании ТУ. viride на дробине и последующем автолизе содержание протеина в твердой фазе может быть повышено до 29,0%. Полученный продукт после объединения с промывными водами, содержащими редуцирующие сахара, может быть использован в качестве сырья для получения белково-углеводной кормовой добавки с пробиотическими свойствами.
Таким образом, показано, что при использовании культуральной жидкости грибов Tr.viride для биодеструкции дробины выход РВ составлял 16,0-16,5 г/дм3, при этом клетчатка гидролизовалась на 6,0%. При поверхностном культивировании грибов на дробине возможно получение продукта, содержащего не более 13,0% «сырой» клетчатки и не менее 29,0% «сырого» протеина.
Для приготовления питательной основы для культивирования молочнокислых бактерий на дробине поверхностным способом выращивали гриб Tr.viride в условиях, описанных выше. Затем полученный субстрат, состоящий из дробины, частично гидролизованной целлюлолитическими ферментами Tr.viride и пронизанной гифами гриба, выдерживали в условиях, обеспечивающих автолиз грибной биомассы. Для повышения степени автолиза в среду дополнительно вносили индуктор - этанол в концентрациях от 1,0 до 3,0% [по Н.В. Аладашвили и др., 1991].
После автолиза полученное сырье смешивали с промывными водами, объединенными после поверхностного культивирования гриба на дробине и содержащими РВ, рН устанавливали на уровне 6,7 -6,8 и стерилизовали при 0,5 ати в течение 30 минут.
В полученную питательную среду засевали культуру молочнокислых бактерий Lactobacillus casei и ассоциативную культуру кефирного грибка G, которые культивировали в анаэробных условиях в течение 15-17 часов при температуре 37С.
Поскольку при автолизе биомассы Tr. viride был использован этанол, то проводили исследования влияния данного соединения на активность молочнокислого брожения.
В результате проведенных исследований показано, что при развитии молочнокислых культур на средах с содержанием этилового спирта от 1,0 до 3,0% угнетения активности молочнокислого брожения не наблюдалось (табл. 5.1.1.4).
Характеристика белково-углеводных кормовых добавок на основе зерновой дробины, полученных при последовательном твердофазном культивировании гриба Tr. viride и молочнокислых микроорганизмов Показатель L. casei Ассоциативная культура кефирного грибка G «Сырой» протеин в твердой фазе до автолиза грибных клеток, % а.с.в. В том числе растворимый белок, г/дм3 Концентрация этанола, %
Результаты, представленные в таблице 5.1.1.4. показывают, что присутствие этилового спирта в среде до 3% стимулировало развитие молочнокислых организмов, причем, показатель титруемой кислотности для обоих вариантов составил 140 -190Т. При этом, в среде отмечено накопление молочной кисло 116
ты: при культивировании L. casei - 8,7+10,8 мг/дм3 при потреблении 77,3+84,0% РВ, при культивировании ассоциативной культуры кефирного грибка G - 9,0+10,8 мг/дм3 при потреблении 80,7+86,3% РВ, содержание «сырого» протеина и «сырой» клетчатки составило 29,2+33,9% а.с.в и 12,8+13,0%) а.с.в., соответственно.
При исследовании биологической ценности полученных продуктов на тест-культуре Tetrahymena pyriformis было показано отсутствие острой токсичности, также были получены данные, подтверждающие их пробиотические свойства и антагонистические свойства по отношению к Staphylococcus aureus.
По результатам проведенных исследований на рис. 5.1.1.3. приведена схема получения белково-углеводного продукта, полученного при поверхностном твердофазном культивировании гриба Tr. viride на дробине, с последующим автолизом грибной биомассы и анаэробным сбраживанием полученных автолиза-тов культурами молочнокислых микроорганизмов.
Известно, что аэробные биотехнологические процессы культивирования микроорганизмов являются достаточно энергоемкими, в то время как анаэробные процессы требуют значительно меньших затрат энергии. Исходя из полученных нами данных и анализа литературы была изучена возможность аэробно-анаэробного процесса получения белково-углеводного продукта на основе зерновой дробины, обладающего пробиотическими свойствами, включающего стадии подготовки субстрата (подсушивание, измельчение и ферментативная обработка), ферментацию дрожжей на полученных ферментолизатах с последующим автолизом, развитие в анаэробных условиях молочнокислых микроорганизмов и сушку готового продукта.
В условиях гетерофазного культивирования на ферментолизатах зерновой дробины, полученных при воздействии на 10%-ную суспензию нативного и измельченного сырья 0,1%-ного раствора мультиэнзимной композиции Ф-ПД-3, выращивали дрожжи Y.lipolytica до потребления в среде примерно 50% редуцирующих Сахаров от их исходного количества. Учитывая предполагаемое количество РВ, используемых при росте дрожжей в этом процессе, в питательную среду добавляли половину азотсодержащих солей от их содержания в питательной среде (табл. 5.2.2.).
Поскольку для развития молочнокислых бактерий, обеспечивающих про-биотические свойства продукта, требуется сложный состав питательной среды, полученную гетерогенную массу после культивирования дрожжей выдерживали 12 часов при 40 С в условиях, обеспечивающих автолиз дрожжевых клеток. При этом содержание «сырого» протеина в продукте после автолиза составило 24,0 и 26,0% а.с.в., соответственно, на ферментолизате нативной и измельченной зерновой дробины.
В продукт, полученный после автолиза дрожжей вносили инокулят молочнокислых бактерий L. casei, а также ассоциативной культуры кефирного грибка G в количестве 5% по объему. Потребление РВ молочнокислыми культурами при развитии на гидроли-зате предобработанной и нативной дробины составило 93 и 88%, соответственно.
Сравнение активности исследуемых культур показало, что ассоциативная культура кефирного грибка G обладала большей активностью по сравнению с L. casei.
Продукты, полученные при использовании предобработанной дробины, характеризовались большим содержанием «сырого» протеина и меньшим содержанием «сырой» клетчатки, чем при использовании нативной дробины: «сырой» протеин увеличивался с 21,0 до 23,0-30,0%, «сырая» клетчатка гидролизо-валась с 18,0 до 10,2 -15,2%.
Определение устойчивости молочнокислых культур к различным факторам при культивировании их на обезжиренном молоке (контроль), ферментолизате нативной зерновой дробины и на ферментолизате измельченной дробины показало, что все образцы устойчивы к желчи, пищеварительным ферментам (трипсин/пепсин), поваренной соли (NaCl), температурному воздействию при 60-65С (в течение 30, 60 и 90 минут) и к щелочной реакции среды в диапазоне рН 8,3 и 9,2, однако не устойчивы к рН 9,6 и присутствию фенола в среде культивирования как на молоке, так и на ферментолизатах дробины.
В результате проведенных опытов показано, что продукты, полученные при культивировании молочнокислых бактерий на ферментативных гидролиза-тах дробины после культивирования на них дрожжей с последующим автоли 120 зом дрожжевых клеток, обладают основными свойствами, определяющими их пробиотическую активность, что и исходные молочнокислые культуры при культивировании их на молоке. При анализе полученных данных было показано, что образцы БАД не обладали острой токсичностью (угнетения роста инфузорий не наблюдалось) и проявляли антагонистические свойства по отношению к условно-патогенной культуре Staphylococcus aureus
