Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Влияние пренатального стресса на организм 9
1. 2. Энзимология регуляторпых пептидов 17
1.2. 1. Нейропептиды и ферменты их обмена в онтогенезе 19
1. 2. 2. Пептидергические системы при стрессе 28
1.2.3. Роль ферментов обмена регуляторпых пептидов в ответе организма на стресс 32
1. 2. 4. Карбоксипептидаза Н 35
1. 2. 4. ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза 40
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 43
2.1. Материалы исследования 43
2.2 Методы исследования 44
2.2,1. Метод определения активности карбоксипептидазы Н 44
2.2.2. Метод определения активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы 44
2.2.3. Статистическая обработка результатов исследования 45
ГЛАВА 3. Результаты исследования 5
3.1. Исследование активности основных карбоксипептидаз в тканях пренатально стрессированных крыс 46
3.1.1. Исследование активности карбоксипептидазы Н в тканях крыс, перенесших пренатальный стресс 46
3.1.2. Исследование активности ФМСФ-КП в тканях крыс, перенесших пренатальный стресс 55
3.2. Изучение влияния хронического эмоционально-болевого стресса на активность основных карбоксипептидаз в тканях взрослых крыс 62
3.2.1. Исследование активности КПН в тканях крыс, испытавших воздействие хронического эмоционально-болевого стресса 62
3.2.2. Исследование влияния хронического эмоционально-болевого стресса на активность ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях крыс, перенесших пренатальный стресс 70
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов исследования 76
Выводы 94
Литература 96
- Влияние пренатального стресса на организм
- ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза
- Исследование активности карбоксипептидазы Н в тканях крыс, перенесших пренатальный стресс
- Исследование активности КПН в тканях крыс, испытавших воздействие хронического эмоционально-болевого стресса
Введение к работе
Проблема стресса является актуальной для человечества п социальном, медицинском плане, включая проблему сохранения здорового генофонда людей. Особо пристальное внимание обращено на вопрос о пренатальном воздействии стрессирующих факторов. Стресс, перенесенный матерью во время беременности, оказывает существенное влияние на формирование адаптивных возможностей организма потомства [82, 86, 335, 352, 355], психоэмоциональный статус [16, 17, 44, 87, 305, 344], процессы полового созревания и функционирование репродуктивной системы [96, 219, 245, 298]. Отсюда понятен іштерес к этой проблеме специалистов разных профилей, в том числе биохимиков. Выяснение биохимических механизмов пренатального воздействия стресса на организм может позволить практической медицине решить вопросы профилактики стрессовых состояний и лечения заболеваний, имеющих стрессогенную природу.
Согласно современным представлениям, важная роль в ответе на стресс
принадлежит регуляторным пептидам: адренокортикотропному гормону [2,
45, 102], кортикотрошш-рнлизинг гормону [2, 107, 117, 140, 300] опиоидным
пептидам [18, 22, 58, 63, 70, 72, 81, 105, 122, 341] вазопресенну [2, 97, 140,
215, 300] и другим [68, 77, 95, 100, 125, 127, 300,]. Эти пептиды участвуют
так же в процессах половой дифференцировки и функционировании
репродуктивной системы [10, 12, 14]. Пренатальный стресс вносит
дисбаланс в содержание регуляторних пептидов в организме [3, 91, 275, 288,
312, 352, 357]. Необходимый уровень пептидов в организме поддерживается
протеолитнческими ферментами, осуществляющими процессии г,
модификацию и инактивацию физиологически активных пептидов [1, 56, 85,
88, 180, 197]. Особая роль при этом принадлежит ферментам,
катализирующим отщепление аргинина и лизнна с С-конца пропептидов, в
частности - карбокеппептндазе Н (КПН) [171, 182, 225]. Кроме того,
предполагается, что фенилметнлеульфоннлфторид-ингибируемая
карбоксипептидаза (ФМСФ-КП), — сравнительно недавно открытый фермент - наряду с КПН участвует в биосинтезе пептидов [26, 38].
Известно, что КПН и ФМСФ-КП вовлекаются в ответ на стресс [15, 23, 24, 32, 47, 49, 52, 129] и детерминирование различии в уровне регуляторних пептидов у самцов и самок [15, 119, 120]. Поскольку активность вышеуказанных ферментов претерпевает значительные возрастные изменения [119], предполагается, что КПН и ФМСФ-КП играют важную роль в онтогенезе, и в пубертационных процессах в частности. Однако неизученным остается вопрос о вовлечении основных карбоксипептидаз в развитие патологии, вызванной воздействиями стрессирующих факторов в раннем онтогенезе. В литературе отсутствуют данные об изменениях активности ферментов под влиянием постнаталыюго хронического стресса у пренатально стрессированных животных.
В связи с этим большой интерес представляет изучение влияния пренатального стресса на активность КПН и ФМСФ-КП в тканях животных обоих полов на разных стадиях онтогенеза, а также изучение влияния хронического эмоционально-болевого стресса на активность ферментов в тканях взрослых крыс, перенесших пренатальный стресс,
Исходя из этого, целью работы был сравнительный анализ онтогенетических изменений активности КПН и ФМСФ-КП в гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системе, стриатуме и половых железах интактных и пренатально стрессированных крыс, а также исследование влияния хронического ЭБС на активность основных КП в тканях интактных и пренатально стрессированных крыс.
При выполнении работы были поставлены следующие задачи:
1. Сравнение возрастных изменений активности КПН в гипоталамо-
гипофизарно-надпочечниковой системе, стриатуме и половых железах
интактных и перенесших пренатальный стресс животных.
Сравнение возрастных изменений активности ФМСФ-КП в гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системе, стриатуме и половых железах интактных и перенесших пренатальный стресс животных.
Исследование влияния пренатального стресса на активность основных КП в гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой систем, половых железах и отделах мозга взрослых крыс.
4. Изучение влияния хронического эмоционально-болевого стресса на активность КПН и ФМСФ-КП в тканях крыс, перенесших пренатальний стресс.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые изучено влияние пренатального стресса на активность КПН и ФМСФ-ингибируемой КП. Обнаружено зависимое от пола изменение активности ферментов у животных, перенесших пренатальньш стресс. Показано, что пренаталыюе стрессирование модулирует вызванное постнатальным хроническим стрессом изменение активности КПН и ФМСФ-КП.
Полученные данные могут способствовать выяснению механизмов, лежащих в основе длительных неирогуморальпых нарушений, являющихся последствиями пренатального стрессирования, а также пониманию роли основных карбоксипептидаз в адаптационных механизмах стресса.
Положения, выносимые на защиту.
Сравнение возрастной динамики активности КПН и ФМСФ-КП в гнпоталамо-пшофизарно-надпочечниковой системе, стрпатуме и половых железах интактных и пренатально стрессированных животных.
Влияние пренатального стресса на активность КПН и ФМСФ-КП в отделах мозга и железах взрослых крыс.
Особенности изменения активности КПН и ФМСФ-КП в отделах мозга и железах интактных и пренатально стрессированных крыс при действии хронического эмоционально-болевого стресса.
оценка половых различий активности КПН и ФМСФ-КП в отделах мозга и железах крыс, перенесших пренатальньш и хронический эмоционально-болевой стресс.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на 2-ой Всероссийской научно-практической конференции (Волгоград, 2003), на итоговых научных конференциях профессорско-преподавательского состава Пензенского Государственного Педагогического Университета (Пенза, 2002-2005 г.г.) и на международной конференции Российской Академии Естествознания (Тунис, 2005). По теме диссертации опубликовано 9 научных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из б разделов: введение, обзор литературы по теме диссертации, материалы и методы исследования, результаты, обсуждение, выводы. Работа изложена на 140 страницах, иллюстрирована 16 рисунками и 10 таблицами. Список литературы содержит 363 наименования на русском и иностранных языках.
Влияние пренатального стресса на организм
Многочисленные данные, полученные в результате экспериментальных и клинических исследований, свидетельствуют о том, что факторы окружающей среды уже на ранних этапах жизни мощно воздействуют на развивающиеся системы, изменяя их структуру и функционирование на протяжении всей жизни. Welberg and Shekl [355] указывают на «программирование» мозга, вызванное воздействием стресса или глюкокортикоидов в пренаталыюм онтогенезе. Подобное программирование находит отражение в нарушении функционирования целого ряда структур.
Пренаталыюе стрессирование оказывает влияние на психоэмоциональную сферу и поведенческие реакции животных. Так, 35-дневные потомки самок крыс, которые подвергались различного рода воздействиям во время беременности [155], демонстрируют большую эмоциональность в "открытом поле" по сравнению с контролем, хотя к возрасту 70 дней различия между опытной и контрольной группами сглаживаются. У животных, перенесших пренатальный стресс, отмечается увеличение уровня тревожности [16, 17, 305, 348]. Причем, если у самок наблюдаемые в возрасте 3 мес. отклонения от нормы сохранялись до взрослого состояния, то по данным [17] у самцов к 4-5 месяцам происходило выравнивание уровня тревожности до контрольного. Потомки матерей, испытавших стресс во время беременности, демонстрируют более высокую двигательную активность по сравнению с контролем [87, 155, 336]. Однако, в работе [87] отмечено снижение тревожности, а [16, 17] обнаружили снижение двигательной активности пренатально стрессированных крыс.
Потомство крыс, которых в последнюю треть беременности подвергали воздействию "болевого стрессора", показало более высокую способность к обучению по сравнению с контролем и крысами, перенесшими пренатальный эмоциональный стресс [44]. Кроме того, у контрольных и перенесших пренатально болевой стресс самок выявлена тенденция к большей способности к обучению в сравнении с самцами. Однако, предъявление кота как фактор стресса или электроболевое воздействие на 19-й день беременности [258] приводило к нарушению краткосрочной памяти в Т-образном лабиринте у половозрелого потомства.
Таким образом, исследования влияния пренатального стресса на изменение психоэмоционального состояния у крыс не дают однозначных результатов. Очевидно, на результаты тестирования могут влиять сроки и характер воздействия, а так же методики и условия тестирования экспериментальных животных.
Контроль поседения, эмоциональности, способности к обучению и др. осуществляется пептидергическими системами мозга [55, 76, 85, 341].
Стресс у плодов приводит, с одной стороны, к стимуляции СЛС, а с другой стороны - к изменению содержания регуляторных пептидов [91]. Острый стресс на 22-й день беременности приводит к повышению уровня адреналина, норадреналина и люлиберина в гипоталамусе плодов крыс [312]. Жесткая иммобилизация на 20-й день беременности приводила к снижению В-эндорфина в гипоталамусе плодов самцов и повышению соматолиберина в гипоталамусе самцов и самок [295, 312]. В тех же условиях отмечено значительное повышение В-эндорфина и В-липотропина к 60-й мин. после начала стресса. Иммобилизация матерей достоверно снижала уровень В-липотропина в гипофизе, лютеинизирующего гормона - в плазме и повышала уровень кортикостерона в плазме плодов мужского пола и андростендиона - в крови плодов-самок. В то же время отмечается понижение содержания кортиколиберина в гипоталамусе (проба объединена у животных разных полов). Предварительное введение матерям тирозина частично ослабляло вызванные стрессом нарушения в гипоталамусе плодов [295,312].
У крыс пренатальный стресс вызывает снижение содержания соматотропного гормона и пролактина в гипофизе, особенно выражены отличия от нормы в 30- и 90-дневном возрасте, в период роста и развития [3]. Легкий стресс на протяжении всей беременности приводил к уменьшению мРНК ПОМК в гипоталамусе 28-дневного потомства женского пола, и не влиял на этот показатель у самцов [353]. В том же эксперименте не обнаружено влияния стресса на содержание мРНК проэнксфалина и продинорфина в гипоталамусе самцов и самок крыс. Временная иммобилизация самки в последнюю треть беременности приводит к уменьшению количества ц-опиоидных рецепторов в ЦНС ее 1,5-месячного потомства [236].
Воздействие дексаметазона в 17-19 дни беременности крыс нарушает метаболизм серотонпна и норадреналшга в мозге потомства и адренокортнкальный ответ на предъявление внешних условий 14-дневных щенков [265]. У крыс, перенесших хроническое воздействие стресса в эмбриональный период развития, наблюдается снижение содержания дофамина и серотонпна в гипоталамусе в возрасте 30 дней и 90 дней. К 180 дням разница между контрольной и опытной группами становится несущественной [3]. Кроме того, пренатальный стресс нарушает половой диморфизм моноаминергической системы мозга крыс [85].
Стрессовые воздействия в пренатальный период развития способны изменять функционирование важнейшей адаптивной системы организма — ГГНС - как в покое, так и при стрессе в постнатальном онтогенезе.
У потомства стрессируемых крыс наблюдается повышение уровня АКТГ и, не смотря на это, снижение 11-оксикортикостерона в крови [3]. Наиболее выраженные в ранний период, в половозрелом возрасте эти различия между группами в какой-то степени сглаживаются, но все равно уровень АКТГ в опытной группе выше, а 11-окспкортикостерона -достоверно ниже, Пренатально стрессированиые поросята отличались от контрольных сниженным содержанием кортизола и повышенным уровнем кортикостероид-связывающего глобулина (CBG) [299].
Действие пренатального стресса обычно более заметно у женских, чем у мужских особей [355]. Так, базальный уровень кортизола и АКТГ у взрослых пренатально стрессируемых крыс обычно не изменяется у самцов [139, 275, 330, 337,342, 343, 353], но увеличивается у самок [275, 353].
ГГНС является саморегулирующейся системой, в которой одним из ключевых моментов этой регуляции являются кортикостероидные рецепторы не только гипоталамуса и гипофиза, но и других мозговых структур, главным образом гиппокампа и фронтальной коры [86, 165, 248, 279]. Кортикостероидные рецепторы, среди которых выделяют в мозгу глкжокортикоидные и мннералокортикоидные рецепторы, участвуют в регуляции как базалыюй активности системы, так и в ее регуляции в условиях стресса, особенно скорости выключения ГГНС после стрессорной активации [86, 216, 238, 307]. Глюкокортикоидные рецепторы являются важнейшей мишенью «пренатального программирования». Пренатальный стресс может являться причиной изменения плотности кортикостероидиых рецепторов в гиппокампе взрослых особей. При этом следует отметить, что у пренатально стрессируемых самцов часто снижено содержание минералокортикоидных рецепторов [139, 214, 266, 342], а у самок — гл юкокорти коидных [353].
ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза
В 1993 году Вернигорои и соавт. в растворимой фракции серого вещества кошки был обнаружен фермент, расщепляющий дансил-фен-лей-арг, отличающийся по молекулярной массе от всех других карбоксппептидаз [17]. Позднее этот фермент был отдифференцирован от других карбоксппептидаз, частично охарактеризован [25, 37], и получил название «ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза».
По данным тонкослойной хроматографии, частично очищенный фермент расщепляет энкефалин-Ьеи5-А 6 и дансил-Phe-Leu-A rg с образованием энкефалин-Ьеи5 и дансил-Phe-Leu соответственно [37]. С очень низким сродством ФМСФ-КП расщепляет субстрат карбоксипептидазы А — карбобензокси-Gly-Leu,
ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза имеет Mr 100000-110000 [37]. Фермент, выделенный из серого вещества головного мозга кота, наиболее активен при рН 6,2 [37], фермент печени- при рН 5,5 - 5,75 [25]. Активность фермента практически полностью подавляется ингибитором сериновых протсиназ - фенилметилсульфонилфторидом [37]. Фермент сильно ингибнруется п-хлормеркурибензоатом, йодацетамид подавляет активность на 40%, а влияние N-этилмалеимнда было незначительно [37]. Поскольку ЭДТА, а так же ингибитор металл-зависимых карбоксппептидаз - ГЭМЯК -не влияют на ФМСФ-ингибируемую активность, то данный фермент, скорее всего, не является металл-зависимым. Ионы Zn2+ сильно подавляют, в то время как Со2+, Са2+ и Mg2+ не оказывают значительного влияния на активность ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы. На этом основании, а так же принимая во внимание тот факт, что ингибирование или активация наблюдается при очень высоких концентрациях ионов металлов (50 мМ), изменение активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в присутствии различных солей связано, очевидно, с влиянием различных ионов на стабильность фермента [37]. Наибольшее увеличение активности наблюдается в присутствии NaCl, NaBr, Na2S04. Кроме того, ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза быстро инактивируется в нейтральных и слабощелочных средах, но стабилизируется NaCl [Вернигора, Генгин,
Никишин, Спиридонов, неопубликованные данные]. Величина Km для синтетического субстрата даисил-фен-лей-арг равна 48 мкМ, а для дансил фен-ала-арг - 96 мкМ [37]. По физико-химическим и каталитическим свойствам ФМСФ-КП похожа на лизосомальную карбоксипептидазу А, однако отличается от нее субстратной специфичностью и тканевым распределением. Вернигорой и соавт. [25, 33, 42, 43, 119, 121] изучено региональное распределение активности ФМСФ-КП в тканях животных разных видов: кота, крысы, ежа европейского, мыши. Несмотря на значительные видовые отличия в тканевом и региональном распределении активности фермента, наибольшая активность ФМСФ-КП у изученных животных обнаружена в надпочечниках [33, 42, 43, 119, 121], характеризующихся высоким содержанием энкефалинов, гипофизе - отделе, интенсивно продуцирующем секреторные пептиды [108], в яичниках, где отмечается высокий уровень активности пептидгидролаз, вовлекающихся в деградацию фолликулов [121]. Максимальная активность фермента в мозге обнаружена в отделах, богатых телами нейронов (большие полушария, обонятельные луковицы) и отделах, характеризующихся высоким содержанием нейропептидов (гипоталамус, стрпатум, четверохолмие). Вместе с те.м, в отделах, богатых проводящими элементами: белом веществе, варолиевом мосте, продолговатом мозге и корешках она существенно ниже [33, 121]. В настоящее время предполагается, что ФМСФ-КП может вовлекаться в процессинг и деградацию некоторых биологически активных пептидов [25, 37,46]. Активность фермента зависит от возраста животных [41, 119]. Обнаружены половые отличия в активности ФМСФ-КП в тканях крыс как во время полового созревания [119, 120], так и у взрослых животных [30, 119], Ферментативная активность у самок претерпевает изменения в зависимости от стадии эстралыюго цикла [15]. Это может указывать на важную роль исследуемого фермента в осуществлении процессов роста, развития, половой дифференцировки. Вместе с тем, высокий уровень активности фермента в надпочечниках и гипофизе, биологически активным пептидам которых (ЛКТГ, [і-зидорфину, энкефалнпам и др.) принадлежит определяющая роль в ответе на стресс [2, 18, 45, 73, 105], вызывает дополнительный интерес к изучению влияния стресса на активность ФМСФ-КП. В эксперименте использовали по 2 группы животных обоих полов. Животные пренатально стрессированнои группы являлись потомством самок, которые на протяжении всего периода беременности раз в сутки в течение 20 минут подвергались эмоционально-болевому стрессу. Для этого животным через каждые 30 с в беспорядочном режиме подавали один из трех сигналов длительностью 1 с: вспышка света (лампа накаливания мощностью 200 Вт, расстояние 0,5 м), звук (ПО Дб), электрокожное раздражение (сила тока 2 мА). В качестве контроля использовали потомство интактных самок, В возрасте 120 дней крыс каждой группы разделили на 2 подгруппы: постнатально стрес с провапную и контрольную. Животные постнатально стрессированнои группы на протяжении 15 суток раз в сутки в течение 20 мин подвергались эмоционально-болевому стрессу способом, описанным выше. В ходе эксперимента было сформировано 4 группы животных: К — контрольные, С — пренатально стрессированные, КС — постнатально стрессированные, СС — крысы, испытавшие пре- и постнатальный стресс. Животных декапитировали и извлекали отделы мозга, гипофиз, надпочечники и половые железы. Образцы тканей и отделы мозга гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в 20 мМ натрий ацетатном буфере, рН 5,6, содержащем 50 мМ NaCl, в соотношении 1:100 (весюбъем) для отделов мозга, 1:50 - для семенников. Полученные гомогенаты использовали как источник КПН и ФМСФ-КП.
Исследование активности карбоксипептидазы Н в тканях крыс, перенесших пренатальный стресс
В стриатуме и гипофизе интактных самцов активность КПН изменялась куполообразно с пиком активности в Р28. Активность фермента в надпочечниках контрольных животных повышается от РО - Р14 к Р28, затем снижается к Р45 - Р120. Активность КПН в семенниках плавно снижалась от РО к Р45, затем повышалась к Р120.
В отделах мозга не было существенных различии в ферментативной активности новорожденных и 120-дневных крыс. Активность КПН в гипофизе и семенниках взрослых животных была выше, а в надпочечниках — ниже, чем у новорожденных
Пренатально стрессированные животные отличались от интактных возрастной динамикой активности фермента. Максимальная активность КПН в гипоталамусе самцов опытной группы отмечалась на момент рождения, снижалась к Р28, затем повышалась к Р45, оставаясь такой до Р120. Активность фермента в стриатуме повышалась от РО к Р14 и немного снижалась к Р28, оставаясь на том же уровне до Р120. Ферментативная активность в гипофизе повышалась к Р14, оставаясь приблизительно на том же уровне во все последующие возрастные периоды. Активность КПН в гипоталамусе взрослых животных была в 1,3 раза ниже, в стриатуме - в 1,6 и в гипофизе - приблизительно в 2,5 раза выше, чем у новорожденных. Активность КПН в надпочечниках и семенниках пренатально стрессированных животных имела сходную динамику: за повышением к Р14 следовало постепенное ее снижение к Р120, причем активность фермента у взрослых животных составляла приблизительно 50% от таковой на момент рождения.
Новорожденные пренатально стрессированные животные имели более высокую активность КПН в гипоталамусе и низкую - в гипофизе и семенниках, чем контрольные. В возрасте 14 дней отмечалась повышенная активность фермента в надпочечниках опытных животных. В Р28 у животных, перенесших пренатальный стресс, ферментативная активность во всех отделах, кроме семенников, ниже контрольной. Активность КПН в надпочечниках пренатально стрессированных животных в Р45 выше, а в семенниках в Р120 - ниже, чем в контроле. По данным дисперсионного анализа (табл.2), возраст оказывал влияние на активность КПН во всех исследуемых отделах, за исключением гипоталамуса интактных, а также гипоталамуса и яичников пренатально стрессированных самок крыс.
В стриатуме интактных животных отмечено повышение активности фермента к Р14, затем плавное снижение к Р45 - Р120. Активность КПН в гипофизе взрослых животных была приблизительно на одном уровне с новорожденными, отмечалось ее повышение в возрасте Р14 - Р45. Пик ферментативной активности в надпочечниках и яичниках отмечен на 14-Й день жизни, затем следовало ее снижение и к Р45 - Р120 активность КПН достигала минимального уровня. В стриатуме пренатально стрессированных крыс отмечен 2-кратный подъем активности КПН на 14-й день жизни, далее активность сохранялась на том же уровне.
Активность КПН в гипофизе самок, перенесших пренатальный стресс, повышалась с Р0 к Р28, затем плавно снижалась до Р120. Активность фермента у взрослых животных была в 3 раза выше, чем у новорожденных. Активность КПН в надпочечниках повышалась в 2 раза к Р14, затем следовало ее снижение до Р120, причем активность КПН взрослых животных составляла около 50% от таковой у новорожденных. Пренатальний стресе оказывает влияние на активность КПН в тканях самок крыс всех исследуемых возрастов.
У новорожденных пренатально стрессированных самок активность фермента в яичниках была ниже контрольного уровня. 14-дневные животные, перенесшие пренатальный стресс, отличались от контроля сниженной активностью КПН в отделах мозга и яичниках. В Р28 активность фермента в гипофизе самок опытной группы выше, а в яичниках - ниже, чем в контроле. 45-дневные пренатально стрессированные животные отличались от контроля сниженной активностью КПН в надпочечниках, а 120-дневные -сниженной активностью в надпочечниках, но повышенной - в гипоталамусе и гипофизе.
В возрастной динамике активности фермента самок и самцов обнаружены некоторые различия. Половые отличия в активности КПН отмечены во всех изучаемых отделах интактных животных в возрасте 14 дней (активность достоверно выше у самок), 28-дневные самки характеризуются более низкой активностью фермента в гипофизе и надпочечниках. Активность КПН в стриатуме самок в возрасте 45 дней выше, а в гипоталамусе, гипофизе и половых железах в Р120 - ниже таковой у самцов.
Картина половых различий в активности фермента пренатально стрессированных животных была несколько иной. Новорожденные самки отличались от самцов более низкой активностью КПН в гипоталамусе и стриатуме. В Р28 активность КПН в гипоталамусе и гипофизе, в Р45 и Р120 -в половых железах самок выше по сравнению с самцами. 45-дневные самки отличались от самцов более низкой активностью фермента в надпочечниках.
То есть, под влиянием пренатального стресса произошло нарушение полового диморфизма в активности КПН. Уже у новорожденных пренатально стрессированных животных обнаружились половые отличия в активности фермента в отделах мозга, хотя в контрольной группе в этом возрасте полового диморфизма не выявлено. Полностью сглаживались различия в активности КПН 14-дневных пренатально стрессированных животных, в гипофизе и гипоталамусе 120-дневных. Активность фермента в гипоталамусе самок в Р28, в половых железах в Р45 стала выше, а в надпочечниках в Р45 - ниже, чем у самцов. В гипофизе в Р28 и гонадах в Р120 половые отличия сохранились, но соотношение активности стало противоположным.
Дисперсионный анализ влияния пола, возраста и их взаимодействия на активность КПН в тканях крыс (здесь и далее: Рфі -влияние пола, — влияние пренатального стресса, Рфз — влияние взаимодействия пола и пренатального стресса, Т - влияние постпатальиого стресса, ф5 - влияние взаимодействия постпатальиого стресса и пола, фц -влияние взаимодействия пренатального и постпатальиого стресса, Рф7 -влияние возраста, V — влияние взаимодействия пола и возраста, Рф9 — влияние взаимодействия пренатального стресса и возраста).
Исследование активности КПН в тканях крыс, испытавших воздействие хронического эмоционально-болевого стресса
Исследования, проводимые биохимиками, физиологами, медиками, указывают на то, что стрессовые воздействия в раннем онтогенезе оказывают существенное влияние на формирование и выполнение ряда функций развивающегося и взрослого организма [17, 44, 86, 87, 90, 96, 236, 245,305,336,347,350,355].
В пренатальный период, когда идет развертывание генетической программы и активное развитие нервной и эндокринной систем, даже относительно слабые воздействия, не вызывающие сильных морфологических изменений, сопровождаются длительными изменениями нейроэндокринных и нейрохимических механизмов стрессорной реактивности [60, 61, 62, 82, 265, 284, 288, 352, 357].
Пренатальный стресс имеет важное генетико-эволюционное значение, поскольку особи, испытавшие стрессориые воздействия в ранний период развития, характеризуются сниженной выживаемостью [355], ограниченными возможностями к адаптации к условиям внешней среды [335, 354], пониженной репродуктивной способностью [219, 347, 348].
К сожалению, на сегодняшний день невыясненным остается ряд вопросов, касающихся биохимических изменений, возникающих в организме в результате воздействий в раннем онтогенезе. Имеющиеся литературные данные свидетельствуют в пользу кортикостероидного механизма пренатального стресса.
Стресс во время беременности прежде всего может вызвать у самок такие реакции, как стимуляция САС и ГГНС. Материнские катехоламины понижают ток крови в плаценте, приводя к временной гипоксии у плодов [91]. Предполагается, что в основе эффектов действия стресса на зародыш лежит влияние материнских глюкокортикоидов [139], поскольку ни катехоламины в физиологических концентрациях [91], ни АКТГ [172] не проникают через плацентарный барьер. Кортикостероиды же надпочечников матери, проникая через плаценту, способны вмешиваться в биосинтез гормонов надпочечников и половых желез у плодов, оказывая влияние иа ключевые ферменты биосинтеза стероидов [91].
В настоящее время известно, что в плаценте вырабатывается фермент, превращающий кортикостероиды в неактивные метаболиты — 11-р1-гидроксистероидде гид роге наза [145, 146, 251], Плацентарная 11-J3-гндроксистероиддегидрогеназа II типа защищает зародыш от избытка глюкокортнкоидов матери. Активность этого фермента имеет межполовые различия, в частности, Montano et al. [282] описали повышенный транспорт кортикостерона через плаценту у плодов-самок, чем у плодов-самцов мышей. Отчасти этим можно объяснить, почему самки более чувствительны к пренатальному стрессу, чем самцы. На участие 11-р-гидроксистероиддегидрогеназы в защите от пренатального воздействия стресса указывают результаты исследования поведения животных, [163] согласно которым ингибирование фермента беременных самок вызывало поведенческие расстройства потомства, сходные с таковыми при пренатальном стресенровании.
В протекании стрессорных реакций важная роль принадлежит регуляторным пептидам [2, 8, 18, 22, 55, 68, 71, 76, 77, 95, 97, 100, 118, 300]. Пренатальныи стресс оказывает продолжительное влияние на функционирование пептидергнческих систем [3, 82, 91, 236, 295, 312, 352, 353, 355, 357]. Одшш из механизмов, обеспечивающим поддержание необходимого уровня регуляторных пептидов в организме, является изменение протеолитической активности [1, 11, 27, 28, 56, 180, 224].
Основные карбоксипептидазы — ферменты, участвующие в конечных стадиях образования физиологически активных пептидов, вероятно, способны изменять уровень пептидов в клетках и тканях. Предполагается, что воздействие стресса, этанола и транквилизаторов на организм опосредовано изменением активности КПН и ФМСФ-КП [15, 23, 24, 32, 34, 39, 47, 49, 53, 88]. Изучение активности основных карбоксипептидаз у потомства беременных самок, перенесших стресс, будет способствовать выяснению механизмов, лежащих в основе нарушений, вызванных стрессом в пренатальныи период. Предварительно мы изучили активность КПН и ФМСФ-КП в тканях ннтактных животных. Нами показано, что наиболее выраженная зависимость активности КПН от возраста у ннтактных животных (рис. 1-4) прослеживалась в гипофизе и стриатуме.
Функционирование важнейшей железы внутренней секреции, координирующей работу всего организма — гипофиза - имеет особенности в различные возрастные периоды [14, 82, 115]. С возрастом изменяется синтез тропных гормонов, что, вероятно, и объясняет значительные возрастные колебания активности исследуемых ферментов (рис. 1-4). Стриатум - отдел мозга, имеющий важнейшее интегрирующее значение в функционировании организма, претерпевающее значительные возрастные изменения [108, 115, 123]. Кроме того, стриатум является местом синтеза энкефалинов [135], участвующих в развитии и функционировании репродуктивной системы [13, 85, 339].
Учитывая вышесказанное, можно предположить, что онтогенетическое изменение активности КПН и ФМСФ-КП играет немаловажную роль в функционировании центральных регуляторных систем организма в процессе его постнаталыюго развития.
Половое созревание - процесс, имеющий биохимические особенности у противоположных полов. Анализируя результаты определеЕшя активности КПН и ФМСФ-КП, мы наблюдали некоторые половые различия в возрастной динамике активности ферментов (рис. 1-4). Максимальная активность в возрасте 14 дней у самок и 28 дней — у самцов соответствует началу полового созревания крыс, сопровождающемуся резким скачком содержания пептидных гормонов в крови. Согласно [14, 154, 174], максимальный уровень ФСГ в плазме крови самок обнаружен на 12-й, а у самцов - на 25-35 дни жизни. Пик выброса ЛГ у самок отмечен в ювенильный период, а у самцов- в возрасте 35-45 дней [14, 154, 174].
Пик активности в Р14 был отмечен у ннтактных самок во всех отделах, за исключением гипоталамуса, для КПН, и во всех отделах - для ФМСФ-КП. У ннтактных самцов максимальная активность КПН в стриатуме, гипофизе и надпочечниках отмечена в Р28, а ФМСФ-КП в гипоталамусе, стриатуме, гипофизе и семенниках — в Р14, в надпочечниках - в Р0-Р14. Данные исследований могут указывать на участие изучаемых ферментов в протекании пубертационных процессов.
Как известно, период со второго по 12-й дни жизни характеризуются сниженной реактивностью организма на стресс [205]. Возможно, наблюдаемое увеличение ферментативной активности 14-дневных животных связано с особенностями постнатального развития гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы и является одним из звеньев механизма формирования адекватной реакции растущего организма на внешние воздействия.
