Содержание к диссертации
Стр.
ВВЕДЕНИЕ 8
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Развитие оксидативного стресса в гепатоцитах 13
1.1.1. Образование активных форм кислорода в клетках
печени 13
Свободнорадикальное окисление биомолекул 14
Роль свободных радикалов при патологии 18
1.2. Антиоксидантная защита организма 21
1.2.1. Влияние низкомолекулярных антиоксидантов на
свободнорадикальное окисление 21
1.2.2. Глутатион - регулятор ферментативной антиоксидант-
ной системы 22
1.2.3. Антиоксидантные ферменты клеток и их роль в
регенерации гепатоцитов 23
1.3. Нарушение процессов метаболизма глюкозы в клетке при
оксидативном стрессе 25
1.4. Функционирование пентозо фосфатного пути при
оксидативном стрессе 26
1.5. Токсическое повреждение печени как модель активации
свободнорадикальных реакций 28
1.5.1 Механизм действия четыреххлористого углерода 28
1.5.2. Механизм действия гидразина 28
. 1.6. Общая характеристика 6-фосфоглкжонатдегидрогеназы 30
Катализируемая реакция 30
Структура и молекулярная масса фермента 31
Локализация 6-фосфоглюконатдегидрогеназы 32
1.6.4. Методы очистки 6-фосфоглюконатдегидрогеназы 34
1.6.5. Кинетические свойства 6-фосфоглюконат
дегидрогеназы и регуляция ее активности 35
1.6.5.1. Влияние концентрации субстрата и коферментана
активность 6-фосфоглюконатдегидрогеназы 35
1.6.5.2. Зависимость 6-фосфоглюконатдегидрогеназной
реакции от температуры и рН 36
Активаторы 6-фосфоглюконатдегидрогеназы 37
Ингибиторы 6-фосфоглюконатдегидрогеназы 37 ГЛАВА 2 Объект и методы исследования 39
2.1. Объект исследования 39
2.2. Создание модели интоксикации крыс четыреххлористым
углеродом 39
Создание модели интоксикации крыс сульфатом гидразина 39
Получение субклеточных фракций гепатоцитов 40
Определение интенсивности процессов свободнорадикаль-
ного окисления методом биохемилюмиыесценции 40
Оценка степени окислительной модификации белков 41
Определение концентрации восстановленного глутатиона 42
Определение активности ферментов 43
Определение количества белка 44
2.10. Выделение и очистка 6-фосфоглюконатдегидрогеназы из
печени крыс 45
2.10.1. Экстракция 45
2.10.2. Фракционирование белков с помощью сульфата
аммония 45
Гель-фильтрация на сефадексе G-25 46
Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе 46
Концентрирование фракций фермента 47
2.10.6. Гель-хроматография наТоуореагІ HW-65 47
2. И. Исследование кинетических характеристик и регуляции
активности фермента 48
Аналитический электрофорез 48
Определение молекулярной массы фермента 49
Статистическая обработка результатов 49 ГЛАВА 3. Сравнительная оценка интенсивности свободно-радикальных процессов и активности 6-фосфоглюконатдегидрогеназы в динамике развития токсического поражения печени крыс 50
' 3.1. Параметры биохемилюминесценции в печени и сыворотке
крови крыс в динамике развития интоксикации под действием
ССЦ и сульфата гидразина 50
3.2. Изменение активности аконитатгидратазы при развитии
токсического поражения 53
3.3. Определение содержания карбонильных групп в белках при
интоксикации крыс гепатотропными агентами 57
3.4. Изменение активности дегидрогеназ пентозофосфатного
пути при развитии оксидативного стресса 59
ГЛАВА 4. Кинетические и регулнториые свойства 6-фосфо-
глюконатдегидрогеназы из печени крыс в норме и при
интоксикации СС14 64
Исследование субклеточной локализации 6-фосфо-глюконатдегидрогеназы 64
Очистка 6-фосфоглюконатдегидрогеназы из печени контрольных и подвергнутых токсическому гепатиту крыс 66
4.3. Молекулярная масса 6-фосфоглюконатдегидрогеназы 70
4.4. Исследование кинетических параметров каталитического
действия 6-фосфоглгоконатдегидрогеназы в норме и при
интоксикации СС14 73
Влияние концентрации ионов водорода на активность 6-фосфоглюконатдегидрогеназы в норме и при развитии токсического гепатита 76
Регуляторные свойства 6-фосфоглюконатдегидрогеназы из печени крыс в норме и при патологии 76
Участие ионов некоторых металлов в регуляции активности 6-фосфоглюконатдегидрогеназы 76
Исследование регуляции активности фермента при действии пероксида водорода 79
Влияние глутатиона на скорость протекания 6-фосфо-глюконатдегидрогеназной реакции в печени контрольной и опытной групп крыс 79
Влияния нуклеотидов на активность фермента 81
Влияние ди- и трикарбоновых кислот на активность 6-фосфоглюконатдегидрогеназы в норме и при интоксикации крыс
ССЦ 85
4.6.6. Влияние метаболитов углеводного обмена на
активность 6-фосфоглюконатдегидрогеназы из печени крыс 86
ГЛАВА 5. Кинетические и регуляторные свойства 6-фосфо
глюконатдегидрогеназы из печени крыс при интоксикации
сульфатом гидразина 88
5.1. Очистка 6-фосфоглтоконатдегидрогеназы из печени крыс
при интоксикации сульфатом гидразина 88
5.2. Исследование кинетических параметров каталитического
действия 6-фосфоглюконатдегидрогеназы в норме и при
интоксикации сульфатом гидразина 92
5.3. Влияние концентрации ионов водорода на активность
6-фосфоглюконатдегидрогеназы при интоксикации сульфатом
гидразина 94
5.4. Регуляторные свойства 6-фосфоглюконатдегидрогеназы из
печени крыс при интоксикации крыс сульфатом гидразина 94
Участие ионов некоторых металлов в регуляции активности 6ФГДГ 94
Исследование регуляции активности фермента при действии пероксида водорода 96
Влияние глутатиона на скорость протекания 6-фосфо-глюконатдегидрогеназной реакции при интоксикации крыс сульфатом гидразина 97
Влияния нуклеотидов на активность фермента 100
Влияние ди- и трикарбоновых кислот на активность 6-фосфоглюконатдегидрогеназы при интоксикации сульфатом гидразина 102
5.4.6. Влияние метаболитов углеводного обмена на
активность 6-фосфоглюконатдегидрогеназы из печени крыс в
условиях введения сульфата гидразина 102
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 103
ВЫВОДЫ 108
ЛИТЕРАТУРА ПО
ПРИЛОЖЕНИЕ 132
Введение к работе
Актуальность работы. Изучение молекулярных механизмов, ответственных за регуляцию и координацию обмена веществ в клетке, является фундаментальной проблемой биохимии. Исследование саморегулирования обменных процессов на уровне отдельных ферментных систем позволяет приблизиться к глубокому и детальному анализу организации метаболизма в живой клетке с выходом на более высокий организменный уровень. Однако многие аспекты регуляции клеточного метаболизма на ферментативном уровне, особенно, в условиях развития патологии, требуют дальнейших исследований. Это относится, в частности, к 6-фосфоглюконатдегидрогеназе (КФ 1.1.1.44, 6ФГДГ) -ферменту, катализирующему одну из реакций пентозофосфатного пути (ПФП) - окислительное декарбоксилирование 6-фосфоглюконата до рибулозо-5-фосфата.
Важность изучения 6ФГДҐ определяется физиологическим значением данного фермента, участвующего в образовании NADPH, необходимого для протекания многих биосинтетических реакций. Кроме того, по современным представлениям в основе патогенеза ряда заболеваний лежит дисбаланс между чрезмерным образованием активных форм кислорода (АФК) и недостаточностью антиоксидантных систем (ДОС) организма [36, 183, 184]. Благодаря функционированию глутатионредуктазной/глутатионпероксидазной (ГР/ГП) АОС в клетках обеспечивается детоксикация неорганического и органических пероксидов. Уровень NADPH играет наиболее значимую роль в регуляции интенсивности функционирования данной системы. Показано участие глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (ГбФДГ, КФ 1.1.1.49) в поставке восстановительных эквивалентов в условиях оксидативного стресса [37, 109]. Данные относительно функционирования 6ФГДГ при развитии патологий, связанных с интенсификацией процессов свободно-
радикального окисления (СРО), весьма противоречивы [119, 125, 129]. К настоящему времени исследованы физико-химические свойства 6ФГДГ, выделенной из ряда организмов [66, 78, 139]. Однако, такой аспект, как регуляция активности фермента при реорганизации метаболизма при оксидативном стрессе остается не изученным. Исследования в этом плане могли бы способствовать выяснению роли 6ФГДГ в лимитировании процессов СРО, значительно усиливающихся при патологии.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование кинетических свойств и регуляции активности 6ФГДГ из печени крысы при оксидативном стрессе, вызванном различными гепатотоксинами, В связи с поставленной целью решались следующие задачи: 1) сравнительная оценка интенсивности протекания сдободнорадикальных (СР) процессов в печени крыс в норме, при интоксикации крыс четыреххлористым углеродом и сульфатом гидразина;
2) получение высокоочищенных ферментных препаратов 6ФГДГ из печени
контрольных и подвергнутых интоксикации гепатотоксинами животных;
3) исследование кинетических параметров каталитического действия
6ФГДГ в норме и в условиях развития оксидативного стресса, вызванного
введением CCU и сульфата гидразина; 4) изучение регуляции активности
фермента в норме и при введении гепатотоксинов; 5) создание
гипотетической модели участия 6ФГДГ в регуляции протекания процессов
СРО в пораженной гепатотоксинами печени крыс.
Научная новизна. Проведено комплексное исследование особенностей регуляции 6ФГДГ в условиях интенсификации СР процессов, инициированных введением гепатотропных веществ (CCU, сульфат гидразина). Разработаны способы выделения и получены гомогенные препараты 6ФГДГ из печени контрольных и подвергнутых интоксикации гепатотоксинами животных. Впервые дана сравнительная
характеристика каталитических и регуляторных свойств 6ФГДГ в норме и при токсическом поражении печени. Выявлено, что в условиях оксидативного стресса происходит снижение удельной активности 6ФГДГ, что может быть связано с модификациями механизмов метаболитной регуляции функционирования фермента. На основе полученных результатов сделано заключение, что в условиях интоксикации гепатотоксинами 6ФГДГ, по-видимому, не играет существенной роли в поставке NADPH для ГР/ГП-системы, которая может обеспечиваться другими NADPH-генерирующими ферментами - в частности, Г6ФДГ и NADP-изоцитратдегидрогеназой. Предложена гипотетическая схема возможного участия 6ФГДГ в лимитировании СР процессов, путем снижения скорости образования короткоцепочечных Сахаров.
Практическая значимость. Полученные данные позволяют расширить и углубить фундаментальные представления о функционировании 6ФГДГ в условиях нормы и при патологии. Исследование особенностей метаболитной регуляции 6ФГДГ в условиях оксидативного стресса, развивающегося при токсическом поражении печени, может способствовать выяснению причин патогенеза на клеточном уровне и поиску путей коррекции патологического состояния в медицинской практике. Разработанные способы получения гомогенных ферментных препаратов 6ФГДГ из печени контрольных и подвергнутых интоксикации крыс могут быть использованы для получения ферментных препаратов в производственных и лабораторных условиях, а также могут применяться в научно-исследовательской практике при выделении других ферментов из различных тканей млекопитающих, при моделировании биохимических процессов in vivo для изучения кинетики сопряженных реакций в полиферментных системах. Материалы работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении курсов «Биохимия человека», «Свободно-
радикальные процессы», а также спецкурсов по аналитической и клинической биохимии и энзимологии. Кроме того, материалы работы используются при проведении практикумов, выполнении курсовых и дипломных работ студентами ВГУ.
Результаты работы использованы при выполнении гранта по научной программе «Фундаментальные исследования высшей школы в области естественных и гуманитарных наук «Университеты России» УР.07.01.004», а,также проекта по ведомственной целевой программе Министерства образования и науки РФ - «Развитие научного потенциала высшей школы» РНП. 2.1.1.4429.
Апробация работы. Основные результаты, полученные при выполнении диссертационной работы, представлены на 9-ой и 10-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 го века» (Пущине, 2005, 2006), III Съезде биофизиков России (Воронеж,
2004), VIII Международной научной экологической конференции «Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем» (Белгород, 2004), IV Международной научно-практической конференции «Медицинская наука XXI века» (Витебск, 2004), ежегодной научной отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2005,2006).
Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 8 публикациях - в 3 статьях и 5 тезисах.
На защиту выносятся следующие положения;
В динамике развития токсического поражения печени крыс гепатотоксинами (ССЦ, сульфат гидразина), сопровождающегося интенсификацией процессов СРО и увеличением активности Г6ФДГ, наблюдается снижение удельной 6ФГДГ-активности, указывающее на то,
что, по-видимому, данный фермент не играет существенной роли в генерировании NADPH для ГР/ГП АОС.
С использованием гомогенных ферментных препаратов 6ФГДГ показано, что при поражении печени гепатотоксинами происходят изменения кинетических параметров каталитического действия и регуляции активности фермента под действием ионов некоторых металлов, интермедиатов цикла Кребса, метаболитов углеводного обмена и нуклеотидфосфатов. При интоксикации гепатотоксинами имеет место ряд особенностей регуляции активности 6ФГДГ, которые могут способствовать торможению функционирования фермента: возникновение ингибирующего действия окисленного глутатиона, снятие активирующего эффекта изоцитрата и NAD.
Предложена гипотетическая схема, отражающая возможное участие 6ФГДГ в регуляции интенсивности протекания свободно-радикальных процессов в клетке, путем снижения концентраций короткоцепочечных Сахаров (глицеральдегнд, дигидроксиацетон, эритроза, рибоза-5-фосфат), которые могут усиливать оксидативный стресс [76] и вызывать апоптоз клеток [100].
Структура и объем работы. Диссертация представлена на 150 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения полученных результатов (5 глав), заключения, выводов, списка литературы и приложения. Иллюстративный материал включает 22 рисунка и 8 таблиц. В приложении содержатся 16 рисунков и 3 таблицы.
