Содержание к диссертации
Введение
Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ II
1.1. Сравнительная характеристика 6-фосфо-глюконатдегидрогеназы из различных источников II
1.2. Способы регуляции активности 6-фосфо-глюконатдегидрогеназы. 27 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 42
Глава 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ 42
2.1. Основные экспериментальные модели 42
2.2. Методы исследования 47
Глава 3. ОЧИСТКА И НЕКОТОРЫЕ СВОЙСТВА МОЛЕКУЛЯРНЫХ ФОРМ ФОСФОГЛЮКОНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИЗ ПЕЧЕНИ КРЫСЫ 56
3.1. Выделение и очистка фермента 56
3.2. Стабильность б-фосфоглюконатдегидрогеназы 61
3.3. Гомогенность фермента, его молекулярная масса и субъединичный состав 63
3.4. Влияние ионной силы раствора, концентрации ферментного белка и рН среды на активность фермента 66
3.5. Термостабильность 6-фосфоглюконатдегидрогеназы и влияние температуры на скорость катализируемой ею реакции 69
3.6. Влияние ионов на активность фермента 71
3.7. Внутриклеточный синтез и распад изофор-
мы В 6-фосфоглюконатдегидрогеназы 73
Глава 4. СТАЦИОНАРНАЯ КИНЕТИКА РЕАКЦИИ, КАТАЛИЗИРУЕМОЙ ФОСФОГЛЮКОНАТДЕГИДРОГЕНАЗОЙ ИЗ ПЕЧЕНИ КРЫСЫ 77
4.1. Зависимость скорости 6-фосфоглюконатде-гидрогеназной реакции от концентрации субстратов и выяснение общего механизма катализа 77
4.2. Ингибирование б-фосфоглюконатдегидроге-назы продуктами катализируемой ею реакции 84
4.3. Роль некоторых метаболитов клеточного обмена как модуляторов активности б-фос-фоглюконатдегидрогеназы 90
Глава 5. РЕГУЛЯЦИЯ ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ ВЕТВИ ПЕНТ030Ф0СФАТ-
НОГО ПУТИ НА УРОВНЕ 6-Ф0СФ0ГЛЮК0НАТДЕГИДР0-
ГЕНАЗЫ В ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ Bj-НЕДОСТАТОЧНОСТИ,
ВЫЗВАННОЙ ВВЕДЕНИЕМ ОКСИТИАМИНА ЗДОРОВЫМ ЖИ
ВОТНЫМ И КРЫСАМ-ОПУХОЛЕНОСИТЕЛЯМ 94
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 110
ВЫВОДЫ 115
ЛИТЕРАТУРА 117
- Сравнительная характеристика 6-фосфо-глюконатдегидрогеназы из различных источников
- Основные экспериментальные модели
- Выделение и очистка фермента
- Зависимость скорости 6-фосфоглюконатде-гидрогеназной реакции от концентрации субстратов и выяснение общего механизма катализа
Сравнительная характеристика 6-фосфо-глюконатдегидрогеназы из различных источников
В классических работах Warburg и Christian (204-206) впервые было показано, что первичный продукт фосфорилирования глюкозы - глюкозомонофосфат - является специфическим субстратом окисления как в опытах с клеточными системами (гемолизированные эритроциты), так и в высокоочищенных, искусственно реконструированных ферментных системах. Выдвинутое представление о том, что окисление гексозомонофосфата является первым звеном в цепи биологического окислительного распада углеводов, для своего подтверждения требовало выяснения вопроса, может ли продукт этой реакции - образующаяся фосфоглюконовая кислота - в свою очередь подвергаться дальнейшим превращениям и каков характер и условия этих превращений. Детальное изучение этого вопроса было проведено Энгельгардтом и Бархаш (51) в опытах на дрожжевом мацерацион-ном соке, которые установили, что фосфоглюконовая кислота подвергается окислительному превращению под влиянием резистентной к цианиду ферментной системы, в результате чего углеродная цепь кислоты, подвергаясь декарбоксилированию, укорачивается на одно углеродное звено. Они показали, что акцептором отщепляемого от фосфоглюконовой кислоты водорода может служить не только кислород, но и метиленовая синька и ацетальдегид. Уже тогда ими было высказано мнение, что продуктом декарбоксилирования фосфоглюконовой кислоты может быть фосфопентоза - фосфоарабиноза или фос-фоарабоновая кислота - и что повторение аналогичных превращений должно давать соответствующие дериваты тетрозы и, наконец, образовать фосфотриозу или фосфоглицериновую кислоту. Dickens (94) идентифицировал образующееся соединение как рибозо-5-фосфат.
Scott и Cohen (176) далее исследовали продукты, образующиеся при окислении 6-ФГ дрожжевыми ферментными препаратами, и подтвердили образование фосфорного эфира рибозы. Методом бумажной хроматографии они установили, что это соединение ведет себя подобно Р-5-Ф. Кроме того, среди продуктов окисления б-фосфоглюко-новой кислоты авторами найдены также эфиры арабинозы, 2-кетоглю-коновой кислоты и триозы. Обнаружен был также фосфатный эфир, дававший атипичную с орцином реакцию на бумажных хроматограммах. Самым серьезным препятствием для точной идентификации продуктов окисления 6-ФГ являлась постановка экспериментов с грубыми ферментными препаратами, обуславливающими образование целого спектра метаболитов. Horecker и Smyraiotis (117) разработали метод очистки дегидрогеназы б-фосфоглюконовой кислоты из дрожжевых экстрактов. Очищенный фермент катализировал количественное превращение б-ФГ в С0г и пентозофосфат, который не подвергался дальнейшему окислению. Пентозофосфат был идентифицирован как смесь Ри-5-Ф и Р-5-Ф. Соотношение между ними в опытах авторов зависело от времени инкубации с ферментом. Ри-5-Ф появлялся первым и превращался в Р-5-Ф ферментом, присутствующим как примесь в очищенных препаратах б-ФГ ДГ, который авторы считали возможным назвать пентозофосфатизомеразой. Таким образом, истинным продуктом окисления б-ФГ для широкого круга биологических объектов оказался Ри-5-Ф. Поскольку превращение б-ФГ в Ри-5-Ф протекает через две стадии - дегидрирование и декарбоксилирование, то многие исследователи первоначально предполагали, что этот процесс катализируется двумя независимыми ферментами: дегидро-геназой и декарбоксилазой. Однако эксперименты, выполненные с кристаллическим препаратом фермента из Candida utilis (157), катализирующим окисление и декарбоксилирование б-ФГ, однозначно показали, что и дегидрогеназная, и декарбоксилазная активности принадлежат одному ферменту, названному б-фосфоглюконатдегидро-геназой. Подтверждением этому явились безуспешные попытки исследователей разделить стадии окисления и декарбоксилирования (117, 157) и обнаружить предполагаемый промежуточный продукт превращения б-ФГ в Ри-5-Ф-3-кето-6-фосфоглюконовую кислоту.
Основные экспериментальные модели
Классическим приемом моделирования недостаточности витамина Вт является содержание животных на безтиаминовой синтетической диете. Основная биохимическая характеристика пищевого Вт-авита-миноза - снижение активности тиаминзависимых ферментов, в частности, транскетолазы (38) - фермента, катализирующего важные этапы последовательности неокислительных реакций ГІФП обмена углеводов. Данные относительно функционирования окислительной ветви при недостаточности тиамина малочисленны и противоречивы (65, 141). С целью изучения этого вопроса мы провели модель пищевого Вт-авитаминоза. Недостатками указанной выше модели являются: длительность опыта, сложность биохимической картины, обусловленная не только дефицитом тиамина, но и сопутствующими авитаминозу факторами, такими как возможная дефектность диеты по отдельным компонентам, потеря у животных аппетита, диаррея и др. Их можно обойти, применив в эксперименте антивитамин Вт - окси-тиамин. Последний позволяет быстро моделировать достаточно полно выраженный по биохимическим сдвигам Вт-дефицит у крыс. Скармливание животным синтетической безтиаминовой диеты с одновременным введением окситиамина показало однозначность их влияния на окислительную ветвь ПФП. Это послужило обоснованием проведения всех последующих исследований на модели окситиаминового Вт-гиповитаминоза. Для более полной характеристики влияния тиамино-вой недостаточности на функционирование б-ФГ ДГ мы использовали дозированное применение окситиамина, что позволило достирать ги-повитаминозного состояния различной степени выраженности. Учитывая влияние окситиамина на активность дегидрогеназы б-ФГ и некоторую канцеростатическую активность этого соединения (II), целе - 43 -сообразно было изучить в эксперименте его действие на фермент в печени крыс-опухоленосителей и, таким образом, расширить представления о механизме канцеростатического действия антиметаболита, что позволит более целенаправленно проводить поиск новых эффективных лечебных препаратов.
Выделение и очистка фермента
В литературе описано рад методов, позволяющих выделять 6-ФГ ДГ из различных источников. Procsal и Holten (159) разработали метод очистки дегидрогеназы б-ФГ из печени крысы до гомогенного состояния. Однако полностью воспроизведенный данный метод в наших лабораторных условиях не дал ожидаемых результатов. Фракционирование насыщенным раствором сульфата аммония позволяло получать не более 50% активности фермента от ее исходной величины, к тому же при этом происходило значительное увеличение объема экстракта, затруднявшее проведение последующих стадий. Применение линейного градиента калий-фосфатного буфера (5-40 мМ, рН 7,0) с целью элюирования б-ФГ ДГ при ее хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе давало растянутый профиль элюции ферментативной активности, в результате чего фермент оказывался сильно разбавленньм, что создавало дополнительные трудности при дальнейшей очистке энзима и приводило к значительной инактивации фермента (до 20%), вызванной снижением его стабильности. При хроматографии 6-ФГ ДГ на КМ-целлюлозе мы столкнулись с трудностью следующего порядка: несмотря на то,что размер колонки значительно превышал рекомендуемый авторами, часть ферментативного белка не связывалась с ионообменником. Кроме того, значительные потери активности энзима имели место при элюировании его с КМ-целлюлозы линейным градиентом калий-фосфатного буфера (3-12 мМ, рН 6,9) и последующем концентрировании разбавленного раствора фермента. В итоге выход конечного продукта не превышал 2-5%, к тому же полученный ферментный препарат содержал значительные примеси, обнаруживаемые методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле. В качестве одной из побочных активностей установлена MDP -специфичная изоцитратдегидрогеназа, препятствовавшая использованию выделенного фермента в целях определения внутриклеточной концентрации б-ФГ в образцах тканей животных. Перечисленные выше недостатки описанного в литературе метода обусловили необходимость дальнейших исследований в разработке способа изолирования и очистки б-ФГ ДГ из печени крысы, отличающегося воспроизводимостью, доступностью использования, высоким выходом конечного продукта, относительно низкими затратами времени на его осуществление. Попытка использовать метод гель-фильтрации через еефадекс Г-І50 оказалась неудачной: эффективность очистки была незначительной, кроме того, имело место сильное разбавление ферментного белка. Хроматография б-ФГ ДГ на фосфоцеллюлозе с применением субстратной элюции давала хорошие результаты, однако здесь мы столкнулись с трудностью последующего удаления субстрата из препарата фермента. После многочисленных экспериментов нам удалось разработать метод, позволяющий разделять б-ФГ ДГ на молекулярные формы и нарабатывать их в препаративных количествах с высокой степенью чистоты. Этот метод включает пять стадий очистки.
Зависимость скорости 6-фосфоглюконатде-гидрогеназной реакции от концентрации субстратов и выяснение общего механизма катализа
Измерения начальной скорости реакций, катализируемых ферментами, имеют двоякое значение. Во-первых, они позволяют оценить, как быстро данное количество фермента может превратить данное количество субстрата в продукт, или, как быстро образуется и исчезает то или иное промежуточное соединение. Во-вторых, они являются основой кинетических исследований, проводимых с целью определения констант скорости индивидуальных ферментативных стадий, а также установления формального кинетического механизма (схемы процесса) реакции. Основные условия стационарной кинетики, как известно, заключаются в измерении именно начальной скорости реакции, когда наличием продуктов реакции можно пренебречь, что достигается достаточным молярным избытком субстрата по отношению к ферменту (26). Принцип стационарности применим в условиях, обеспечивающих линейную зависимость начальной скорости реакции от концентрации фермента. Эти требования выполнялись при изучении кинетики реакции окислительного декарбоксилирования б-ФГ при участии FADP+ с образованием Ри-5-Ф, NADPH и СОр, катализируемой 6-ФГ ДГ.
Кинетический анализ реакций этого типа обычно состоит в регистрации их начальных скоростей при переменной концентрации одного субстрата и нескольких фиксированных концентрациях другого субстрата (126, 196). Однако мы вначале провели изучение зависимости начальной скорости реакции от концентрации каждого из субстратов при постоянной насыщающей концентрации другого субстрата. Такой методический подход позволяет применить достаточно широкий диапазон концентраций для каждого вариабельного субстрата, что повышает обоснованность заключений о характере кинетических зависимостей. Для обеих изоформ 6-ФГ ДГ установлена гиперболическая зависимость начальной скорости реакции от концентрации каждого из субстратов (рис. 15), описываемая уравнением Михаэлиса-Ментен, т.е. при низкой концентрации субстрата скорость реакции пропорциональна его концентрации.
