Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ АКТОМИОЗИН-ЗАВИСИМОЙ КЛЕТОЧНОЙ
ПОДВИЖНОСТИ И СОКРАТИМОСТИ ГЛАДКИХ МЫШЦ 13
1.1 Актомиозшювый цитоскелет - механическая основа движения клеток 13
1.2. Актин и миозин II - главные сократительные белки клетки 13
1.3. ФосфорилированиеРЛЦ- ведущий механизм активации миозина 16
1.4. Ферменты, регулирующие уровень фосфорилирования миозина II 19
1.4.1. Киназа легких щпей миозина (КЛЦМ) 19
1.4.2. Rho-актжируемая киназа (Rho-киназа) 20
1.4.3. Другие Са"'-независимые протеипкиназы 21
1.4.4. Фосфатаза легких цепей миозина (ФЛЦМ) 23
1.4.5. Химические ингибиторы ферментов-модуляторов активности миозина 11.24
2. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ МИОЗИНА II В СОКРАТИТЕЛЬНОМ АППАРАТЕ ГЛАДКИХ МЫШЩ 26
2.1, Ультраструктура миозиновых филаментов II гладких мышц 26
2.2. Факторы, препятствующие деполимеризации миозиновых филаментов гладких мышц 27
2.3. Особенности регуляции сокращения гладких мышц под действием фосфорилирования РЛЦ миозина 28
2.4, Пермеабилизованные гладкомышечные волокна как модель исследования
регуляции сокращения гладкой мускулатуры 29
3. ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ И РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ
МИОЗИНА II В НЕМЫШЕЧНЫХ КЛЕТКАХ 31
3.1. Двигательные реакции в миграции немышечных клеток 31
3.2. Распределение структурных элементов миозина II в мигрирующей клетке 35
3.3. Пространственная регуляция фосфорилирования РЛЦ миозина II в клетке 38
3.4. Экспериментальные подходы к исследованию механизмов миозин II -зависимой подвижности немышечных клеток 40
4. СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА БЕЛКА KRP (ТЕЛОКИНА) 42
4.1. Структура KRP 42
4.2. KRP как эндогенный регулятор активности миозина II 43
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 47
1. МАТЕРИАЛЫ 47
1.1 .Реактивы и материалы для биохимических и молекулярно-биологических
исследований 47
1.2.Реактивы и материалы для клеточно-биологических исследований 48
1.3. Реактивы и материалы для физиологических исследований 49
2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 49
2.1 Биохимические методы 49
2.1.1. Определение концентрации белка 49
2.1.2. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецил сульфата натрия (ДСН-электрофорез) 49
2.1.3. Мочевинно-глицерольный электрофорез 50
2.1.4. Иммуноблоттииг 50
2.1.5. Приготовление образцов клеток и гладкомышечных волокон для ДСП-электрофореза 51
2. 1. б. Приготовление образцов из гладкомышечных волокон и N1H3T3
фибривластов для мочевиино-глицерольного электрофореза 52
2.1.7. Экспрессия и очисткарекомбинантного KRP и его мутантних форм. 52
2.1.8. Фосфорилирование KRP in vitro 54
2.1.9. Получение KRP, меченого 5-TMRIA 54
2.2. Молекуляржьбиологические методы 54
2.2.1. Создание и характеристика молекулярно-генетических конструкций 54
2.3. Клеточно-биологические методы 55
2.3.1. Культивирование фибробластов линии NIH ЗТЗ 55
2.3.2. Транзиторная трансфекция фибробластов линии N11-1313 56
2.3.3. Получение трансгенных фибробластов линии NIIT ЗТЗ, стабильно экспрессирующих KRP и ACKRP 56
2.3.4. Направленная миграция в камере Бойдена 57
2.3.5. Адгезия фибробластов на иммунологические планшеты, покрытые коллагеном
Ітипа 57
2.3.6 Измерение миграции клеток методом зарастания царапины (Scratch assay). „58
2.3.7. Измерение сократительной активности фибробластов в коллагеновом матриксе 58
2.3.8. Экстракция растворимого миозина из клеток с помощью Тритона Х-100 60
2.3.9. Вычисление линейных параметров ядер и объема фибробластов линии NIII3T3 60
2.4. Физиологические методы 61
2.4.1. Получение препарата taenia caeci, пермеабилизобанного Тритоном Х-100 61
2.4.2. Измерение сократительной активности taenia caeci 61
2.4.3. Приготовление препаратов taenia caeci с меченым KRP для флуоресцентной микроскопии 62
2.5. Количественная обработка изображений и статистический анализ 62
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 64
1, ВЛИЯНИЕ KRP НА СОКРАТИМОСТЬ СКИНИРОВАННЫХ ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ ВОЛОКОН 64
1.1. Характеристика скинированных препаратов гладких мыщц taenia caeci 65
1.2 .Влияние KRP на Са2+-независимое сокращение, вызванное микроцистином 67
1.3.Влияние KRP на Са '"-зависимое сокращение и расслабление 73
1.3.1. Эффекты полноразмерного и фосфорилированного KRP на расслабление скинированных волокон 73
1.3.2. Релаксирующие эффекты мутантних форм KRP 76
2. ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОГО МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ KRP НА МОДЕЛИ
ТРАНСГЕННЫХ КЛЕТОК 79
2.1.Получение и характеристика трансгенных по KRP фибробластов 79
2.2. Влияние KRP на фосфорилирование РЛЦ миозина в фибробластах 83
2.3. Влияние KRP на количество полимерного миозина II в фибробластах 85
2.4. Роль С-концевого домена KRP в регуляции функционалыюго состояния миозина її в клетках 86
2.5. Влияние KRP на подвижность и сократимость трансгенных фибробластов 88
2.6. С-концевая последовательность KRP необходима для стимуляции хемотаксиса фибробластов 91
2.7. Внутриклеточные эффекты KRP связаны с миозином, регулируемым КЛЦМ и, возможно. Zip-кипазой, но не Rho-киназой 92
2.7.1. Влияние KRP на фосфорилирование миозина при ингибировании кииаз РЛЦ миозина 92
2.7.2. Влияние KRP на двигательные реакции клеток при ингибировании киназ РЛЦ миозина 94
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 96
1. РЕГУЛЯЦИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ МИОЗИНА II В КЛЕТКЕ ПОД
ДЕЙСТВИЕМ KRP %
2. ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ЭФФЕКТЫ KRP ОБУСЛОВЛЕНЫ ЕГО ПРЯМЫМ
СВЯЗЫВАНИЕМ С МИОЗИНОМ 102
3. KRP ПРЕПЯТСТВУЕТ ФОСФОРИЛИРОВАНИЮ РЛЦ МИОЗИНА В КЛЕТКЕ 104
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
- Актомиозшювый цитоскелет - механическая основа движения клеток
- Ультраструктура миозиновых филаментов II гладких мышц
- Двигательные реакции в миграции немышечных клеток
- Структура KRP
- Характеристика скинированных препаратов гладких мыщц taenia caeci
Введение к работе
Актуальность проблемы. Двигательная активность является фундаментальным свойством всех клеток животных. В специализированных мышечных клетках она проявляется в виде их сократительной активности, а в немышечных клетках – в их пространственном перемещении, или миграции. Эти процессы играют ключевую роль в репарации тканей, ремоделировании, ангиогенезе, иммунном ответе и патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний. Поэтому исследование механизмов регуляции двигательной активности клеток необходимо и актуально как с фундаментальной, так и с прикладной биомедицинской точки зрения.
Одним из базовых принципов клеточной подвижности является функционирование миозина II как внутриклеточного молекулярного мотора. Активность «несаркомерных» миозинов немышечных клеток и гладких мышц контролируется фосфорилированием остатка Ser-19 регуляторных легких цепей (РЛЦ). Это фосфорилирование выполняет одновременно две функции: с одной стороны, активируя АТФ-азную (моторную) активность миозина, а с другой - приводя к полимеризации его молекул в филаменты. Обе функции необходимы для образования функционального актомиозина и развития сокращения. В клетках обнаружены несколько киназ РЛЦ миозина, основными из которых являются Ca2+-зависимая киназа легких цепей миозина (КЛЦМ) и ряд Ca2+-независимых протеинкиназ, к которым относятся Rho-зависимая киназа (Rho-киназа), интегрин-ассоциированная протеинкиназа (ILK) и Zip-киназа. Дефосфорилирование миозина осуществляется под действием фосфатазы РЛЦ миозина (ФЛЦМ). Баланс активностей киназ и ФЛЦМ определяет внутриклеточный уровень фосфорилирования РЛЦ и двигательную активность гладких мышц и немышечных клеток.
В гладких мышцах миозин II в основном находится в филаментарном состоянии. В связи с этим, фосфорилирование Ser-19 РЛЦ реализует в гладкой мускулатуре, главным образом, функцию активации миозинового мотора и сокращения. Напротив, в немышечных клетках, где значительная доля миозина II представлена мономерами, фосфорилирование РЛЦ необходимо не только для активации АТФазной активности миозина, но и для образования его филаментарных структур. Известно, что моторная функция миозина II играет ведущую роль в движении клеток, в то время как значение структурной организации и динамики филаментов немышечного миозина в этом процессе остается неясным.
Трудность определения вклада структурной организации миозина II в клеточную подвижность связана с невозможностью разобщения эффектов фосфорилирования РЛЦ на полимеризацию миозина II и активацию его моторной функции. В настоящей работе мы применили два подхода с использованием свойств белка KRP (Kinase Related Protein, телокин), который представляет собой независимо экспрессирующийся только в гладких мышцах С-концевой домен КЛЦМ. Этот белок взаимодействует с гладкомышечным и немышечным миозинами in vitro и подавляет фосфорилирование Ser19 РЛЦ, но вызывает полимеризацию миозина в филаменты (Shirinsky et al., 1993). Используя препараты гладких мышцах мы, во-первых, установили эффект KRP только на моторную функцию миозина. Во-вторых, в системе немышечных клеток мы использовали способность KRP разобщать эффекты фосфорилирования РЛЦ на полимеризацию и моторную активность миозина. Учитывая, что общие принципы сократимости актомиозина одинаковы в гладких мышцах и немышечных клетках, сравнительный анализ двигательных реакций актомиозина в этих двух системах позволил нам вычленить значимость структурной динамики миозина II в клеточной подвижности.
Целью нашего исследования было выяснение механизма функционирования миозина II с использованием двух экспериментальных систем и белка KRP в качестве инструмента для разобщения структурной и моторной составляющих активности миозина. В модели трансгенных фибробластов мы исследовали действие KRP на актомиозин-зависимую клеточную подвижность, а в модели скинированных гладких мышц – избирательное действие KRP на сократительные свойства актомиозина. В работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:
-
Исследовать влияние KRP на сократимость скинированных гладкомышечных волокон.
-
Получить линии трансгенных фибробластов, экспрессирующих белок KRP и измерить уровень фосфорилирования и содержание полимерного миозина II в этих клетках.
-
Исследовать двигательный фенотип трансгенных фибробластов.
-
Исследовать влияние селективных ингибиторов протеинкиназ на хемотаксис и уровень фосфорилирования миозина II в трансгенных клетках.
-
Установить вклад С-концевой миозин-связывающей последовательности KRP в регуляцию состояния миозина II и миграцию трансгенных клеток, а также сократимость скинированных волокон.
Научная новизна работы. В ходе данной работы впервые обнаружено, что белок KRP ингибирует сокращение гладкой мускулатуры и фосфорилирование РЛЦ миозина, осуществляемое Ca2+-независимыми протеинкиназами, за счет связывания с миозином. Установлено, что в трансгенных фибробластах белок KRP является регулятором активности миозина II и активирует двигательную активность фибробластов. Определено, что мишенью KRP в клетке является миозин, регулируемый КЛЦМ и, возможно, Zip-киназой. С помощью сравнительного анализа эффектов KRP на сократимость гладких мышц и двигательные реакции фибробластов мы установили, что структурная составляющая активности миозина II играет критическую роль в реализации клеточной подвижности.
Практическая значимость работы. Результаты настоящей работы вносят значительный вклад в понимание механизмов функционирования миозина II и объясняют некоторые феномены клеточной подвижности. Получена новая информация о механизмах клеточной подвижности в целом, которая может служить основой для разработки новых подходов для коррекции как сократительных, так и двигательных реакций клеток.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на международных симпозиумах «Biological motility» (Пущино, Россия, 2004), «Biological motility: basic research and practice» (Пущино, Россия, 2006), XII конференции «Ломоносов-2005» (Москва, Россия, 2005), а также на 34-ой и 35-ой Европейских мышечных конференциях (Дебрецен, Венгрия, 2005; Гейдельберг, Германия, 2006).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 7 тезисов.
Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 4 таблицами и 31 рисунком. Диссертация изложена на 130 страницах. Список литературы включает 208 источников.
class1 ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ АКТОМИОЗИН-ЗАВИСИМОЙ КЛЕТОЧНОЙ
ПОДВИЖНОСТИ И СОКРАТИМОСТИ ГЛАДКИХ МЫШЦ class1
Актомиозшювый цитоскелет - механическая основа движения клеток
Координация и регуляция движения клеток осуществляются благодаря обширной внутриклеточной системе филаментарных структур, образующих цитоскелет. Гладкомытпечыые (ГМК) и немышечные клетки содержат четыре типа таких структур: «тонкие» актиновые филаменты (7 - 9,5 им в диаметре), «толстые» миозиыовые филаменты (15 - 17 им в диаметре), промежуточные филаменты (10 - 12 нм) и микротрубочки (25 нм).
Структурная организация компонентов цитоскелета во многом определяет движение клетки. У ГМК в этих процессах участвуют миофиламенты - комплексы белковых полимеров, сформированные параллельно расположенными филаментами актина и миозина. Как правило, в состав актиновых филаментов входит также белок тропомиозин, и эти структуры закрепленкы под углом к мембране клетки через плотные тельца, содержащие белок а-актинин. Плотные тельца также контактируют с системой промежуточных филаментов, связывающих миофиламенты в единую сеть (Bagby, 1983). Подобная организация структуры цитоскелста обеспечивает вектор сокращения гладкомышечных клеток, поляризацию и направленность движения немышечных клеток. В последнем случае цитоскслетная система более динамична, что делает возможным протекание двигательных процессов, сопровождающихся постоянной перестройкой элементов сократительного аппарата, изменение направления и скорости движения отдельных клеток.
Ультраструктура миозиновых филаментов II гладких мышц
В отличие от немышечноых клеток, в гладкой мышце миозин II типа находится преимущественно в филаментарном состоянии (см. рис. 2). Толстые филаменты гладкомышечного миозина представляют собой полимерные структуры с краевой полярностью. Головки молекул миозина располагаются с периодичностью 14-15 нм вдоль длины целого филамента (Small, 1977, Cooke et al, 1987, Sellers, 1991). Длина филаментов гладкомышечного миозина, определенная экспериментально в нескольких исследованиях, варьирует от 1.6 до 8 мкм (Ashton et al, 1975, Small et al, 1990). Сократительные филаменты актомиозина располагаются параллельно друг другу и закреплены на поверхности клеточной мембраны. Несмотря на длительную историю изучения вопроса, данные о пространственной ориентации сократительных филаментов в ГМК достаточно противоречивы. Начальные исследования структурной организации гладкомышечного актомиозина проводились на изолированных ГМК и выявили, что миофилафенты ориентированы перпендикулярно к продольной оси клетки (Rothenbluth, 1965, Fay and Delise, 1973 и Fisher and Bagby, 1977). Однако, Kuo и соавторы продемонстрировали, с помощью метода электронной микроскопии, что в интактной предсокращенной гладкомышечной ткани трахеи свиньи сокрагительные филаменты располагаются параллельно по отношению к продольной оси клетки (Kuo et al, 2003). Аналогичная геометрическая ориентация сократительных филаментов была обнаружена в случае taenia coli морской свинки (Gabella, 1977). По результатам этих исследований Kuo et al была сформулирована гипотеза о том. чго ГМК в ткани взаимодействуют с образованием механического синцития, в котором миофиламенты располагаются параллельно друг другу и формируют единую сократительную актомиозиновую систему, которая реагирует на стимуляцию агонистами. Недавно было показано, что взаимодействие миофиламентов с другими элементами цитоскелста (промежуточные филаменты и микротрубочки) является динамическим (Gunst and Fredberg, 2003). Это частично может объяснять перпендикулярную ориентацию миофиламентов в изолированных ГМК, обнаруженную ранее.
До недавнего времени, было принято считать, что миозин II в гладкой мускулатуре постоянно существует в полимерном состоянии. Однако, исследования последних лет показали, что полимеризация/деполимеризация миозиновых филаментов сопровождает растяжение или укорочение гладких мышц в условиях различных адаптационных процессов. В частности, адаптивное укорочение гладких мыши дыхательных путей происходит при астме (King et al, 1999, Herrera ct al, 2005, Seow et al, 2005).
Двигательные реакции в миграции немышечных клеток
Клеточная миграция играет важную роль в сердечно-сосудистой патобиологии (образование атеросклеротических бляшек, рсмодслироваоие стенок поврежденных сосудов, трансплантологическая васкулопатия) (Diez Huan and Andres, ), развитии раковых опухолей, репарации тканей, иммунном ответе и эмбриогенезе (цит. по Ridley et al, ). Миграция клетки представляет собой комплексный, многостадийный процесс, в котором важную роль играют перестройки актинового и миозииового компонентов цитоскелета (Lauffenburger and Horwitz, , Mitchison and Cramer, . Ridley, ). По последним данным в клеточной миграции могут также участвовав микротрубочки (Small et al, ). Выделяют четыре условные стадии миграции клеток, а именно образование протрузий, адгезия, сокращение тела клетки и ретракция хвостовой части (Lauffenburger and Horwitz, , Mitchison and Cramer, , Ridley, ).
На первом этапе миграции клетка образует выпячивание (протрузию) клеточной мембраны, ориентированное по направлению движения. Морфологически выделяют два псевдоподиальных типа протрузий - филоподии (тонкий пальцеобразный вырост) и ламеллоподии (широкое листообразное образование) (Lauffenburger and Horwitz, , Small ct al, ). Структурно, эти образования состоят из лидирующего края (пограничной зоны, непосредственно примыкающей к плазматической мембране) и ламеллы (внутренней части выроста, отделяющей лидирующий край от тела клетки). На лидирующем краю происходит интенсивная полимеризация и деполимеризация актина, и формирование первичных фокальных адгезии. Эти структуры крайне динамичны и легко разбираются, если физически не ассоциируют с концами актиновых пучков, формирующихся в ламелле, а вместо этого контактируют с концами активно растущих в эту зону микротрубочек (Small et al, ). В ламелле происходит ассоциация актиновых пучков в актомиозиновые стресс-фибриллы при активном участии миозина II (Verkhovsky andBorisy, , Verkhovsky ct al, ).
На втором этапе миграции происходит формирование фокальных комплексов на лидирующем крае, связывающих актиновый цитоскелет с трансмембранными рецепторами внеклеточного матрикса (Nobes and Hall, , Fukata et al, , Laudanna et al, ). Этот процесс находится под контролем Rac и Cdc , которые запускают сигнальные каскады, одновременно приводящие к полимеризации актина и сборке предшественников трансмембранных рецепторов (Gumbiner, ). Миозин II также необходим на этой стадии адгезии, поскольку окончательное формирование взаимосвязи между питоскелетом и внеклеточным матриксом требует затрат энергии (Bershadsky et al, ). Фокальные комплексы, образующиеся в переферичсской зоне клеток, также нестабильны и могут, разбираться, если не трансформируются в более постоянные и зрелые структуры - фокальные контакты (Rottner et al, ). В состав фокальных контактов входят гетеродимерные рецепторы семейства интегринов, тирозииовые киназы Src и киназа фокальных контактов (FAK), а также группа цитоскелетных белков, к которым относятся випкулип, талин и а-актинин (Parsons et al. , Geiger et al, ).
Именно последние нужны для соединения цитоскелета с мембранными структурами, а созревание фокальных комплексов в фокальные контакты и далее в прочные интеїриновьіе контакты зависит от механической нагрузки, возникающей при сокращении цитоскелета и участии миозина II (Small et al, . Bershadsky el al, ).
Следующий этап миграции заключается в актомиозин-зависимом перемещении тела клетки в направлении выпячивания за счет актомиозин-зависимого сокращения стресс-фибрилл - иглообразных пучков актиновых филаментов, структурированных миозином II, тропомиозином и а-актинином (Katoh et al, ). Морфологически это выглядит как «перетаскивание» основного тела клетки, что имеет специальный термин в англоязычной литературе - traction. Этот процесс требует миозинового мотора клетки и может по-разному регулироваться в передней и задней части клетки (Chew et al., ). К настоящему времени стало ясно, что два главных двигательных процесса, такие как протрузия и сократимость - в высшей степени координированы в клетке, но протекают независимо друг от друга и используют различные механизмы для генерации соответствующих сил - актин- и актомиозип-зависимый, соответственно.
Для регистрации сократительных параметров клеток была разработана модель сокращения клеток в коллагеновом матриксе. При этом подходе фибробласш или другие клетки культивируют в трехмерном матриксе, сформированным коллагеном, что обеспечивает фиксацию клеток. Коллагеновые тяжи с клетками прикрепляют к тензодатчику и измеряют изометрическое сокращение клеток в ответ на стимуляцию агонистами или сывороткой. Таким способом можно определить среднюю силу сокращения индивидуальной клетки (Obara et al, , Grinnell et al, ).
class4 СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА БЕЛКА KRP (ТЕЛОКИНА) class4 42
Структура KRP
Белок KRP (Kinase Related Protein, телокин) представляет собой независимо экспрессирующийся С-концевой домен киназы легких цепей миозина (Gallagher and Herring, 1991). Нуклеотидная последовательность, кодирующая белок KRP, находится внутри генетического локуса КЛЦМ. а его промотор расположен в одном из иытронов гена КЛЦМ, Первичная структура белковой молекулы KRP полностью соогвегствует последовательности С-концсвого домена КЛЦМ и включает 157 аминокислотных остатков. Изоэлектрическая точка KRP составляет 4.3 (Vorotnikov, 1997. Хапчаев и др.. 2003).
Характеристика скинированных препаратов гладких мыщц taenia caeci
Поскольку в гладких мышцах фосфорилирование РЛЦ миозина необходимо в основном для активации его моторной функции и практически не влияет на его структурную организацию, эта система является наиболее простой для исследования эффектов KRP. В литературе KRP рассматривают как негативный регулятор фосфорилироваыия РЛЦ миозина и сокращения (Silver et al, 1997, Wu et al, 1998, Walker et al, 2001, Choudhury et al, 2004, Sobiezhek et al, 2004, Щербакова, 2006). Однако механизм действия этого белка в гладкой мускулатуре полностью не ясен. В частности, не известно, связано ли действие KRP с ингибированием реакции фосфорилирования миозина или активацией его дефосфорилирования. В связи с этим, первая часть настоящей работы была посвящена исследованию влияния KRP на фосфорилирование РЛЦ миозина и сократимость гладких мышц и выяснению механизма функционирования этого белка в присутствии и в отсутствие ионов Са +.
