Введение к работе
Актуальность проблемы. Фермент - это "работающий" белок, и поэтому наиболее адекватным и информативным методом исследования является кинетический; анализ ферментативного катализа. В течение нескольких десятилетий этот метод развивался, совершенствовался и успешно применялся в сравнительной энзи-мологии холинэсгераз (ХЭ), что нашло отражение в работах А.П.Вресткина и его школы (1997). Как и для любого фермента, наиболее важной характеристикой каталитических свойств ХЭ является их субстратная специфичность. В классическом варианте это зависимость скорости ферментативного гидролиза от структуры субстрата. Однако понятие субстратной специфичности нельзя ограничить только структурным аспектом. Роль субстрата важна в процессе обратимого торможения ониевыми эффекторами, в реакции необратимого угнетения ХЭ в присутствии субстрата ("защитный эффект субстрата"). Такое расширительное представление субстратной специфичности должно быть особенно актуальным и информативным в сравнительно-энзимологи-ческих исследованиях.
Цель исследования:
Провести кинетический анализ различных аспектов субстратной специфичности холинэстераз ряда дальневосточных кальмаров из семейств Onmastrephidae и Gonatldae.
Задачи исследования:
Провести систематическое изучение структурного аспекта субстратной специфичности холинэстераз дальневосточных кальмаров.
Исследовать влияние природа фермента (в том числе холинэстеразы тихоокенанского кальмара Todarodes pactficus), а также структуры субстратов и фосфорорганических ингибиторов на кинетику "защитного эффекта субстрата" (снижение эффективности ингибиторов в присутствии субстратов).
Исследовать влияние структуры субстратов на кинетический механизм обратимого торможения холинэстераз разных животных (в том числе холинэстераз дальневосточных кальмароз) под действием ряда ониевых ингибиторов.
Основные положення, выносите на защиту.
1. На основании сопоставления кинетических параметров
ферментативного гидролиза 18-ти различных по структуре субстратов холинэстераза тихоокеанского кальмара Todarodes ра-clftcus не монет быть однозначно классифицирована ни как ацетилгидролаза ацетилхолина (НФ 3.1.1.7), никак ацилгйдро-лаза ацилхолинов (Ш 3.1.1.8).
При сравнении кинетических параметров ферментативного гидролиза тиохолиновых субстратов холинэстераз кальмаров 5-ти видов семейства Gonatidae выявлены как количественные, так и качественные различия.
Сравнение кинетических параметров, рассчитанных на основании уравнения Бресткина при кинетическом анализе анти-холинэстеразного действия разных фосфорорганическкх ингибиторов в присутствии различных субстратов ("защитного эффекта субстрата"), выявляет существенную роль природы фермента (в том числе холинэсгеразы тихоокеанского кальмара Todarodes pactflcus), а такке структуры субстратов и ингибиторов.
Количественные и качественные различия в кинетическом механизме обратимого торможения холинэстераз разных животных (в том числе ферментов дальневосточных кальмаров) наблюдаются при использовании различных но структуре субстратов.
Научная новизна исследований.
Впервые предложена расширенная концепция субстратной специфичности холинэстераз, включавдая наряду с влиянием строения субстрата на ферментативную активность также важную роль структуры субстрата в реализации кинетических механизмов обратимого антихолинэстеразного действия ониевых ингибиторов и "защитного аффекта субстрата" при необратимом угнетении фосфорорганическими ингибиторами в присутствии субстратов.
Впервые эта концепция.рассмотрена для холинэстераз разных хивотннх, в том числе для ряда дальневосточных кальмаров из семейств Omastreptildae и Gonat idae.
Впервые изучен механизм обратимого антихолинэстеразного действия специально синтезированной группы производных бенз-имидазолия с делокализованным зарядом в катионной группировке молекулы ингибитора и влияния на этот процесс природы фермента и структуры субстрата.
Теоретическое и практическое значение работы. Развивае-
ще в работе представления о многогранности понятия субстратной специфичности холинэстераз являются существенным вкладом в сравнигельно-энзимологические исследования ферментов животных, стоящих на разных уровнях эволюционного развития.
Обнаруженные межвидовые различия в субстратной специфичности холинэстераз 5-ти видов кальмаров семейства Gonatidae, включающие промысловые виды, являются важными практическими рекомендациями при использовании энзимологического способа определения таксономической принадлежности океанических головоногих моллюсков.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на ХШП Международном Конгрессе физиологических наук (Санкт-Петербург, 1997 г.), на И Международном Симпозиуме по сравнительной электрокардиологии (Сыктывкар, 1997 г.), на оСщеинститутских конкурсах молодых ученых (1998, 1999 гг.), на заседании отдела эволюции медиаторных структур ИЭФиБ.
Публикации. Основные результаты диссертации отражены в 6-ти статьях и 2-х тезисах.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, выводов и библиографии, включающей 190 наименований. Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста, иллюстрирована 2-мя рисунками и 19-тьга таблицами.
