Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Роль гистоноподобного белка HLp в процессе образования и реактивации покоящихся форм Mycobacterium smegmatis Анучин, Алексей Максимович

Роль гистоноподобного белка HLp в процессе образования и реактивации покоящихся форм Mycobacterium smegmatis
<
Роль гистоноподобного белка HLp в процессе образования и реактивации покоящихся форм Mycobacterium smegmatis Роль гистоноподобного белка HLp в процессе образования и реактивации покоящихся форм Mycobacterium smegmatis Роль гистоноподобного белка HLp в процессе образования и реактивации покоящихся форм Mycobacterium smegmatis Роль гистоноподобного белка HLp в процессе образования и реактивации покоящихся форм Mycobacterium smegmatis Роль гистоноподобного белка HLp в процессе образования и реактивации покоящихся форм Mycobacterium smegmatis
>

Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - 240 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Анучин, Алексей Максимович. Роль гистоноподобного белка HLp в процессе образования и реактивации покоящихся форм Mycobacterium smegmatis : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.04 / Анучин Алексей Максимович; [Место защиты: Ин-т биоорган. химии].- Москва, 2010.- 114 с.: ил. РГБ ОД, 61 11-3/158

Введение к работе

Актуальность темы. Микобактерий являются значимой группой микроорганизмов, поскольку включают таких возбудителей инфекционных заболеваний как туберкулез и лепра. По данным ВОЗ, каждый третий человек является носителем латентного туберкулеза, который может переходить в активное состояние, вызывая инфекцию. При этом механизмы возникновения таких латентных форм и пути их реактивации остаются неизвестными. И хотя вовлеченность специализированных покоящихся клеток микобактерий в явление латентного туберкулеза интенсивно обсуждается на протяжении многих лет, вопрос существования таких клеток in vivo остается открытым.

Изучение покоящихся форм микобактерий имеет длительную историю. Согласно работам Хоменко [Khomenko, 1984], имеется большая вероятность того, что в тканях и органах инфицированных животных находятся покоящиеся морфологически дифференцированные формы Mycobacterium tuberculosis. Однако, ни в одной из экспериментальных моделей in vitro, существующих на сегодняшний день, не было продемонстрировано образование подобных форм. Это свидетельствует о, возможно, неглубоком уровне покоя, развиваемого в данных моделях, поэтому они вряд ли могут служить адекватным отражением процессов происходящих in vivo в тканях инфицированных людей. Поэтому экспериментальное доказательство возможности образования морфологически дифференцированных покоящихся форм микобактерий in vitro являлось бы существенным вкладом в решение обсуждаемой проблемы.

При изучении существующих на настоящее время моделей покоя был накоплен большой материал, свидетельствующий о том, что образование покоящихся форм микобактерий, - сложный процесс, включающий множество «игроков», таких, как «гены покоя», соответствующие белки, регуляторные факторы, ферменты, структурные элементы клетки и. т. д. Поскольку, очевидно, переход в покоящееся состояние сопровождается глобальной перестройкой клеточного метаболизма, можно ожидать участие в этом процессе глобальных регуляторов. Одним из таких регуляторов является семейство ДНК-связывающих белков (гистоноподобные белки), вызывающих изменение архитектуры нуклеоида и регулирующие активность тех или иных оперонов. У микобактерий таким гистоноподобным белком является Нір. Ряд авторов предполагает, что гистоноподобный белок Нір принимает участие в стрессовом ответе микобактерий [Shires, 2001]. Имеются также данные о том, что при переходе М. smegmatis в покоящееся (нерепликативное) состояние в микроаэрофильных условиях (модель Wayne) происходит пятикратное увеличение концентрации Нір в клетках [Lee, 1998]. Однако, очень странным оказался факт, что инактивация гена Ыр не приводила к каким-либо изменениям в образовании

нерепликативных форм, которые фенотипически не отличались от покоящихся форм дикого типа. Этот факт оставляет открытым вопрос о значимости гистоноподобных белков в образовании покоящихся форм и требует дальнейшего изучения.

На основании изложенных данных были сформулированы следующие цели и задачи.

Цели работы - экспериментально доказать образование морфологически дифференцированных форм микобактерий in vitro, и изучить роль гистоноподобного белка Нір в процессе образования и реактивации полученных покоящихся форм М. smegmatis.

Задачи исследования:

-скрининг условий культивирования М. smegmatis, при которых происходит образование морфологически дифференцированных покоящихся форм.

-сравнительное изучение мутантных клеток М. smegmatis с инактивированным геном Ыр с клетками дикого типа при переходе в покоящееся состояние и образованных в результате такого перехода покоящихся форм.

-получение рекомбинантного белка Hip и изучение особенностей его взаимодействия с ДНК.

-изучение продукта немевалонатного пути синтеза изопреноидов (МЭЦ), как возможного регулятора связывания Hip и ДНК.

Научная новизна работы. В настоящей работе впервые обнаружено образование морфологически дифференцированных форм микобактерий in vitro на примере М. smegmatis при культивировании в неоптимальных условиях (недостаток азота и пониженная температура). Такие формы обладали повышенной устойчивостью к действию стрессовых факторов (антибиотики, нагревание, коротковолновое излучение), а также были способны сохранять жизнеспособность в течение длительного времени (более 5 месяцев), что позволяет отнести их к покоящимся формам. Глубокие морфологические изменения клеточной стенки и реорганизация цитоплазмы, позволяют отнести полученные формы к цистоподобным клеткам, характерных для других неспорообразующих бактерий.

Впервые было обнаружено, что гистонопобный белок Hip определяет обратимость перехода клеток М. smegmatis из некультивируемого состояния в активное состояние, что проявляется в неспособности штамма с инактивированным геном Ыр к реактивации в присутствии белка Rpf (resuscitation promoting factor). Однако Hip не влияет на инициацию перехода клеток в покоящееся состояние.

В ходе настоящей работы впервые была показана значимость гистоноподобного белка Нір для обеспечения устойчивости полученных покоящихся форм М. smegmatis. Гистоноподобный белок Hip участвует в компактизации нуклеоида в процессе перехода М. smegmatis в покоящееся состояние. По-видимому, повышенная устойчивость покоящихся

форм обусловлена такой компактизацией нуклеоида. Одним из регуляторов связывания гистоноподобного белка Hip с ДНК возможно является МЭЦ, который препятствует такому связыванию in vitro.

Практическая значимость работы. В настоящей работе нам впервые удалось продемонстрировать возможность образования морфологически дифференцированных форм микобактерий in vitro. Полученная модель составляет хороший инструмент для изучения механизмов образования покоящихся форм микобактерий, оценки роли генов вовлеченных в процесс перехода микобактерий в латентное состояние. С другой стороны, полученные покоящиеся клетки микобактерий могут быть использованы в качестве тест-системы для анализа эффективности потенциальных лекарственных агентов против латентных форм микобактериозов, таких как туберкулез и лепра.

Полученные данные о роли гистоноподобного белка Нір в процессе образования и реактивации покоящихся форм микобактерий позволяют рассматривать этот белок в качестве потенциальной мишени для лекарственных агентов.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на следующих научных конференциях: 4 съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008; ІСОМШ, Пермь, 2009; 4 международная конференция молодых ученых «От молекулы до биосферы», Харьков, 2009.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 7 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых журналов и изданий ВАК, и 3 тезиса в материалах конференций.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения,

списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста,

содержит рисунков и таблиц.

Список сокращений. МКР - метод конечных разведений МЭЦ -2-С-метил-Б-эритритол-2,4-циклопирофосфат НК - «некультивируемые» формы Hip - histon-like protein MPN - most probable number ROI - reactive oxygen intermediates Rpf- resuscitation promoting factor

Похожие диссертации на Роль гистоноподобного белка HLp в процессе образования и реактивации покоящихся форм Mycobacterium smegmatis