Содержание к диссертации
Введение
CLASS Обзор литератур CLASS ы 7
1.1. Жирные кислоты как таксономические маркеры и их биосинтез в морских организмах
1.2. Изменение состава жирных кислот при акклиматизации к температуре и 10 освещенности
1.3. Состав жирных кислот герматипных кораллов 13
1.4. Передача липидов зооксантеллами кораллу 14
1.5. Роль жирных кислоты в акклиматизации кораллов 15
1.6. Зеленый флуоресцирующий белок 16
1.7. Белки подобные зеленому флуоресцирующему белку 18
1.8. Белки подобные зеленому флуоресцирующему белку в герматипных кораллах 20 2. CLASS Материалы и методы исследования 23 CLASS
2.1. Реактивы и вспомогательные материалы
2.2. Приборы и оборудование 23
2.3. Биологические объекты 23
2.4. Эксперименты 24
2.4.1. Эксперимент по влиянию режима освещения на содержание жирных кислот кораллов
2.4.2. Эксперимент по влиянию режима освещения на интенсивность флуоресценции флуоресцирующих белков
2.5. Аналитические и физико-химические методы 25
2.5.1. Подготовка образцов и разделение клеток зооксантелл и тканей коралла
2.5.2. Методы обработки липидного материала 26
2.5.2.1. Экстракция липидов
2.5.2.2. Приготовление метиловых эфиров жирных кислот 26
2.5.2.3. Газо-жидкостная хроматография и масс спектрометрия метиловых эфиров жирных кислот
2.5.3. Статистический анализ содержания жирных кислот 27
2.5.4. Измерение спектров возбуждения и эмиссии 28
2.5.5. Подготовка образцов и электрофорез 29
2.5.6. Измерение концентрации белка 29
2.5.7. Регистрация спектров эмиссии флуоресцирующих белков кораллов и хлорофилла зооксантелл
2.5.7.1. Исследование продолжительности флуоресценции 30
2.5.7.2. Полипараметрический анализ эмиссионных спектров и индуктивно- 31 резонансного переноса энергии с использованием метода двойной интегральной свертки
3. Результаты и их обсуждение 34
3.1. Состав жирных кислот клеток коралла-хозяина и зооксантелл
3.2. Влияние режима освещения на содержание жирных кислот коралла-хозяина и зооксантелл
3.2.1. Влияние режима освещения на содержание жирных кислот зооксантелл 37
3.2.2. Влияние режима освещения на содержание жирных кислот коралла-хозяина 40
3.3. Влияние режима освещения на интенсивность флуоресценции флуоресцирующих белков
3.4. Выделение флуоресцирующих белков 49
3.4.1. Внешний вид кораллов в видимом и ультрафиолетовом свете
3.4.2. Спектральные характеристики интактных кораллов 51
3.4.3. Электрофорез флуоресцирующих белков 5 2
3.5. Полипараметрический анализ эмиссионных спектров флуоресцирующих белков кораллов и хлорофилла зооксантелл
3.5.1. Полипараметрическое разрешение спектров эмиссии флуоресцирующих белков кораллов и фотосистемы II зооксантелл
3.5.2. Карты спектров возбуждения и эмиссии флуоресцирующих белков кораллов и 60 фотосистемы II зооксантелл
3.5.3. Доказательства индуктивно-резонансного переноса энергии 64
Заключение 70
Выводы 73
Список использованной литературы 74
- Роль жирных кислоты в акклиматизации кораллов
- Аналитические и физико-химические методы
- Выделение флуоресцирующих белков
- Доказательства индуктивно-резонансного переноса энергии
Введение к работе
К рифообразующим или герматипным кораллам (образующие биогермы - биогенные карбонатные постройки) относятся представители типа Coelenterata (кишечнополостные), в основном класса Anthozoa (кораллы), подкласса НехосогаШа (шестилучевые кораллы), отряда Scleractinia (истинные известковые кораллы). Широкое распространение герматипных кораллов в бедных питательными элементами тропических и субтропических водах стало возможным благодаря их симбиотическим взаимоотношениям с одноклеточными микроводорослями из отдела динофлагеллят - зооксантеллами (Титлянов, 1999).
Коралловые рифы, сформированные преимущественно герматипными кораллами, считаются наиболее разнообразными, сложными и продуктивными морскими экосистемами. Вследствие антропогенного воздействия на данный момент коралловые рифы оказались одной из наиболее уязвимых морских экосистем (Brown, 1997). Массовое обесцвечивание кораллов (утрата симбиотических водорослей и/или их пигментов) - один из основных показателей ухудшения состояния коралловых рифов (Van Woesik et al., 2001). Обесцвечивание кораллов происходит вследствие резкого изменения параметров окружающей среды, например, таких как мутность воды, освещенность и температура (Hoegh-Guldberg, 1999). В последние годы уделяется повышенное внимание механизмам акклиматизации - приспособительных изменений - симбиотических герматипных кораллов. Понимание данных процессов позволит предвидеть изменения состояния коралловых рифов в зависимости от меняющихся условий окружающей среды, и, возможно, сыграет свою роль в спасении некоторых из них от разрушения.
Обесцвечивание герматипных кораллов часто бывает обусловлено нарушением фотосинтетического аппарата симбиотических зооксантелл (Hoegh-Guldberg, 1999). При этом функционирование фотосинтетического аппарата в значительной степени зависит от состояния липидного матрикса тилакоидных мембран симбиотических микроводорослей, в которых он локализован. Такая связь между липидами и фотосистемами указывает на возможность регулирования фотосинтеза через изменение состава жирных кислот тилакоидных мембран (Mock, Koon, 2002). Освещенность и температура являются наиболее важными факторами среды, которые влияют не только на фотосинтетические процессы, но косвенно, через трофические взаимоотношения, они оказывают существенное влияние на содержание жирных кислот и коралла-хозяина. Поэтому важно изучать одновременно приспособительные изменения содержания жирных кислот в симбиотических микроводорослях и в коралле-хозяине.
В настоящее время известно ограниченное количество работ по составу жирных кислот в герматипных кораллах (Latyshev et al., 1991; Meyers, 1977; Yamashiro et al., 1999). Однако только в работе Бишопа и Кенрика (Bishop, Kenrick, 1980) был приведен состав жирных кислот симбиотических зооксантелл из рифообразующих кораллов, но в этом исследовании не определяли состав жирных кислот коралла-хозяина. Процессы изменения состава жирных кислот при акклиматизации герматипных кораллов на данный момент не исследованы.
Другой не менее важный механизм акклиматизации герматипных кораллов - это качественное и количественное варьирование содержания флуоресцирующих белков-пигментов коралла-хозяина. Установлено, что степень обесцвечивания симбиотических кораллов в естественной среде коррелирует с содержанием флуоресцирующих белков (Dove et al, 1995; Salih et al., 2001). Существуют две противоположные гипотезы о роли флуоресцирующих белков в жизнедеятельности герматипных кораллов. С одной стороны, эти белки рассматриваются как возможные фотопротекторы эндосимбиотических микроводорослей и тканей коралла-хозяина от излишнего видимого и ультрафиолетового излучения (Salih et al., 2000). С другой стороны, высказывается предположение, что флуоресцирующие белки поглощают свет в коротковолновой области спектра и излучают энергию с большими длинами волн, следовательно, обеспечивая симбиотические зооксантеллы дополнительным светом для фотосинтеза (Schlichter et al., 1994). Таким образом, однозначно роль флуоресцирующих белков в акклиматизации герматипных кораллов к изменениям освещенности не определена.
Целью настоящей работы было изучение состава и динамики жирных кислот и флуоресцирующих белков при акклиматизации симбиотических герматипных кораллов к изменениям освещенности. Для этого необходимо было решить следующие задачи:
1. Разработать метод разделения симбиотического сообщества «коралл-зооксантеллы» Montipora digitata на клетки зооксантелл и ткани коралла-хозяина.
2. Провести анализ и сравнить составы жирных кислот в тканях коралла-хозяина и в симбиотических микроводорослях в процессе акклиматизации у симбиотических кораллов, находящихся в различных условиях освещенности.
3. Исследовать состав и интенсивность флуоресценции флуоресцирующих белков кораллов при заданных режимах освещенности.
4. Определить спектральные характеристики и некоторые биохимические свойства флуоресцирующих белков из герматипных кораллов. Провести полипараметрический анализ с пикосекундным разрешением флуоресцентных спектров эмиссии флуоресцирующих белков и фотосинтетических пигментов зооксантелл в тканях кораллов in vivo.
5. Изучить индуктивно-резонансный ФерстеровскиЙ перенос энергии между флуоресцирующими белками герматипных кораллов.
Роль жирных кислоты в акклиматизации кораллов
В последнее время много внимания уделялось ответной реакции симбиотических рифообразующих кораллов на изменение уровень освещенности и температуры окружающей среды, которые во многих случаях приводят к обесцвечиванию кораллов вследствие утраты симбиотических водорослей и/или их пигментов (Brown, 1997; Hoegh-Guldberg, 1999). При этом мало внимания обращали на изменение состава липидов, в частности на содержание ЖК, которые являются ключевыми структурными компонентами клеточных мембран, принимающих участие в процессах фото- и термоакклиматизации (Harland et al., 1992; LatyshevetaL, 1991).
Еще в 1978 году Meyers предпринял попытку найти связь между составом жирных кислот и глубиной обитания, то есть уровнем освещенности, у кораллов Montastrea annularis и Stephanocoenia michelinii. Однако такой зависимости не было обнаружено. Позднее, Latyshev et al (1991), изучая ЖК коралла Stylophora pistillata, произраставшего на глубинах от 3 до 35 м, обнаружили повышенные концентрации жирных кислот 18:3а 6 и 18:4соЗ у кораллов, собранных с глубин 25 и 35 м. По всей видимости, эти изменения были связаны с уменьшением количества зооксантелл на больших глубинах. При этом данный факт может отражать и ингибирование фотосинтеза зооксантелл. Так, в некоторых одноклеточных водорослях уменьшение скорости фотосинтеза влечет понижение синтеза жирной кислоты 20:5а 3 с одновременным увеличением биосинтеза арахидоновой кислоты (20:4ш6) (Radwan et al., 1988). Значительные изменения состава жирных кислот наблюдали при размещении симбиотических кораллов в полной темноте (Al-Moghrabi et al., 1995). Установлено, что содержание липидов в симбиотических кораллах прямо пропорционально интенсивности света, доступного для обеспечения фотосинтеза в симбиотических водорослях (Harland et aL, 1992; Kellog, Patton, 1983; Patton, Burries, 1983; Stimson, 1987). На данный момент влияние изменений факторов окружающей среды на состав ЖК кораллов вполне доказано, но нет точных сведений какие физиологические функции нарушаются в результате сдвига их содержания в клетках микроводорослей и собственно коралла. При этом все работы проведены без разделения симбиотических водорослей и коралла-хозяина, что не позволяет сделать заключение о роли каждого из симбионтов в процессе акклиматизации.
Зеленый флуоресцирующий белок (ЗФБ) открыли Shimomura et al. (1962) как дополнительный белок к известному хемолюминесцентному белку экворину из биолюминесцентной медузы Aeguorea victoria. Впоследствии оказалось, что аналогичный ЗФБ присутствует у десятков видов других кишечнополостных животных: колониальных гидроидных (Obelia longissima, O.geniculata, Clytia sp. и др.) и морских перьев (Renilla muelleri, R.reniformis, Ptilosarcus sp., Stylatula elonga, Acanthophtilum gracile и т.д.) (Лабас и др., 2003). У всех перечисленных животных ЗФБ переводит голубую эмиссию экворина в зеленый свет (Johnson et al. 1962). Morin и Hastings (1977) первыми выдвинули предположение о нерадиационной миграции энергии с экворина в качестве механизма возбуждения ЗФБ. Если облучить ЗФБ синим или ближним ультрафиолетовым светом (в спектре возбуждения максимум 395 нм, второй пик - 475 нм), он излучает зеленый свет с максимумом 508 нм. Установлена аминокислотная последовательность зеленого флуоресцирующего белка (молекулярный вес 28 кДа), состоящего из 238 аминокислотных остатков. Квантовый выход флуоресценции ЗФБ примерно равен 0,8 (Лабас и др., 2003). Несмотря на то, что ЗФБ впервые получили в кристаллическом виде в 1974 году (Morise et al., 1974), его структуру удалось установить только в 1996 году независимо сразу двум группам ученых - Ormo et al. (1996) и Yang et al. (1996). ЗФБ представляет собой цилиндр или "бочку", образованную одиннадцатью р-складками, при этом крышка, дно и связки с хромофором представлены а-спиральными участками белковой молекулы. Хромофор прикреплен при помощи а-спиральных участков и расположен практически в центре "бочки" (рис. 2).
Рис. 2. Структура ЗФБ (Ormo et al., 1996).
Спектр возбуждения ЗФБ изменяет свои характеристики в зависимости от концентрации белка. Установлено, что ЗФБ — димерный белок. Пептидные цепи ЗФБ скручиваются эффективно как при комнатной температуре, так и при пониженной температуре, тогда как увеличение температуры приводит к резкому снижению эффективности скручивания (Kaether, Gerdes, 1995). Абсорбция хромофором в видимой области спектра представлена двумя широкими полосами с максимумами при 395 и 475 нм. Несмотря на то, что эти две полосы могли бы соответствовать переходам из состояния покоя в первое и второе синглетное состояния возбуждения одного и того же хромофора, их соотношение зависит от таких условий как рН, температура и ионная сила (Ward et al., 1982).
Значительный интерес к зеленым флуоресцирующим белкам появился после того, как Prasher et al. (1992) клонировали ген зеленого флуоресцирующего белка, a Chalfie et al. (1994) и Inouye и Tsuji (1994) показали, что экспрессия гена этого белка в других организмах вызывает флуоресценцию. Уникальная особенность ЗФБ заключаются в том, что он, в отличие от всех других известных окрашенных и флуоресцирующих белков (хромопротеидов: фикобиллинов, фикоэритринов и каротинопротеинов), для обретения оптических свойств не нуждается в какой-либо внешней хромофорной группе, а поэтому может быть использован в генной инженерии. Детектируемая флуоресценция появляется через полтора часа после окончания синтеза молекулы белка и достигает максимума в течение нескольких часов. При "созревании" в пептидной цепи белка образуется р-гидроксибензилиден-имидазолиновое кольцо из трех аминокислотных остатков: серина-65, тирозина-66 и глицина-67, являющихся основой хромофорной группы. В ходе такой реакции тирозин-66 автокаталитически дегидрируется и окисляется молекулярным кислородом. Не вошедшая в состав хромофора часть пептидной цепи белка скручивается в подобие бочки или клетки, внутри которой помещается хромофор (Matz et al., 1999).
Зеленые флуоресцирующие белки стали мощным инструментом, используемым в качестве молекулярной метки и показателя генной экспрессии (Cubitt et aL 1995; Tsien, 1998). Первым начали применять ген ЗФБ из Aequorea victoria, вводя его мРНК в клетки или соединяя ген ЗФБ с генами других белков. С помощью флуоресцентной микроскопии можно идентифицировать место и содержание рекомбинантных белков. В качестве молекулярных меток ЗФБ применяют для изучения внутриклеточной локализации белков, к которым ЗФБ прикреплен. Возможность использования ЗФБ как индикатора локализации белков расширяется тем, что флуоресценция ЗФБ изменяется после трансляции благодаря изменению химического состава внутри клеток (Tsien, 1998). С помощью ФБ возможно проследить рост клеточных линий, например патогенных бактерий и раковых опухолей. Удается также судить о накоплении в подопытном организме разных вирусов, в том числе тех, которые содержат не ДНК, а РНК, т.е. ретровирусов, например иммунодефицита человека (Лабас и др., 2003). Однако появилась необходимость использовать маркеры различной окраски, чтобы в одном опыте помечать флуоресцентными метками сразу несколько белков. Попытки добиться этого путем мутагенеза гена ЗФБ, пересаженного в кишечную палочку, имели весьма ограниченный эффект. От исходного дикого типа с максимумом свечения при 508 нм получен слабосветящийся "голубой" мутант с максимумом при 440 нм, а также "красный" мутант с максимумом при 526 нм, где флуоресценция все равно зеленая (Лабас и др., 2003). Открытие ЗФБ-подобных белков дало возможность получить разноцветные ФБ, что значительно расширило возможности использования ФБ в качестве маркера в молекулярной биологии и биотехнологии.
Аналитические и физико-химические методы
Замороженные ветви коралла Montipora digitata промывали в фильтрованной (0,45 мкм) морской воде, ткани кораллов освобождали от скелета при помощи тонкой струи воды «Water Рік» по методу Johannes и Wiebe (1970) и гомогенизировали. Площадь поверхности каждой ветви коралла определяли по методу Marsh (1970). Объем конечного гомогената измеряли и брали аликвоту для исследования зооксаителл. Количество зооксаителл подсчитывали под микроскопом (х 400) при помощи гемоцитометра (камеры Горяева), число повторностей 5. Плотность заселения зооксаителл рассчитывали на сантиметр площади поверхности коралла, при этом плотность деградирующих зооксаителл подсчитывали в соответствии с Titlyanov et al. (1996), основываясь на изменениях цвета, размера и структуры поверхности зооксаителл.
Гомогенат тканей кораллов с интактными зооксантеллами (160 мл) разделяли центрифугированием (650 g, 5 мин) на супернатант, содержащую ткани коралла, и осадок, содержащий зооксантеллы. Фракцию с тканями коралла вновь центрифугировали (650 g, 5 мин) и отделяли супернатант. Эта процедура была проведена шесть раз, чтобы удалить оставшиеся зооксантеллы. После третьего центрифугирования жидкость была прозрачной, и коричневатый осадок из симбиотических водорослей отсутствовал. Микроскопические наблюдения (х 40) не подтвердили наличие зооксаителл во фракции тканей коралла Сразу после очистки ткани коралла-хозяина (20 мл) использовали для экстракции липидов.
Осадок, содержащий зооксантеллы, ресуспендировали в фильтрованной морской воде и фильтровали через 71 мкм и 20 мкм нейлоновые планктоновые сеточки (SEFAR INC., Швейцария), чтобы удалить крупные обломки скелета коралла и крупные конгломераты ткани (Muller-Parker et al, 1994). После этого зооксантеллы три раза промывали фильтрованной морской водой, центрифугировали и удаляли надосадочную жидкость. В дополнение для улучшения очистки зооксаителл использовали методику разделения в градиенте сахарозы (Ikehara et al., 1981). Ресуспендированные зооксантеллы размещали над градиентом сахарозы, приготовленном на фильтрованной морской воде, (2,0,1,5,1,0 и 0,5 М) и центрифугировали (320 g, 2 мин). Большая часть зооксаителл накапливалась в 1,0 М сахарозном слое, в то время как более легкие фрагменты остатков ткани коралла оставались в 0,5 М слое, а крупные конгломераты оседали в градиенте плотности до слоев 1,5 и 2,0 М. Слой сахарозы, содержащий зооксантеллы, аккуратно собирали при помощи пипетки Пастера, добавляли фильтрованную морскую воду и 3 раза переосаждали центрифугированием. Зооксантеллы ресуспендировали в фильтрованной морской воде, и их чистоту проверяли микроскопически (рис. 3). Один мл ресуспендированных зооксантелл фильтровали через фильтр GF/D (Whatman) и использовали для экстракции липидов. мкм Рис. 3. Зооксантеллы, выделенные из коралла Montipora digitata.
Липиды зооксантелл и коралла-хозяина экстрагировали по модифицированному методу Блая и Даера (Bligh, Dyer, 1959). Образцы зооксантелл экстрагировали 20 мин при помощи ультразвукового диспергатора в смеси дистиллированная вода:метанол:хлороформ (1:2:1 v/v, 20 мл). Ткани коралла экстрагировали путем добавления метанола и хлороформа (1:1 v/v, 10 мл) в суспензию тканей коралла и морской воды (20 мл). Анализ ЖК фильтрованной морской воды не выявил в ней липидов, что дает основание считать, что использование фильтрованной морской воды не привело к изменениям результатов анализа образцов. Расслоение фаз улучшали центрифугированием (650 g, 5 мин). Процедуру экстракции проводили два раза. Экстракты объединяли и упаривали досуха на роторном испарителе.
В экстракты добавляли 2 мл метанола и 1 мл NaOH (2М) и кипятили с обратным холодильником в течение 2 ч. Затем к пробе добавляли 0,8 мл соляной кислоты (37,5 %). Пробу охлаждали, добавляли 2 мл хлороформа и центрифугировали (650 g, 5 мин) для полного расслоения фаз. Слой хлороформа отбирали и экстракцию повторяли. Экстракты объединяли и упаривали досуха под струей азота. Затем к экстрактам добавили 1 мл 14% ВРз-метанола и метилировали кипячением с обратным холодильником в течение 10 минут. Метиловые эфиры ЖК экстрагировали хлороформом 1 мл, добавляли 1 мл дистиллированной воды, центрифугировали (650 g, 5 мин), удаляли воду и повторяли эту процедуру 2 раза. Метиловые эфиры ЖК в хлороформе с остатками воды помещали в холодильник (- 20 С) и, после замерзания воды, отбирали метиловые эфиры ЖК, растворенные в хлороформе. После упаривания досуха под струей азота метиловые эфиры ЖК взвешивали и растворяли в смеси хлороформгметанол (2:1 v/v).
Метиловые эфиры ЖК очищали от примесей методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ТСХ) (пластинки 10x10 см) в течение 15 мин, используя в качестве элюента смесь гексан:диэтиловый эфир:уксусная кислота (32:8:0,4). От пластинки отрезали 1 см, где был расположен дополнительный образец. Визуализацию зоны метиловых эфиров ЖК на ТСХ проводили, помещая отделенный участок пластинки на 40 секунд в раствор смеси серной и фосфорной кислот в ацетоне с добавлением раствора CUSCM, С последующим нагреванием участка пластинки 1-2 минуты до 80С. После сравнения расположения метиловых эфиров ЖК на отделенном участке с оставшейся пластинкой ТСХ, слой сорбента, содержащий метиловые эфиры ЖК, соскабливали на фильтр скальпелем. Элюирование проводили смесью хлороформ:метанол (2:1) на водяной бане (40С) в течение 60 мин. Пробу охлаждали и хранили в запаянных ампулах при - 20 С.
Метиловые эфиры ЖК, растворенные в гексане, анализировали на газовом хроматографе GC 14В. В качестве газа - носителя применяли гелий, этим же газом осуществляли продувку детектора. Использовали кварцевую капиллярную колонку FFAP (Supelco, США, длина 30 м, внутренний диаметр 0,32 мм и толщина слоя фазы 0,25 мкм) в режиме программирования температуры: изотерма 60С (1 мин), линейный рост 40 С мин"1 до 150 С, затем повышение 3 С мин"1 до 230 С и без изменений в течение 30 мин. Температура инжектора и пламенно-ионизационного детектора была равна 240 С. Идентификацию метиловых эфиров ЖК проводили сравнением их относительного времени удерживания со стандартами. Идентификацию подтверждали при помощи газовой хроматографии-масс спектрометрии на газовом хроматомасс-спектрометре QP-1000EX. Газ-носитель - гелий. Использовали энергию ионизации - 70 eV, температуру ионного источника 280 С. Спектры сканировали в диапазоне масс 50-1000 а.е.м.
При статистической обработке материала применяли /-тест Стьюдента. Различия между среднеарифметическими показателями с р 0,5 % принимались за значимые. Данные тестировали на нормальность и гомогенность, используя тест Shapiro-Wilk s (W) и Levene s тест, соответственно. Поскольку применение метода ANOVA допускает возможность использования данных только с нормальным распределением, некоторые из наших полученных результатов, не подчиняющиеся данному закону, были трансформированы с помощью метода «Box-Сох power», включающего итерационную оптимизацию вида у = х\ При этом были получены следующие значения коэффициента X для ЖК из зооксантелл: 16:0 - 0,936, 16:1 - 1,718, 18:2ю6 - 0,063, 20:4со6 - 0,712, 22:4со6 - 0,365, 22:5юЗ - 0,412 для суммы МНЖК - 1,471. Использовали следующие значения коэффициента X для ЖК из тканей коралла-хозяина: 14:0 - 0,715, 16:00 - 1,998, 18:0 - 0,653, 18:2ю6 - (-1,206), 18:3(о6 - 0,538, 18:4юЗ - 0,676, 20:Зсо6 - 0,694, 20:4 о6 - 0,726, 20:5юЗ - 0,698, 22:4ю6 - 0,758, 22:5соЗ - 0,494, 22:6юЗ - (-1,998) и для суммарного содержания ПНЖК - 0,649. Данные анализировали при помощи одно и двух факторного анализов ANOVA; post-hoc Tukey s honest тест значимых отличий применяли для определения точек различия. В дополнение, ранговый корреляционный анализ по Спирману использовали для определения наличия существенных взаимоотношений между содержанием ЖК и количеством деградирующих зооксантелл.
Выделение флуоресцирующих белков
Образцы четырех видов Acropora, выбранные для исследования, имели различную окраску в видимом свете (Рис. 15а, в, д, ж): Acropora tenuis коричневую, A. aspera желто-зеленую, A. nasuta and A. secale коричневую с голубыми и розовыми кончиками, соответственно. Цвет флуоресценции кораллов под УФ также отличался.
ФБ преобладали на участках с коричневой пигментацией. Тогда как ярко окрашенные голубые и розовые кончики ветвей кораллов A. nasuta и A. secale (Рис. 15в, д) при видимом свете, при УФ освещении проявляли слабую флуоресценцию (Рис. 15г, е). В отдельных случаях ФБ распределены равномерно по всей колонии - A. tenuis (Рис. 156), но в A. aspera интенсивно флюоресцирующие белки сконцентрированы на радиальных кораллитах полипов (Рис. 15з). У A. secale также отмечали тенденцию более интенсивной флюоресценции на кончиках кораллитов.
У интактного коралла Acropora tenuis максимум возбуждения регистрировали при 505 нм, и основной пик эмиссии при 517 нм (Рис. 16а). Максимум возбуждения A. nasuta и А. secale отмечали при 451 и 450 нм, соответственно. У A. nasuta идентифицировали «плечо» при 430 нм, а у A. secale обнаружен дополнительный пик при 502 нм. Спектры эмиссии у этих двух видов были почти идентичны и имели основной пик при 482 и 484 нм, соответственно (Рис. 166, в). Спектральные характеристики A. aspera похожи на таковые у A. tenuis, основное различие заключалось в позиции дополнительных пиков и «плеч» возбуждения и эмиссии (Рис. 16а, г).
Спектры эмиссии исследованных в данной работе видов не идентичны спектрам ни одной группы флуоресцирующих кораллов, ранее описанных Mazel (1995). Спектральные характеристики возбуждения A. nasuta и A. secale сходны, различие выявлено в дополнительных пиках. Их эмиссионные спектры близки к спектрам нескольких других герматипных кораллов, а именно Acropora cervicornis, Meandrina meandrites, Eusmilia fastigata (эмиссия при 487 нм и 517 нм), и Scolymia sp. (эмиссия при 484 нм и 512 нм) (Mazel, 1995). A. nasuta и A. secale отличались от A. tenuis и A. aspera, но проявляли сходные между собой спектральные характеристики.
Полученные нами спектры возбуждения и эмиссии A. aspera, собранном на мелководном рифе, на западном побережье Окинавы в Японии, отличаются от спектральных характеристик кораллов того же вида, собранных на Большом Барьерном Рифе в Австралии, которые, в свою очередь, проявляют значительную вариабельность (Dove et al., 2001). Кораллы одного вида могут иметь разные формы в одном местообитании, более того существуют биогеографические различия кораллов (Veron, 1986). По всей видимости, в нашей работе анализировали A. aspera, не идентичную по окраске образцам, исследованным Dove et al. (2001). При этом нам не известно, на какой стадии развития собирали A. aspera в Австралии, данный фактор, по всей видимости, имеет значительное влияние на содержание ФБ.
Рисунки 4 и 15 показывают, что исследуемые кораллы содержат интенсивно флюоресцирующие белки. Мы предприняли попытку идентифицировать эти белки при помощи неденатурирующего гель электрофореза. Нам не удалось провести такой электрофорез с растворимой бесклеточной фракцией коралла, поскольку эти белки, в особенности зеленые интенсивно флуоресцирующие белки, не разделялись при помощи данного типа электрофореза в стандартных условиях. Мы предположили, что изоэлектрическая точка (pi) этих белков около рН 7, что влечет за собой потерю заряда, необходимого для электрофореза в используемых нами условиях. Действительно, метод изоэлектрической фокусировки (IEF) показал, что pi зеленых интенсивно ФБ составляла 6,9. В связи с невозможностью использовать метод неденатурирующего гель-электрофореза, мы применили додецил сульфит натрия - полиакриламидный гель (ДСН-ПАГ) электрофорез для разделения интенсивно-флуоресцирующих белков.
В растворимых бесклеточных экстрактах A. tenuis, A, nasuta и A. secale наблюдали сходную ярко-зеленую флуоресценцию под УФ, а в экстрактах A. aspera интенсивную оранжевую флуоресценцию. Флуоресценция белков оказалась стабильна в присутствии 0,1 % ДСН, используемого для электрофореза. Стабильность параметров флуоресценции в ДСН позволила нам различать флуоресцирующие полосы на геле под УФ. При помощи ДСН-ПАГ электрофореза выделили одну зеленую полоску флуоресцирующего белка в A. tenuis, А. nasuta и A. secale (Рис. 17). Выявлена желтовато-зеленая окраска флуоресцирующей полосы A. tenuis, в то время как сине-зеленые полосы ФБ получили при анализе A. tenuis и A. nasuta. A. aspera содержала три интенсивно флуоресцирующих белка: два оранжевых (Рис. 17 I и II) и один зеленый (Рис. 17 III), при этом последний имел низкую интенсивность флуоресценции ввиду его низкой концентрации.
Доказательства индуктивно-резонансного переноса энергии
Для изучения индуктивно-резонансного переноса энергии (ИРПЭ) между ФБ был проведен анализ спектральных кинетических последовательностей эмиссии ФБ. Данные соответствуют десяти спектральным контурам, полученным с интервалами 31,25 пС для образцов A. digitifera (Рис. 22а, б), A. nasuta (Рис. 22в, г), а также голубой (Рис. 22д, е) и зеленой формы P. versipora (Рис. 22ж, з). Спектры справа представляют собой разницу между конечными, записанными через 281,25 пС, и всеми предшествующими спектрами и, таким образом, показывают изменение спектральных характеристик ФБ во времени. Анализ разностных спектров свидетельствует о постепенном снижении интенсивности флуоресценции в сине-фиолетовой области спектра и нарастании излучения в сине-зеленой области спектра, ориентировочно за 218-250 пС. Количественно данные процессы характеризуются величиной спектрального сдвига в 5-20 нм при вариации изменения амплитуды от 0,22 до 0,55. После завершения данного процесса не наблюдалось дальнейших спектральных изменений в области ФБ, что предполагает передачу возбуждения конечной группе акцепторов. Рис. 22. Нормализованные спектральные профили и соответствующие разности амплитуд от последовательных соответствующих временных каналов спектров эмиссии ФБ. Данные на рисунках слева соответствуют 10 спектральным профилям, зарегистрированным с интервалами 31,25 пС для образцов Acropora digitifera (а, б), A. nasuta (в, г), а также голубой (д, е) и зеленой (ж, з) Plesiastrea versipora. Разности спектров на рисунках справа рассчитывали как разность между 10-м спектром и соответствующими предыдущими спектрами. Соответствующие спектры справа и слева имеют одинаковую окраску. Ps - пС.
На рисунке 23 показана модель ИРПЭ флуоресцирующего белка A. digitifera, разработанная в соответствии с данными, представленным на рис. 22а, б. Экспериментальные кривые, зарегистрированные на спектрометре, аппроксимировали модельным распределением интенсивности во времени применительно к двум типам ФБ с голубой и зеленой флуоресценцией. При этом ФБ с голубой флуоресценцией рассматривали как донор возбуждения зеленой флуоресценции, которую в свою очередь рассматривали как акцептор. Кинетические профили, построенные в линейном масштабе, на рис. 23а соответствуют завершенному, зависящему от длин волн, интегралу измеренного изображения каждого вида ФБ, общим данным модели и импульсу возбуждения лазера. Нижний рисунок представляет случайно распределенные остаточные ошибки; его задача -показать отсутствие значительного систематического отклонения, указывающего на значительное кинетическое разногласие между данными и моделью. Хорошее описание фактических данных разработанной моделью подтверждается результатами тестов global Durbin- Watson d статистики и Runs теста (Draper, Smith, 1998; Straume, Johnson, 1992).
Рисунок 236 показывает соответствие между спектральным кинетическим контуром модели донора (голубого) и акцептора (зеленого) и реальными данными (пунктирная линия). Быстрое угасание донора, которое проявляет себя как один компонент, становится очевидным, когда представляется в линейном (ненормализованном) масштабе, и переходит в начальное состояние менее чем за 1 не. Полосы, принадлежащие акцептору(ам), проявляют некоторую кинетическую гетерогенность в виде более голубых компонентов, принимающих от донора, а также других более долгоживущих ФБ. Различия компонентов подъема учитывали, позволяя варьирование модели в относительных амплитудах негативных компонентов возбуждения и основного компонента угасания. Рисунок 23в представляет нормализованный вид изображения (пунктирная линия) и модели (окрашенный контур линии), аналогичные показанным на рис. 20в. Из нормализованных (Рис. 23в) и изначальных (Рис. 236) спектральных данных можно сделать вывод, что очевидный спектральный сдвиг достаточно хорошо представлен в модели ИРПЭ. Тем не менее, в силу тенденции обратных амплитудных компонентов гасить друг друга в одинаковой спектральной области, не возможно утверждать, что решения, полученные в модели, являются кинетически уникальными. Несмотря на это, мы приходим к выводу, что данные и модель, при совместном рассмотрении, представляют бесспорное доказательство для ИРПЭ между флуоресцентными белками in vivo. іза-т
Рис. 23. Разрешение во времени спектра эмиссии ФБ Acropora digitifera с моделированием, основанным на ИРПЭ. Рисунок (а) показывает кинетические профили, интегрированные по длинам волн, для общих реальных данных (ромбы), суммарной модели (черная линия), донора (голубая линия) и акцептора (зеленая линия) - компонентов модели, также как и для спектра возбуждения импульса лазера (белая линия) и остаточной ошибки (дополнительная линия внизу). Профиль лазера нормализовали для уравнивания координаты интенсивности пика эмиссии. Рисунок (б) иллюстрирует вид сверху на реальные данные с изображения (пунктирные линии) и компоненты модели — донора (голубая линия) и акцептора (зеленая линия). Данные нормализованы на основе координат пика интенсивности канала времени - длин волн. Рисунок (в) показывает вид сверху на данные (пунктирные линии) и модели ИРПЭ для суммарных данных (белые линии), где каждый временной канал нормализован на основе интенсивности длины волны пика эмиссии. Global Durbin-Watson d 68 статистика для 91-временного канала (448 нм х 622 нм) имела значение 1,85 ±0,195 и global Z-статистика составляла 0,86 ± 0,64.
