Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Состав жирных кислот губок 8
1.1.1. Насыщенные ЖК 9
1.1.2. МоноеновыеЖК 11
1.1.3. Полиеновые ЖК 15
1.1.4. Жирные кислоты с дополнительными функциональными группами 18
1.2. Состав и молекулярные виды фосфолипидов губок 20
1.3. Локализация сверхдлинноцепочечных жирных кислот в клетках губок 22
1.4. Жирные кислоты ассоциированных с губками микроорганизмов 24
1.5. Жирные кислоты и другое органическое вещество, поступающие к губке с пищей 25
1.6. Хемосистематика представителей типа Spongia на основашш состава жирных кислот 27
2. Материалы и методы 29
2.1. Биологические объекты 29
2.2. Реактивы и материалы 31
2.3. Приборы и оборудование 31
2.4. Экстракция общих липидов , 32
2.5. Приготовление производных жирных кислот 32
2.5.1. Метиловые эфирыЖК (МЭЖК) 32
2.5.2. Пирролидиды ЖК 33
2.5.3. Гидрирование МЭЖК 33
2.5.4. Восстановительный гидразинолиз эйкозапентаеновой кислоты 33
2.5.6. Димстилдисульфидные аддукты моносновых МЭЖК 33
2.6. Разделение МЭЖК по степени ненасыщенности на колонке с силикагелем, импрегнированньш нитратом серебра 34
2.7. Выделение индивидуальных МЭЖК методом ВЭЖХ 34
2.8. Тонкослойная хроматография (ТСХ) 35
2.8.1. Получение золя кремневой кислоты 35
2.8.2. Приготовление ТСХ-пластинок на стеклянной подложке 35
2.8.3. Обнаружение веществ на ТСХ-шгастинках 35
2.8.3.1, Неспецифическое обнаружение веществ 35
2.8.3.2. Специфическое обнаружение веществ 35
2.9. Количественное определение содержания фосфолипидов в экстрактах или хроматографических фракциях 36
2.9.1. Рабочие реагенты для количественного определения фосфора .36
2.9.2. Количественное определение содержания фосфолипидов в экстрактах 36
2.9.3. Количественное определение содержания отдельных классов фосфолипидов..36
2.10. Газо-жидкостная хроматография (ГЖХ) 37
2.11. Газо-жидкостная хроматография - масс-спектрометрия (ГЖХ-МС) 37
2.12. Статистика 38
3. Результаты обсуждение 39
3.1. Определение состава фосфолипидов и жирных кислот 39
3.1.1. Содержание общих липидов и состав фосфолипидов 39
3.1.2. Состав жирных кислот (ЖК) 41
3.1.2.1. Насыщенные ЖК . 41
3.1.2.2. МоноеновыеЖК 43
3.1.2.3. ПолиеновыеЖК 44
3.1.3. Идентификация жирных кислот методом масс-спектрометрии 45
3.1.3.1. Пирролидиды насыщенных ЖК 46
3.1.3.2. Пирролиднды моноеновых ЖК 50
3.1.3.3. Пирролидиды полиеновыхЖК 56
3.2.2-Метил-замещенные моноеновые СДЖК из губки Я. panicea 62
3.3. Изомеры эйкозапентаеновой кислоты нз губки В, baciltifera 66
3.4. Ревизия состава ЖК губок, изучавшихся ранее 72
3.4. Зависимость состава ЖК губки Я. panicea от сезона, места сбора и морфологических особенностей 75
3.5. Сравнительная характеристика симбиотических микроорганизмов губок Я. panicea и О. pennata методом маркерных ЖК 79
3.6. Анализ возможности применения состава ЖК для хемосистематики исследованных видов губок класса Demospongiae 81
3.7. Сравнение состава ЖК бореальных и тропических губок 83
Заключение , 87
4. Выводы 88
5. Список литературы 89
6. Приложение 103
- Жирные кислоты с дополнительными функциональными группами
- Жирные кислоты и другое органическое вещество, поступающие к губке с пищей
- Изомеры эйкозапентаеновой кислоты нз губки В, baciltifera
- Сравнение состава ЖК бореальных и тропических губок
Введение к работе
Губки представляют собой очень древнюю группу многоклеточных организмов: их останки были найдены в отложениях нижнего кембрия (около 600 млн. лет назад). Как полагают некоторые исследователи (Brinkman, 1966), уже в кембрийском море существовала довольно богатая фауна губок, представленная почти всеми классами и отрядами, существующими и в современный период. В настоящее время описано приблизительно 5000 видов губок, которые разделяют на три отдельные класса: Hexactinellida (стеклянные губки), Demospongiae и Calcarea (известковые губки) (Hooper, Van Soest, 2002). У всех губок отсутствуют настоящие дифференцированные ткани. Тело губок состоит из двух слоев - эктодермального и эндодермального, между которыми расположен слой особого бесструктурного вещества - мезохил. Нервная система у губок отсутствует (Simpson, 1984). В большинстве случаев в теле губки можно обнаружить многочисленные и разнообразные симбиотические организмы. Симбионты могут занимать до 40% от тканевого объема губки. Они играют важную роль в экологии губок и биотрансформации органического вещества (Wilkinson, 1987).
Актуальность работы. Губки широко распространены в морских и пресноводных экосистемах. Они часто встречаются в массовом количестве, в ряде случаев являются ведущими формами в водных биоценозах (Колтун, 1959; Wilkinson, 1987). Уникальная способность губок адаптироваться к различным экосистемам во многом обусловлена возможностью удовлетворять свои пищевые запросы из разных источников, что является следствием специфической организации этих симбиотических организмов на биохимическом уровне. Роль этих животных в экосистемах велика. В сообществах коралловых рифов губки участвуют в процессах создания первичной продукции (за счет фотосинтезирующих симбионтов), азотфиксации (за счет цианобактериальных симбионтов), а также в процессах нитрификации и деструкции органического вещества.
Губки вызывают к себе огромный интерес у липидологов. Оказалось, что эти животные обладают самым большим среди водных животных разнообразием стеринов, липидов и жирных кислот (ЖК), которые имеют необычные, а иногда и уникальные, структуры. Некоторые необычные липиды обладают биологической активностью (Ciminiello et al., 1991; Ichiba et al., 1995; Fatope et al., 2000; Borbone et al., 2001, Carballeira et al., 2002; Meyer, Guyot, 2002). В настоящее время основными направлениями в области изучения липидов губок являются обнаружение новых компонентов, установление их структуры и путей биосинтеза, изучение их свойств и роли в организме (Carballeira et al., 2002; Barnathan et al., 2003; De Rosa et al., 2003; Dembitsky et al., 2003).
Данные о липидном составе губок позволяют расширить наши представления о многообразии биологических молекул и имеют значение для хемосистематики этой группы животных. ЖК используют как маркеры отдельных групп организмов, например, при изучении структуры микробных сообществ или для исследования пищевых взаимоотношений в экосистемах. Возможность по маркерным ЖК оценить состав и биомассу популяции микроорганизмов, ассоциированных с губкой, определить пищевые предпочтения губок позволяет четче понять роль губок в экологических процессах.
Анализ литературных данных показывает, что наиболее изученными по составу липидов и ЖК являются губки тропических и субтропических областей, тогда как губки из бореальных областей практически не исследованы. Доля губок в биомассе бентоса Охотского, Японского морей и в оз. Байкал достигает значительных величин, и, очевидно, губки играют важную роль в донных биоценозах этих акваторий. Таким образом, получение новых фундаментальных знаний о составе, структуре и биоконверсии липидов и ЖК практически неисследованных холодноводных видов губок является актуальной темой современной биохимии липидов.
Цель работы. Изучение закономерностей распределения и химической структуры липидов и жирных кислот в губках класса Demospongiae, определение их значения как хемосистематических маркеров и маркеров пищевых взаимоотношений.
Задачи исследования.
Определить состав липидов и ЖК в некоторых видах губок класса Demospongiae из Охотского, Японского морей и оз. Байкал.
Провести поиск и установить химическую структуру новых ЖК губок.
Определить зависимость состава ЖК губки Halichondria рапісеа от сезона, места сбора н морфологических особенностей.
Дать сравнительную характеристику симбиотического сообщества губок Н. рапісеа и Ophlitaspongia permata с помощью метода маркерных ЖК.
Определить липидные хемосистематические маркеры для губок семейств MyxiUidae и Acamidae,
Определить различия в составе ЖК между бореальными и тропическими видами губок.
Научная новизна и практическая значимость. Впервые определен состав фосфолипидов и ЖК из 17 видов губок Охотского моря, уточнен и дополнен состав фосфолипидов и ЖК из 4 видов губок Японского моря и оз. Байкал. Впервые в губках обнаружены новые жирные кислоты (13-Ме-1б:0, 14-Ме-17:0, 15-Ме-18:0, 16-Ме-19:0, ai-15:1Д4, Мб:1Д5, 10Д4-Ме2-15:1Д6, 18:1Д6, 18:1Д8, 22:1Д16, 23:Ш5, 15-Ме-24:1Д14, 17-
7 Ме-26:1А16, 28:2Д9,21, 28:ЗД5,9,22). Впервые выделены и охарактеризованы методами масс-спектрометрии, 1Н и 13С ЯМР две новые 2-метил-замещенные сверхдлинноцепочечные ненасыщенные кислоты (2-Ме-24:1Д-17 и 2-Ме-26:1Д-17), а также два уникальных изомера эйкозапентаеновой кислоты. Впервые показано, что главным изомером эйкозапентаеновой кислоты в пресноводной губке В. bacilli/era является кислота 20:5Д5с,8с,1lc,14c,18f. Установлено, что основное влияние на состав ЖК массового вида морской губки Я. panicea оказывает сезон и место обитания. Показано, что в ряде случаев ЖК могут быть использованы для хемосистематики губок на уровне семейств и как маркеры симбионтов губок. Выявлены характерные отличия состава ЖК бореальных видов от тропических видов губок. Результаты работы могут быть использованы для изучения пищевых взаимодействий в сложных экосистемах методом биохимических маркеров.
Апробация полученных результатов. Основные результаты были представлены на Ежегодной научной конференции ИБМ, (Владивосток, 2001), V Региональной конференции по актуальным проблемам экологии, морской биологии и биотехнологии, {Владивосток, 2002), Международной конференции «Marine environment: nature, communication and business» (Владивосток, 2003).
Публикации. Основные результаты исследований, проведенных по теме диссертации, изложены в 8 печатных работах.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы и приложений. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 22 таблиц, 24 рисунков и і 77 литературные ссылки.
Автор выражает признательность сотрудникам ДВО РАН Н.И. Селину и В.Б. Красохнну за помощь в сборе материала и определении видовой принадлежности губок, В.И. Светашеву за помощь в проведении исследований.
Жирные кислоты с дополнительными функциональными группами
Все губки являются гетеротрофными организмами и не могут синтезировать все необходимые им ЖК. Поэтому состав ЖК гетеротрофных организмов, в какой то мере, определяется составом ЖК пищи, и может быть использован для определения пищевых источников (Ederington et all., 1995). Губки являются мощными фильтраторами. Максимальная скорость фильтрации может достигать 60 мл/мин на 1 г сухого веса губки (Riisgard et al., 1993). Сложная фильтрационная система губки с огромной площадью внутренней поверхности приспособлена для извлечения микрочастиц живой и неживой природы из прокачиваемой воды. Размер частиц лимитируется размером пор у губок (10-80 мкм) (Simpson, 1984). Таким образом, пищу губок составляют представители ультрапланктона (меньше 5 мкм) и наннопланктона (от 5 до 50 мкм). Ультрапланктон представлен в большей степени гетеротрофными бактериями, а также автотрофными (фотосинтезирующими и хемосинтезирующими) бактериями. Наннопланктон представлен микроводорослями (фитопланктон) и простейшими (зоопланктон). Диатомовые (Bacillariophyceae), динофлагелляты (Dinophyceae), кокколитофориды (Haptophyceae) и сине-зеленые водоросли (Cyanophyceae) являются основными систематическими группами фитопланктона. Микроводоросли синтезируют полиненасыщенные ЖК, которые затем передаются по пищевой цепи их потребителям. Основные продуценты ЭПК — диатомовые водоросли, ДКГ — жгутиковые водоросли (динофлагелляты, кокколитофориды). Сів полиенов - зеленые и сине-зеленые водоросли. Простейшие представлены фораминиферами, акантоляриями, радиоляриями и титшгадами. Эти организмы, так же как и губка, являются гетеротрофами и используют микроводоросли в качестве пищи. По отношению к ним губка является консументом второго порядка. Однако, мы не располагаем данными исследований, касающихся нанозоопланктона в питании губки. Эффективность извлечения губкой из воды живого фитопланктона и бактерий при фильтрации довольно высокая (70-100%) (Riisgard et al., 1993; Pile et al., 1997), Жирные кислоты, аминокислоты и глюкоза обнаружены в следовых количествах в морской воде и, очевидно, не играют существенной роли в питании губок. Однако, по данным Яхела (Yahel et al., 2003), губки способны поглощать из воды значительную часть иного, нежели жирные кислоты, аминокислоты и глюкоза, растворенного органического вещества (РОВ), и именно РОВ является основным источником углерода у губок. Эти данные о способности губок поглощать РОВ меняют наши представления о незначительной роли губок в круговороте органического вещества в экосистемах, так как основная масса углерода в океане находиться именно в форме растворенного органического вещества. Ранее полагали, что извлекать и использовать РОВ способны только бактерии и личинки некоторых морских беспозвоночных. Механизм удерживания РОВ губками до конца не ясен, но предполагают, что бактерии, ассоциированные с губками, участвуют в этом процессе (Wilkinson, Carrone, 1980; Reiswig, 1990). Для решения спорных вопросов в систематике и филогении губок, наряду с классическими морфологическими методами, широко применяются данные биохимических исследований. Так, например, существует две точки зрения о филогенетических отношениях между тремя классами (Calcarea, Demospongiae и Hexactellida) типа Porifera. Согласно первой, классы Calcarea и Demospongiae близкородственные, и их можно сгруппировать в подтип Cellularia благодаря наличию у них гошакодермального слоя, состоящего из отдельных клеток. Класс Hexactellida имеет синцитиальную организацию, и может быть выделен в отдельный подтип Symplasma (Reiswig, Mackie, 1983; Reitner, Mehl, 1996). Альтернативная точка зрения, что классы Demospongiae и Hexactellida являются близкородственными, основана на схожести личинок и гомологии в химическом составе спнкул у этих двух классов (Boger, 1988). Использование результатов биохимических и молекулярных исследований позволяет найти новые доказательства и расширить наше представление о типе Porifera.
Исследования по распределению метаболитов у большого числа видов губок оказались ценными для решения многих проблем на всех таксономических уровнях типа Porifera. Среди прочих, несколько работ посвящены возможности использования жирных кислот, особенно сверхдлинноцепочечных (СДЖК), в хемотаксономни губок (Bergqist et al, 1984; Lawson et el., 1984; Carballeira et al., 1989; Thiel et al.s 2002).
Одними из первых работ в этой области были работы Личфилда с соавторами (Litchfield et al., 1976), которые изучили 31 вид губок класса Demospongiae. Было установлено процентное содержание и распределение ЖК по длине углеродной цепи, но содержание индивидуальных жирных кислот не определялось. Исследователи обнаружили, что все изученные виды губок содержат необычно высокий уровень Си-Сэо жирных кислот (34-79% от суммы ЖК), Таким образом, был сделан вывод, что СДЖК являются характеристичными для подклассов Tetractinomorpha и Ceractinomorpha класса Demospongiae. Они также показали, что существуют различия в содержании ЖК с различной длиной цепи как между некоторыми отрядами губок, например Poeciloscierida и Halichondrida, так и внутри отрядов.
Берквист и Лоусон с коллегами сравнили ЖК состав у 80-ти видов губок из Новой Зеландии и Австралии (Bergqist et al., 1984; Lawson et al., 1984). Помимо 70 видов, относящихся к 13 отрядам, принадлежащих к классу Demospongiae, впервые были изучены 8 видов относящихся к классу Calcarea и 2 вида - к классу Hexactinellida. Хотя в этих ранних работах содержание индивидуальных ЖК также не определяли, было установлено распределение ЖК по длине углеродной цепи и проведено сравнение относительного содержания отдельных групп ЖК: разветвленных, линейного строения, с четным и нечетным числом атомов углерода, а также ненасыщенных жирных кислот. Было доказано, что не все губки класса Demospongiae имели высокий уровень СДЖК. Так, представители подкласса Homoscleromorpha в отличие от представителей подкцасссш Tetractinomorpha и Ceractinomorpha, имели незначительное содержание (1,5%) СДЖК и отличались по профилю ЖК от других представителей Demospongiae. Подклассы Tetractinomorpha и Ceractinomorpha в целом были близки по содержанию каждой из сравниваемых групп ЖК. В недавней работе Тиела с коллегами (Thiel et al,, 2002) было продолжено изучение профилей жирных кислот губок в контексте с систематикой этих организмов. Было проанализировано 8 представителей класса Demospongiae, б представителей класса Calcarea и 23 представителя класса Hexactmellida. Исследователи пришли к выводу, что на основании состава ЖК губки класса Hexactinellida и класса Demospongiae можно объединить в одну филогенетическую группу. Губки класса Calcarea значительно отличались по своему профилю ЖК от этих двух классов и, следовательно, являются более отдаленными по филогенетическому происхождению.
По мнению цитированных выше исследователей, применение состава ЖК для хемосистематикн губок на более низких систематических уровнях (отряда, рода), было малоинформативным. Очевидно, это связано в первую очередь с тем что, содержание индивидуальных ЖК может сильно варьироваться для некоторых видов. Эти вариации могут носить сезонный и географический характер. Кроме того, для выявления характерных хемотаксономических признаков на уровне семейства или рода необходимо гораздо больше данных о составе ЖК, которые к сожалению отсутствуют в литературе, Обнаружение новых и редких ЖК у различных видов губок, вероятно, может послужить основой для дальнейших хемосистематических построений на низких систематических уровнях.
Жирные кислоты и другое органическое вещество, поступающие к губке с пищей
В таблице 1. (Прил.) приведены наши данные о количестве общих липидов в исследованных видах губок, собранных летом 2003 г. В среднем содержание липидов составило 7,4 мг/г сырого веса или 66,6 мг/г сухого веса. Максимальное содержание отмечено для Н. pulviliformis и составило 22,2 мг/г сырого веса или 195,2 мг/г сухого веса. Минимальное содержание отмечено для Poecillastra sp. и составило 2,3 мг/г сырого веса или 22,1 мг/г сухого веса. 14 видов губок, изученных в данной работе, принадлежит к отряду Poeciloscleridae. Для губок этого отряда содержание липидов сильно варьировалось (от 2,7 до 22,2 мг/г сырого веса или от 39,5 до 195,2 мг/г сухого веса) и в среднем составило 8,0 мг/г сырого веса или 71,7 мг/г сухого веса. Однако, для 10 видов этого отряда (Poeciloscleridae), собранных на одной станции (о. Онекотан, Курильские о-ва), вариации в содержании общих липидов были гораздо меньше (от 3,1 до 8,5 мг/г сырого веса или от 42,1 до 60,1 мг/г сухого веса). Очевидно, что в целом морские и пресноводные губки небогаты липидами, при этом разные виды губок заметно отличаются по содержанию общих липидов. Для одного и того же вида содержание липидов может изменяться в зависимости условий обитания,
В таблице 1. (Прил.) приведены наши данные о содержании фосфолипндов в общих липидах исследованных губок. В среднем фосфолипиды составили 32,2% от общих липидов, и их доля варьировала от 19,6% в JL baicalensis до 44,1% в Т. dirhaphis. Распределение фосфолипндов по классам представлено в таблице 1. (Прил.) Главными фосфолшшдами в исследованных губках были фосфатидилхолин (ФХ), фосфатидилэтаноламин (ФЭ) и фосфатидилсерин (ФС). Они были найдены у всех видов губок; исключением является губка М. zenkevitchi, у которой отсутствовал ФС. Среднее содержание ФХ, ФЭ, ФС составляет 30,0%, 30,2%, 27,2%, соответственно. У некоторых видов были обнаружены также фосфатидилглицерин (ФГ) лдфосфатидилглицерин (ДФГ) фосфатидилинозит (ФИ), лизофосфатидилэтаноламин (ЛФЭ) и фосфатидная кислота (ФК). В губках F. ttschakowi и К panicea было отмечено высокое содержание ФГ. Наряду с высоким содержанием ФГ, в губках Е. digitata, Polymastia sp. было обнаружено высокое содержание ДФГ. В губке О. pennata было отмечено повышенное (по сравнению с другими видами губок) содержание ФИ, а губка Megaciella sp. отличалась заметной долей ФИ и ЛФЭ. У большинства изученных нами видов губок присутствует ЛФЭ (1,5-9,7%), но ни у одной губки не обнаружен ЛФХ. Фосфатидная кислота присутствовала в небольших количествах (в среднем 1,5%) в липидах большинства изученных губок. Мы предполагаем, что наличие ЛФЭ не связано с неферментативным гидролизом ФЭ при хранении и обработке ткани, а может быть отражением субстратной специфичности фосфолипазы Аг- Вероятно, ЛФЭ функционально задействован в губке. К сожалению, в настоящее время в литературе отсутствуют данные о фосфолипазах и роли лизофосфолипидов в губках.
Состав фосфолипидов у 17 видов губок был изучен впервые. Полученные нами данные (Табл,2. Прил.) по составу фосфолипидов губок В. bacillifera, L. baicalensis, М. incrustans были близки к опубликованным ранее. Для этих трех видов содержание ФЭ по нашим результатам составило 33,4%, 31,4% и 35,5%; ФХ - 44,5%, 42,2% и 29,5%; ФС -17,1%, 16,5% и 22,4%, соответственно, а по литературным данным содержание ФЭ было 28%, 23% и 24%; ФХ - 44%, 38% и 26%; ФС - 13%, 14% и 20%, соответственно (Дембицкий, Небылицин, 1980; Дембицкий, 1982). Незначительные колебания в содержании ФЛ, вероятно, обусловлены условиями обитания. При сравнении данных, полученных нами, по составу фосфолипидов Н. ратсеа с литературными данными были обнаружены заметные отличия в содержании ФХ (11,1% против 21%) и ФГ (18,4% против 2%) (Дембицкий, Небылицин, 1980). Данные литературы по составу ФЛ Н. ратсеа приведены для зимнего сезона, тогда как мы исследовали губку, собранную летом. Аналогичные колебания в содержании ФХ и ФГ отмечены для губки Axinella verrucosa. В липидах Л. verrucosa, собранной у берегов Италии, ФХ полностью отсутствует, а содержание ФГ достигает 30%. Тогда как для A. verrucosa, собранной у берегов Сенегала, ФХ составляет 15%, а содержание ФГ снижено до 15% (Dasgupta et al., 1987). Мы предполагаем, что такие вариации могут быть связаны с сезонными изменениями количества симбиотических микроорганизмов в губке, так как ФГ является одним из главных классов фосфолипидов для бактерий (Gunstone et al., 1994).
Сравнение состава ФЛ для представителей рода Megaciella выявило большую вариабельность содержания отдельных классов ФЛ внутри одного рода губок (Табл. 2. Прил.). Содержание ФЭ и ФХ колеблется в пределах 25,1-48,5% и 25,0-50,1%, соответственно. Кроме того, в липидах zenkevitchi отсутствует ФС, обнаруженный у всех остальных губок.
Отмеченное непостоянство состава ФЛ как отдельных видов, так и нескольких видов внутри одного рода, по нашему мнению, делает невозможным использование ФЛ для хемосистематики губок.
В составе общих липидов губок нами было обнаружено более 40 различных насыщенных ЖК: с неразветвленным углеродным скелетом, і/аі-строения, с одним и двумя метильными заместителями в середине цепи, а также разветвленные кислоты изопреноидного строения и кислоты, содержащие циклопропановую группу (Табл. 3. Прил.).
Относительное процентное содержание насыщенных ЖК в изученных видах губок колебалось от 7,6% (М kobjakovae) до 29,6% (К digitata) и составило в среднем 14,6% от суммы ЖК общих лнпидов, при этом был обнаружен весь ряд ЖК от 14 до 26 атомов углерода. Доля насыщенных ЖК линейного строения находилась в интервале от 4,2% (М. kobjakovae) до 10,8% (L baicalensis) и составила в среднем 7,5% от суммы кислот. Во всех исследованных нами губках присутствовали кислоты 14:0,15:0,16:0,17:0,18:0, а кислоты 19:0 и 20:0 отсутствовали только в губках Н. assimilis и Е. digitata, соответственно. У половины изученных в данной работе губок найдены кислоты 22:0 и 24:0, и только у единичных губок были обнаружены 21:0 (Н. panicea, М. kobjakovae , М. firagilis, Megaciella sp), 23:0 (Haliclona sp., H. gracilis), 25:0 (M.fragilis) и 26:0 (В. bacilli/era, L. baicalensis).
Среди насыщенных неразветвленных ЖК у большинства видов губок преобладала пальмитиновая кислота (16:0). Относительное содержание этой ЖК колебалось от 1,7% (М. kobjakovae) до 5,5% (Z., baicalensis) от суммы кислот. Другой главной насыщенной линейного строения бьша стеариновая кислота (18:0), содержание которой в среднем составило 1,7% от суммы кислот. Количество сверхдлинноцепочечных ЖК было незначительное, в среднем 0,2% от суммы кислот,
Содержание в губках насыщенных кислот і/ш-строения колебалось в пределах от 1,1% (Я assimilis) до 8,5% {Е. digitata) и составило в среднем 4,0% от суммы кислот. Были найдены все гомологи і/аі-ЖК - от Си до Сгь У всех исследованных нами губок присутствовали і/аі-\5:0, і/аі-16:0 и i/ai- 17:0, кроме двух видов, H.assimilis и 71 dirhaphis, в которых не обнаружены /-16:0 и ш -16:0, соответственно. Другие ЖК 4н-строения обнаружены только у некоторых видов губок. Насыщенные С15.21 ЖК ь да-строения ранее были обнаружены у многих губок и других организмов (Perry et al., 1979; Carballeira et al., 1986; Ayanoglu et al., 1990). Принято считать, что подобные кислоты имеют бактериальное происхождение (Kaneda, 1991; Dalsgaard et al., 2003).
Изомеры эйкозапентаеновой кислоты нз губки В, baciltifera
Таким образом, на основании данных нескольких независимых физико-химических методов показано, что в губке обнаружены две новые сверхдлинноцепочечные разветвленные ненасыщенные кислоты: 2-метил-17(2)-тетракозеновая и 2-метил-17(2)-гексакозеновая кислоты,
В составе линидов губок 2-метилзамещенные ЖК ранее были отмечены один раз. Карбаллеира обнаружил 2-Ме-18:0 кислоту в фоофолипидах губки Plakortis halichondroides (Carballeira Shabali, 1990). Сверхдлинноцепочечные ЖК с йн -структурой, а также с разветвлением в середине углеродной цепи являются довольно обычными для губок {Rezanka, 1989). Однако, ранее 2-Ме-разветвленные сверхдлинноцепочечные ненасыщенные ЖК не были обнаружены. Мы предполагаем, что подобные кислоты синтезируются при участии бактериальных симбионтов Н. рапгсеа из более коротких предшественников.
При анализе общих МЭЖК из губки В. bacilli/era методами ГЖХ и ГЖХ-МС было обнаружено несколько изомеров эйкозапентаеновой (ЭПК) кислоты. Все эти кислоты имели одинаковый молекулярный ион, сходную картину его фрагментации, но разную хроматографическую подвижность. Для установления химической структуры эти изомеры выделяли последовательным применением препаративной колоночной хроматографии низкого давления на силикагеле, импрегнированном AgNC 3, полупрепаративной обращено-фазовой ВЭЖХ в системах ацетонитрил (100%) и ацетонитрил-вода, 75:25. Было получено три индивидуальных изомера метилового эфира ЭПК высокой (более 95%) чистоты, обозначенные как А, В и С, в соотношении 1:10:1,3 (w/w/w), соответственно. Следует отметить, что в исходной смеси присутствовали и другие изомерные кислоты, но в меньших концентрациях, что делало неэффективными усилия по их очистке, ввиду недостатка биологического материала. Попытки установления положения двойных связей в углеродной цепи выделенных кислот методом хромато-масс-спектрометрии в форме пирролидидов не дали однозначно интерпретируемых результатов. Поэтому мы применили частичное восстановление гидразином, с последующим выделением смеси моноеновых кислот и анализом их ДМДС-аддуктов методом ГЖХ-МС. Зная положение двойных связей во всех полученных моноенах, легко реконструировать положение двойных связей в углеродной цепи исходного полнена.
Частичное восстановление гидразином полиеновых жирных кислот (восстановительный гидразинолиз) часто используется для определения положения двойных связей в исходной молекуле ЖК (Kates, 1986). Гидразин в присутствии окисляющих агентов in situ образует диимин, который взаимодействует с двойными связями ЖК (рис. 19).
В масс-спектрах ДМДС-аддуктов метиловых эфиров пяти моноеновых жирных кислот 20:1, полученных восстановительным гидразинолизом из компонента А, присутствовали молекулярный ион с m/z 418, а также пары интенсивных пиков фрагментарных характеристических ионов с m/z 161 (С НвЗОг ) и m/z 257 (СібНззБ ), m/z 203 (C10Hi9S V) и m/z 215 (C H S4), m/z 245 (C13H25SO24) и m/z 173 (CioIbiS ), от/г 287 (CieHsiSCb и m/z 131 (CTHJSS ), m/z 329 (Сі ЗД ) и m/z 89 (GtfbS , указывающие, соответственно, на положение двойных связей при 5, 8, 11, 14 и 17-ом атомах углерода. Таким образом, структура компонента А, составляющего 1,9% от суммы всех ЖК в общих лшшдах губки В. bacillifera, соответствует формуле 20:5 Д5,8,11,14,17, т.е. тривиальной метиленразделеной ЭПК, широко распространенной в природе.
В масс-спектрах 4-х из 5-ти ДМДС-аддуктов метиловых зфиров моноеновых жирных кислот 20:1, полученных восстановительным гидразинолизом из компонента В, присутствовали молекулярный ион с m/z 418, а также пары интенсивных пиков фрагментарных характеристических ионов с m/z 161 (C7H13SO24) и m/z 257 (СібНззБ4), m/z 203 (CoHigSC и m/z 215 (C13H27SO, m/z 245 (СізНиБОі ) и m/z 173 (CioH2iS ), m/z 287 (СІбНзіЙОг ) и m/z 131 (C7HisS+), указывающие, соответственно, на положение двойных связей при 5,8,11 и 14-ом атомах углерода. Неожиданностью было то, что в масс-спектре последнего ДМДС-аддукта метилового эфира кислоты 20:1 присутствовали интенсивные пики фрагментарных ионов с m/z 343 (СгоИзрвОг ) и m/z 75 (СзНуЭ ), указывающие на положение двойной связи у 18-го атома углерода (рис. 20). При этом хроматографическая подвижность МЭ и ДМДС-аддукта 20:1 Д18 указывала на от/гаш конфигурацин двойной связи. Для подтверждения этого предположения смесь МЭ моноеновых 20:1, полученных восстановительным гидразинолизом компонента В, разделяли на цис- и транс-изомеры при помощи препаративной AgCX (Toschi et al., 1993). При этом 4 кислоты 20:1Д5, 20:1Д8, 20:1 АП и 20:1Д14 были найдены в зоне уис-изомеров, и только одна кислота 20:1Д18 - в зоне транс-изомеров. Следовательно, основной изомер ЭПК (компонент В), составляющий 15,9% от суммы всех ЖК в общих липидах губки Я bacillifera, имел необычную структуру 20:5Д5,8Д 1,14,18?.
Масс-спектры 4-х из 5-ти ДМДС-аддуктов метиловых зфиров моноеновых жирных кислот 20:1, полученных восстановительным гидразинолизом из компонента С, были идентичны масс-спектрам полученным для продуктов частичного восстановления компонента В (20:5А5,8Д 1,14,18/), и указывали на положение дойной связи у 5, 8, 11, 18 атомов углерода, соответственно. Аналогично, как для суммы моноенов из компонента С, было показано, что кислота 20:1 Д18 также имела /прайс-конфигурацию двойной связи. В масс-спектре последнего ДМДС-аддукта метилового эфира кислоты 20:1 присутствовали, кроме молекулярного иона с m/z 418, интенсивные пики фрагментарных ионов с т/г 301 (C17H33SO24) и m/z 117 (СбНіз5+), указывающие на положение двойной связи при 15-ом атоме углерода. Следовательно, третий изомер ЭПК (компонент С), составляющий 2,5% от суммы всех ЖК в общих липидах губки В. bacillifera имел необычную структуру 20:5Д5,8,П,15,Ш.
Сравнение состава ЖК бореальных и тропических губок
В систематике многих групп организмов наряду с классическими морфологическими методами, широко применяются данные биохимических исследований, в частности данные по составу ЖК. Например, весьма продуктивной оказалась систематика голосемянных растений по составу ЖК из семян (Wolff et at., 1997; Wolff, 1998). В последнее время при описании нового вида бактерий дополнительно используются данные по составу ЖК (Nichols, McMeekin, 2002; Gugger et al., 2002).
В систематике в настоящее время все известные губки относятся к трем классам, 25 отрядам, 127 семействам и 682 родам (Hooper, Van Soest, 2002). Мы исследовали губки класса Demospongiae принадлежащие к 5 отрадам (Astrophorida, Hadromerida, Poeciloscleridae, Halichondrida, Haplosclerida), 12 семействам (Pachastrellidae, Polymastiidae, Acarnidae, Microcionidae, Coelosphaeridae, Myxillidae, Tedaniidae, Esperiopsidae, Mycalidae, Halichondriidae, Chalinidae, Spongillidae) и 18 родам,
Только для губок из семейств Myxillidae и Acarnidae были обнаружены общие закономерности в составе ЖК, которые могут быть в дальнейшем использованы как хемоситематические признаки. При сравнении состава ЖК у трех представителей семейства Myxillidae (МухШа incrustans, Melonachora kobjakovae, Stelodoryx toporokf) было обнаружено, что из 57 ЖК найденных в составе общих липидов 42 ЖК присутствовали у всех исследованных нами видах в схожих концентрациях. Характерными насыщенными ЖК, обнаруженными у трех видов этого семейства, являлись 10-Ме-18:0, 14-Ме-17:0, 15-Ме-18:0 и 1б-Ме-19:0. Главными моноеновыми ЖК являлись 16:1Д9, 7-Ме-16:1Д6 и 18:1ДП. Среди других ЖК, ранее не описанных в литературе, но обнаруженных нами у трех представителей этого семейства и у некоторых других губок, была кислота 15-Ме-24:1 А14. Главной ненасыщенной ЖК у всех исследованных видов этого семейства была кислота 28:ЗД5,9,21. Вместе с ней присутствовала кислота 28:ЗД5,9,22, ранее не обнаруженная у губок. Таким образом, можно сделать вывод, что для представителей семейства Myxillidae состав ЖК очень схожий, главной ЖК является 28:ЗД5,9,21, и обязательно присутствие кислот 14-Ме-17:0, 15-Ме-18:0, 16-Ме-19:0, 15-Ме-24:1Д14 и 28:ЗД5,9,22, которые редко встречаются у других губок.
Три вида исследованных губок относились к семейству Acarnidae: Megaciella sp.„ М. Jragilis н М. zenkevitchi. При сравнении состава ЖК у этих видов было обнаружено, что из бб ЖК найденных в составе общих липидов 60 ЖК присутствуют у всех исследованных нами представителей в схожих концентрациях, а 44 ЖК являются общими для всех исследованных нами представителей семейства Myxillidae и семейства Acarnidae. Надо отметить, что ранее, по мнению Колтуна (Колтун, 1959), губки Megaciella sp., М. fragilis и М. zenkevitchi также относились к семейства Myxillidae. Сравнение профилей ЖК исследованных нами представителей Myxillidae и Acamidae выявило много общих характерных особенностей. Главной ЖК у этих губок является 28:ЗД5,9,21, но обязательно присутствие группы кислот 14-Ме-17:0, 15-Ме-18:0, 16-Ме-19:0, 15-Ме-24:1 Д14 и 28:ЗД5,9,22, которые редко встречаются у других губок.
Анализ наших результатов по составу ЖК губок из нескольких отрядов и сравнение их с литературными данными выявили заметные расхождения, которые не позволили нам однозначно выделить характерные хемосистематические признаки губок, входящих в эти отряды.
Среди исследованных нами губок наиболее широко были представлены виды отряда Poeciloscleridae (13 видов). По литературным данным у губок отряда Poecilosclendae с Большого Барьерного рифа отсутствовали отличительные черты в составе ЖК (Bergqist et al., 1984; Lawson et al., 1984). Анализ наших данных также не показал присутствия каких-либо характерных для отряда Poeciloscleridae особенностей в профилях ЖК по сравнению с другими отрядами.
По нашим данным для 4-х видов губок отряда Haplosclerida основными СДЖК являлись См ЖК, тогда как содержание более длинных С27-С28 ЖК незначительное. Напротив, по литературным данным у представителей Haplosclerida уровень содержания С27 и Сгв ЖК был выше среднего (Bergqist et al., 1984; Lawson et al., 1984).
По нашим данным профили ЖК двух губок из отряда Halichondrida {Hymeniacidon assimilis и Halichondiapanicea) общих чертах схожи, главной СДЖК была 26:ЗА5,9,19 при незначительном содержании СДЖК с большим числом атомов углерода. По литературным данным в губке Н. sanguinea в качестве главных СДЖК были выделены три кислоты 26:2Д5,9, 26:ЗД5,9,19 и 28:ЗД5,9,19 (Christie et al., 1994), количество которых сильно разнилось с нашими данными. По результатам Бергквиста для двух других губок из отряда Halichondrida, губка Hymeniacidon паигаЫ не имела ЖК, длиннее С , тогда как в Hymeniacidon perleve около 20% составляли С27-С30 ЖК (Bergqist et al., 1984). В составе липидов Halichondia рапїсеа нами были обнаружены две кислоты 2-Ме-24:1Д17 и 2-Ме-26:1Д17, которые ранее не были найдены у других представителей того отряда.
Сравнение литературных и полученных нами данных показал, что относительное содержание отдельных ЖК имеет небольшую ценность для хемосистематических построений из-за вариабельности в зависимости от условий окружающей среды. Нам не удалось выявить ярких закономерностей между составом ЖК губок и их принадлежностью к определенному отряду. Внутри каждого отряда отмечается большая вариабельность состава ЖК. Причинами непостоянства состава ЖК у губок могут служить влияние пищи и места обитания, сезон сбора губок, популяционная изменчивость, вариации в содержании симбионтов. Только на уровне семейства (Myxillidae и Acarnidae) были выявлены характерные ЖК, корые можно использовать как хемосистематические маркеры. Как отмечалась в предыдущих главах, некоторые из изученных видов губок имеют уникальные или очень редкие компоненты, которые могут быть маркером именно этого вида. Результаты поиска этих уникальных ЖК в родственных видах могут послужить дополнительным основанием для дальнейших хемотаксономических построений на низких систематических уровнях. Представляется вероятным, что для обнаружения липидных маркеров родов, семейств или отрядов губок, следует изучить и сравнить большую часть видов этих систематических групп.
