Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Полидисперсность биополимеров 11
1.2. Требования к качеству лекарственных средств на основе белков крови и полисахаридов 13
1.2.1. Определение молекулярно-массового распределения в препаратах полисахаридов 14
1.2.1.1. Препараты на основе гидроксиэтилированного крахмала 14
1.2.1.2. Методы определения молекулярно-массового распределения в препаратах на основе гидроксиэтилированного крахмала 16
1.2.1.3. Препараты на основе декстрана 21
1.2.1.4. Методы определения молекулярно-массового распределения в препаратах на основе декстрана 22
1.2.2. Определение молекулярно-массового распределения в препаратах белков крови 25
1.2.2.1. Молекулярно-массовое распределение в препаратах альбумина 27
1.2.2.2. Молекулярно-массовое распределение в препаратах на основе иммуноглобулина 29
1.2.2.3. Проблемы при определении молекулярно-массового распределения в препаратах на основе белков крови 33
1.3. Многоугловое лазерное светорассеяние 35
1.3.1. Теория метода статического светорассеяния 36
1.3.2. Использование многоуглового лазерного светорассеяния для определения молекулярно-массового распределения биополимеров 38
1.4. Валидация методик 40
2. Материалы и методы исследования 42
2.1. Оборудование 42
2.2. Субстанции и фармацевтические препараты, использованные в работе 42
2.3. Стандарты и реактивы 44
2.4. Определение молекулярно-массового распределения в препаратах на основе полисахаридов 45
2.5. Проведение валидации методики эксклюзионной хроматографии с детектором многоуглового лазерного светорассеяния 46
2.6. Определение молекулярно-массового распределения в препаратах на основе белков 48
2.7. Расчет молекулярных параметров методом статического светорассеяния 49
2.8. Статистическая обработка результатов 50
3. Результаты и обсуждение 51
3.1. Сопоставление методов определения молекулярно-массового распределения гидроксиэтилированного крахмала 51
3.1.1. Заключение к разделу 3.1 55
3.2. Валидация методики эксклюзионной хроматографии с детектором многоуглового лазерного светорассеяния 55
3.2.1. Специфичность 56
3.2.1. Прецизионность. Сходимость 56
3.2.2. Внутрилабораторная воспроизводимость 57
3.2.3. Линейность 58
3.2.4. Точность (правильность) 60
3.2.5. Диапазон применения методики 61
3.2.6. Робастность 62
3.2.7. Определение рабочей концентрации 62
3.2.8. Критерий пригодности хроматографической системы 63
3.2.9. Заключение к разделу 3.2 64
3.3. Характеристика молекулярно-массового распределения субстанций и препаратов на основе гидроксиэтилированного крахмала 64
3.4. Характеристика молекулярно-массового распределения субстанций и препаратов на основе декстрана 67
3.5. Определение молекулярных параметров методом эксклюзионной хроматографии с детектором многоуглового лазерного светорассеяния в препаратах «Альбумин, раствор для инфузий» 70
3.5.1. Мономеры и димеры альбумина 72
3.5.2. Полимеры и агрегаты альбумина 74
3.6. Определение молекулярных параметров методом эксклюзионной хроматографии с детектором многоуглового лазерного светорассеяния в препаратах «Иммуноглобулин, раствор для инфузий» 79
3.6.1. Мономеры и димеры иммуноглобулинов 79
3.6.2. Полимеры и агрегаты иммуноглобулинов 81
3.6.3. Влияние срока хранения препарата «Иммуноглобулин, раствор для инфузий», производства ГБУЗ им. Климовой на его молекулярный состав 88
3.6.4. Заключение к разделу 3.6 92
4. Заключение. Перспективы использования детектора многоуглового лазерного светорассеяния для определения молекулярных параметров и молекулярно-массового распределения биологических полимеров 93
Выводы 97
Список используемых сокращений 99
Список литературы
- Препараты на основе гидроксиэтилированного крахмала
- Субстанции и фармацевтические препараты, использованные в работе
- Валидация методики эксклюзионной хроматографии с детектором многоуглового лазерного светорассеяния
- Определение молекулярных параметров методом эксклюзионной хроматографии с детектором многоуглового лазерного светорассеяния в препаратах «Иммуноглобулин, раствор для инфузий»
Препараты на основе гидроксиэтилированного крахмала
Декстран представляет собой гомогенный полисахарид из остатков глюкозы, синтезируемый бактериями [42, 139]. Основная связь между остатками мономера осуществляется за счет а(1— 6) гликозидных связей, но также могут присутствовать а(1— 2), а(1— 3) и а(1— 4) гликозидные связи, обуславливающие разветвленность молекулы данного полимера [85]. Для синтеза фармацевтического декстрана используют бактериальную культуру Leuconostoc mesenteroides [42, 178] штамма В-512 [42, 169]. Степень и характер ветвления в значительной степени зависит от штамма используемой бактерии. Например, декстран из Leuconostoc Mesenteroides В-512 F содержит 95% а(1— 6) и 5% а(1— 3) гликозидных связей, а растворимая форма декстрана из Leuconostoc Mesenteroides В-1299 68% а(1-»6), 29% а(1-»2) и 3% а(1-»3) [31]. Помимо влияния бактериального штамма на молекулярные характеристики полимера [27, 95, 107, 113], состав и строение декстрана также могут зависеть от условий его синтеза [65].
В работе [178] указано, что критерий ММР лежит в основе разделения инфузионных сред декстранов на две основные группы, которые находят различное терапевтическое применение: низкомолекулярные декстраны - декстран [номинальная ММ 35000-45000]; среднемолекулярные декстраны - декстран [номинальная ММ 64000-76000].
Однако в ЕФ опубликована монография 1000 на декстран для инъекций с номинальной ММ 60 кД [169]. Такие препараты зарегистрированы, в том числе и на территории Российской Федерации [141].
Для субстанций и препаратов декстрана, также как и для ГЭК, значительную проблему определения ММР составляет выбор метода анализа, который позволит получить корректное значение ММ.
Методы определения молекулярно-массового распределения в препаратах на основе декстрана
Определение ММР в препаратах на основе декстрана принято выполнять либо вискозиметрическим методом, либо ЭХ-ДР [89].
Исследования зависимости вязкости растворов полимеров от ММ очень широко представлены в литературе. Но несмотря на обилие информации, невозможно количественно описать влияние ММ на вязкостные характеристики. Поэтому вискозиметрия не может применяться как абсолютный метод измерения ММ.
Изначально Штаудингер предложил простую зависимость между вязкостью раствора и ММ полимера [36, 126, 192]:
Однако последующие исследования зависимость (4) не подтвердили [54]. Вязкость растворов полимеров зависит от объема занимаемого макромолекулой, который определяется следующими факторами: величина ММ, характер взаимодействия растворителя с полимером, строение полимера, концентрация раствора. Тем не менее, вискозиметрия широко используется при исследовании полимеров как простой и удобный метод определения ММ в тех случаях, когда эмпирически установлена зависимость вязкости от ММ. Для декстранов зависимость между вязкостью растворов ([п]) и ММ не является линейной функцией, а описывается уравнением Марка-Хаувинка-Куна [36]: [п] = КММа, (5) где а - константа, зависящая от природы полимера и растворителя. Для декстрана значения коэффициентов «К» и «а» равны соответственно 0,000966 и -0,5 [178]. Стоит отметить, что данный подход позволяет определять средневязкостную ММ (Мл).
Чтобы полностью охарактеризовать ММР в лекарственных средствах на основе декстрана, необходимо определить средние ММ 10% высоко- и низкомолекулярных фракций. Данные фракции необходимо предварительно выделить методом спиртового осаждения, и после этого охарактеризовать их вискозиметрическим методом [178].
В работе [178] представлен альтернативный метод определения ММР, в соответствии с которым используют хроматографическое определение ММ полимера. В данном случае записывают хроматограммы стандартов декстрана с известными ММ и определяют калибровочную зависимость десятичного логарифма ММ от объема элюирования пика стандарта (V):
На основании калибровочной зависимости и по значению объема элюирования препарата рассчитывают ММ препарата по уравнению 6. Также возможны и другие способы калибровки хроматографической колонки (полидисперсная, универсальная и т.д.) [186].
Для характеристики ММР выделяют площадь высоко- и низкомолекулярной фракций, равные 10% от общей площади пика препарата на хроматограмме. Каждую выделенную область делят на несколько i-ых участков, после чего определяют ММ каждого участка (ММ{) по калибровке и высоту () выделенного фрагмента. Расчет 10% высоко- и низкомолекулярных фракций осуществляют по уравнению:
Субстанции и фармацевтические препараты, использованные в работе
Человеческий альбумин, свободный от жирных кислот, Sigma-Aldrich, Cat. №А1887. Натрия нитрат 99%, for analysis, Acros Organics, Cat. № 7631-99-4. Натрия фосфат двухосновный семиводный, 98%, Sigma-Aldrich, Cat. №S9390. Калия фосфат одноосновный безводный 99%, Sigma-Aldrich, Cat. №Р0662. Натрия азид for synthesis, Merck, Cat №822335. Все растворы готовили с использованием в качестве растворителя воды дистиллированной (ГОСТ 6709-72, Вода дистиллированная. Технические условия). Перед использованием буферные растворы последовательно пропускали через фильтры HNWP на основе нейлона с размером пор 0,45 мкм (Millipore) и VSWP на основе нитроцеллюлозы с размером пор 0,025 мкм (Millipore). Определение молекулярно-массового распределения в препаратах на основе полисахаридов
Для анализа субстанций и препаратов ГЭК с номинальной ММ 130 и 200 использовали хроматографическую систему с инжектором с петлей объемом 100 мкл и последовательно соединенных колонок TSKgel 5000PW/5000PW/3000PW, Tosoh Bioscience, Япония.
В качестве подвижной фазы использовали 0,05 М раствор натрия нитрата с 3 мМ натрия азидом. Скорость подачи элюента составляла 0,8 мл/мин. Определение проводили с использованием двух детекторов - детектора МУЛС и ДР. Для нормализации детектора МУЛС использовали декстран с ММ 5 кД.
Расчет средних ММ осуществляли в автоматическом режиме с помощью программного обеспечения Astra 5.3.4.14 (Wyatt Technology, США). Для построения кривой светорассеяния Hxc/R(0)=f(sinA2( 0 /2)) использовали координаты Зимма. Определение ММ низко- и высокомолекулярных фракций осуществляли во вкладке «Анализ распределений» по точкам на кривой ММР, соответствующим 10% (М рниз) и 90% (Г РВЬ[С) образца и для фракций 0 - 10% (MWIffl3) и 90 - 100%
Для определения ММ по калибровке использовали хроматографическую систему и условия элюции аналогичные, описанные в методе ЭХ-МУЛС. Определение проводили с использованием детектора ДР. Для сбора и обработки данных дополнительно использовали программу ClarityChrom с модулем для расчета результатов ЭХ.
Для построения полидисперсной калибровки методом ЭХ-ДР использовали субстанции ГЭК, произведенные из кукурузного крахмала фирмы «Аджиномото Ко. Инк» и из картофельного крахмала фирмы «Зерумверк Бернбург АГ», предварительно охарактеризованные методом ЭХ-МУЛС. Пик крахмала, был разделен на части соответствующие 3, 5, 10, 30, 50, 70, 90, 95, 97% его площади. По интегральной кривой распределения определяли ММ полученных фракций. Зависимость ММ от соответствующих этим процентам времен удерживания использовали для построения полидисперсной калибровки.
Все образцы для анализа разводили подвижной фазой до концентрации 5 -10 мг/мл. В расчетах использовали значения инкремента показателя преломления, описанные в литературе: для ГЭК - 0,144 мл/г [138], для декстрана - 0,147 мл/г [137]. Проведение валидации методики эксклюзионной хроматографии с детектором многоуглового лазерного светорассеяния
Валидацию методики ЭХ-МУЛС проводили в соответствии с руководством ICH по валидации аналитических методик Q2(R1) по показателям: специфичность, воспроизводимость, точность, линейность, диапазон применения, робастность [193].
Специфичность методики ЭХ-МУЛС подтверждали набором хроматограмм подвижной фазы, стандарта и анализируемого образца [193].
Для количественной оценки воспроизводимости использовали стандартное отклонение (СО) или относительное стандартное отклонение (ОСО) для серии 6 измерений [193]: со= r l(Mwi"Mw)2(i6) осо = іоохш(17) где m - количество измерении в серии; і - номер измерения в серии; М w -среднее значение измерений. Для определения внутрилабораторной воспроизводимости сравнивали рассчитанные и табличные значения критериев Фишера (F) и Стьюдента (t) двух выборок, полученных разными операторами, с временным интервалом более двух дней [167, 193]:
В качестве критерия линейности для методик определения содержания основных веществ рассматривали значение коэффициента корреляции не ниже 0,9990 [179].
Диапазон применения определяли как область, в которой аналитическая методика имеет требуемую прецизионность, точность и линейность [179].
Робастность контролировали по изменению ОСО среднего результата определения ММ при изменении процесса нормализации фотодиодов.
Определение молекулярно-массового распределения в препаратах на основе белков Для анализа препаратов белков крови использовали хроматографическую систему с инжектором с петлей объемом 20 мкл и колонок TSKgel G4000SWxl 600 х 7,5 мм, Tosoh Bioscience, Япония для препаратов иммуноглобулина и ProteinPak 300SW 300 х 7,8 мм, Waters, США для препаратов альбумина.
В качестве подвижной фазы использовали 20 мМ натрий-калий фосфатный буфер рН 7,0 с 3 мМ натрия азидом. Скорость элюции составляла 0,8 мл/мин. Фракции детектировали при помощи детекторов МУЛС и УФ. Для обсчета результатов использовали коэффициент экстинкции мономера иммуноглобулина человека - 1,3 мл/(мг см) [57] и мономера человеческого альбумина 0,5 мл/(мг см) [40], а также инкремент показателя преломления белков 0,186 мл/г [151]. Для фракции полимеров и агрегатов альбумина использовали коэффициент экстинкции 1,0 мл/(мг см) [59].
Расчет процентного содержания фракций осуществляли по данным УФ-детектора, принимая за сто процентов сумму площадей всех пиков, представленных на хроматограмме, за исключением пиков, соответствующих стабилизаторам. Процентное содержание фракции пика, определяли как процентную долю площади соответствующего пика по отношению к 100%.
При расчете процентного содержания по данным статического светорассеяния, на хроматограмме детектора МУЛС площади всех обсчитываемых пиков делили на соответствующие среднемассовые ММ. За сто процентов принимали сумму приведенных к единичной среднемассовой ММ площадей всех пиков представленных на хроматограмме МУЛС-детектора, за исключением пиков, соответствующих стабилизаторам. Процентное содержание каждой фракции определяли как процентную долю приведенной к единичной среднемассовой ММ площади соответствующего пика по отношению к 100%.
Валидация методики эксклюзионной хроматографии с детектором многоуглового лазерного светорассеяния
Также, как и в препаратах альбумина, молекулярные характеристики фракций «полимеров и агрегатов», присутствие которых нормируется в препаратах иммуноглобулинов всех производителей в зависимости от способа введения (не более 3% в препаратах для внутривенного введения и не более 10% в препаратах для внутримышечного введения), охарактеризованы недостаточно.
Использование детектора МУЛС позволило зарегистрировать в препаратах иммуноглобулинов разделение молекул, элюирующихся до выхода фракции димеров, и рассчитать их молекулярные параметры (рис. 12 и табл. 27). При сравнении хроматограмм МУЛС-детектора отечественных и импортных препаратов иммуноглобулинов, а также лекарственных средств, предназначенных для внутримышечного и внутривенного введений, выявлены качественные различия в характере ММР в зависимости от производителя препарата иммуноглобулина.
Среди импортных лекарственных средств на основе иммуноглобулина, применяемых внутримышечно, для препарата Резонатив было характерно высокое содержание высокомолекулярных фракций и размытая область олигомеров в диапазоне времени элюции 9,30 - 10,40 минут с максимумом при 9,90 минутах, а также прилегающей к нему областью в диапазоне 7,00 - 9,45 минут. Для другого внутримышечного препарата КамРоу было характерно полное отсутствие фракции олигомеров со временем элюции 10,30 - 11,30 минут, в то время как высокомолекулярные соединения элюировались в диапазонах 9,45 -10,30 и 7,10 - 9,80 минут с характерным делением на два пика.
Для отечественных препаратов иммуноглобулинов для внутримышечного введения, произведенных ФГУП НПО «Микроген» в Томске, было характерно высокое содержание высокомолекулярных фракций без деления на пики, а для образцов этого же предприятия, произведенных в Перми - с делением высокомолекулярных фракций на пики в начале диапазона калибровки колонки (9,45 - 10,30 и 7,00 - 9,45 минут соответственно).
А - Сплошная линия - Микроген (Томск), штриховая линия - Микроген (Пермь), пунктирная линия - КамРоу, точки - Резонатив.
Б - Сплошная линия - Габриглобин (Иваново), пунктирная линия -Иммуноглобулин (Микроген), штрих-пунктирная - Иммуноглобулин (ГБУЗ им. Климовой), штрих-штрих-пунктирная линия - Октагам, точки - Интратект. Хроматограммы препаратов для внутривенного введения Интратект и Неоцитотект, производимых фирмой Биотест и различающихся лишь специфичностью к цитомегаловирусу, практически одинаковы. Для них характерно наличие высокомолекулярной фракции, представленной размытой областью в диапазоне 7,50 - 9,60 минут с максимумом в 9,20 минут, а также области 9,60 - 10,70 минут без явного пика.
Данные качественные различия, выявленные на хроматограммах детектором МУЛС, могут быть обусловлены особенностями технологических процессов. Однако для установления взаимосвязи между ММР иммуноглобулина и технологией его производства необходима не только качественная идентификация всех фракций, но и корреляционный анализ особенностей технологических процессов, которые в большинстве случаев не представлены в открытом доступе.
На основании вышеперечисленных особенностей на хроматограммах всех испытуемых препаратов «Иммуноглобулин, раствор для инфузий» для фракции «полимеров и агрегатов» были выделены области «3», «4», «5» - фракции со временем элюции 10,30 - 11,30, 9,45 - 10,30 и 7,00 - 9,45 минут соответственно, а также «6» - фракция, элюирующаяся в «мертвом объеме» колонки (время элюции 6,00 - 7,00 минут) (рис. 12). УФ-детектор в области «мертвого объема» (6,00 -7,00 минут) всех препаратов иммуноглобулинов фракции «полимеры и агрегаты» не выявлял (рис. 11). Для выделенных областей хроматограмм препаратов иммуноглобулинов были рассчитаны основные молекулярные характеристики (табл. 27).
Определение молекулярных параметров методом эксклюзионной хроматографии с детектором многоуглового лазерного светорассеяния в препаратах «Иммуноглобулин, раствор для инфузий»
Применение детектора МУЛС позволило установить, что вариабельность аминокислотной последовательности иммуноглобулина не сказывается на значении коэффициента полидисперсности основных фракций препарата иммуноглобулина. В то же время при сопоставлении хроматограмм препаратов иммуноглобулина были выявлены качественные различия, которые зависели от производителя. Это позволяет предложить использование детектора МУЛС для контроля качества препаратов иммуноглобулина и подтверждения их подлинности.
Исследование методом ЭХ-МУЛС молекулярных параметров препаратов иммуноглобулина в пределах срока годности, так и свыше него, наглядно демонстрируют, что данные по ММ хроматографических фракций могут давать дополнительную информацию о процессах деградации белковых молекул, что делает целесообразным применение детектора МУЛС при изучении стабильности белков.
Перспективы использования детектора многоуглового лазерного светорассеяния для определения молекулярных параметров и молекулярно-массового распределения биологических полимеров.
Для определения ММ таких макромолекул как белки и полисахариды могут быть использованы различные методы. Но сравнительно быстрым и эффективным является только МУЛС. Особенностью детектора МУЛС является возможность определения ММ и среднеквадратичных радиусов в независимости от калибровки хроматографической колонки, построенной по стандартам сравнения, то есть позволяет проводить прямые измерения. В то же время применение детектора МУЛС позволяет исключить влияние конформации и формы макромолекул на определение ММ. Возможность применения данной техники в широком диапазоне ММ (200 Д - 1 ГД) и среднеквадратичных радиусов (10 - 500 нм) позволила производителю детектора МУЛС Wyatt Technology Corporation рекомендовать более ста возможных вариантов применения данной техники. Среди основных направлений можно выделить определение гетерогенных биополимеров и
93 синтетических полимеров, нативных белковых олигомеров, конъюгатов, пегилированных белков, а также изучение качества и чистоты белков. По данным тематикам на сайте Wyatt Technology Corporation представлен библиографический список более чем из двух тысяч позиций [142].
В фармацевтической промышленности МУЛС нашел применение при анализе ММР лекарственных средств на основе ГЭК [169]. Необходимость применения данного детектора была обоснована результатами, показывающими неадекватность использования для определения средней ММ хроматографических методов с использованием ДР и построения калибровочных графиков по стандартам.
В Российской Федерации детектор МУЛС практически не применяется, в связи с тем, что области его применения недостаточно определены. Для введения метода анализа ММР в отечественную практику контроля качества препаратов на основе ГЭК проведена валидация данной методики. Результаты анализа свидетельствуют о том, что метод ЭХ-МУЛС может быть использован для определения средней ММ ГЭК и рекомендован для введения в ГФ Российской Федерации.
При исследовании линейности методики было установлено, что диапазон устойчивости метода позволяет его рекомендовать для определения средней ММ и препаратов на основе декстранов с номинальной ММ от 40 до 70 кД. Также как и в случае ГЭК, для декстранов обнаружено неравенство параметров Mw, Мр и Мп.
Теория расчета средней ММ в синтетических полимерах, которую можно распространить и на природные полимеры, по крайней мере, полисахаридной природы (декстран и ГЭК) устанавливает различные понятия для ММ полимеров, обладающих полимолекулярностью и соединений с фиксированной структурой. Математически это различие выражается в виде значения полидисперсности, которое рассчитывается по соотношению Mw/Mn. Общепринято, что белки не могут обладать полидисперсностью, так как имеют одинаковое строение и состав полимерной молекулы. В то же время белковые препараты на основе антител представляют собой смесь вариабельных по структуре молекул IgG, полученных от не менее чем от 1000 доноров [169].
Сравнение величин коэффициента полидисперсности основных хроматографических фракций препарата альбумин (мономерный белок со строго определенной аминокислотной последовательностью и ММ) и препарата иммуноглобулин нормальный, представляющий собой смесь вариабельных молекул гликопротеина IgG, имеющих разную аминокислотную последовательность гипервариабельных доменов, отвечающих за иммунологические свойства, показало, что мономеры и димеры двух белков обладают низким значением коэффициента полидисперсности со значениями не более 1,1 (нижняя граница коэффициента полидисперсности [185]). Наличие вариабельности строения молекул иммуноглобулина никак не сказывается на значении коэффициента полидисперсности основных фракций препарата Иммуноглобулин человека, раствор для инфузий. Высокомолекулярные фракции, напротив, обладают полидисперсностью, а значение полидисперсности превышает 1,1.
Расчет среднеквадратичных радиусов молекул высокомолекулярных фракций альбумина и иммуноглобулина позволил оценить целесообразность использования нанофильтров для удаления высокомолекулярных соединений из препаратов на основе альбумина и иммуноглобулина.
