Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Постгеномный этап изучения белков (обзор литературы) 16
1.1. Современные стратегические направления изучения белков в биологии и медицине 16
1.2. Новые технологии определения белков клеток и биологических жидкостей 20
1.3. Значение и перспективы использования иммунохимических методов в исследовании белков 27
1.4. Общая характеристика и классификация минорных белков сыворотки крови человека, ассоциированных с беременностью 33
1.5. Связанный с беременностью альфа2-гликопротеин 38
ГЛАВА 2 Материалы и методы исследования 53
2.1. Характеристика и объем материалов исследований 53
2.2. Методы исследований : 56
2.2.1. Биохимические методы исследований 57
2.2.2. Иммунохимические методы исследований 65
2.2.3. Иммунологический метод 72
Результаты собственных исследований
ГЛАВА 3 Биохимическое изучение связанного с беременностью альфа2-гликопротеина (СБАГ) 75
3.1. Физико-химические свойства СБАГ 75
3.1.1. Характеристические окраски 75
3.1.2. Отношение к денатурирующим агентам 76
3.1.3. Электрофоретическая подвижность в геле 77
3.1.4. Коэффициент диффузии в геле 80
3.2. Определение молекулярной массы СБАГ 81
3.3. Изучение межмолекуляриых взаимодействий СБАГ с други- 85 ми белками сыворотки крови
3.4. Анализ аминокислотной последовательности СБАГ и МГ... 88
ГЛАВА 4 Подходы к рациональным способам выделения и очистки СБАГ 90
4.1. Фракционирование осаждающими агентами 91
4.2. Гидрофобная хроматография 95
4.3. Ионообменная хроматография 98
4.4. Гельпроникающая хроматография 99
4.5. Аффинная хроматография 101
ГЛАВА 5 Иммунохимическое изучение связанного с беременностью альфа2-гликопротеина 105
5.1. Иммунохимическая характеристика СБАГ 107
5.2. Разработка иммунохимических способов идентификации . СБАГ 109
5.2.1. Моделирование иммунодиффузионной тест-системы на СБАГ ПО
5.2.2. Разработка метода иммуноферментного анализа СБАГ 111
ГЛАВА 6 Распределение СБАГ в биологических жидкостях и тканях... 114
6.1. Иммунохимическое выявление СБАГ в биологических жидкостях человека 114
6.2. Выявление СБАГ в крови здоровых лиц в различные возрастные периоды и в зависимости от пола 115
6.3. Иммуногистохимическое изучение клеточной локализации СБАГ в нормальных и патологически измененных тканях человека тканях человека : 117
6.4. Идентификация аналогов СБАГ и других ассоциированных
с беременностью белков у обезьян Старого Света 122
ГЛАВА 7 Изучение биологической роли СБАГ . 125
7.1. Определение иммуномодулирующей активности СБАГ і 129
7.2. Возможная связь СБАГ с факторами апоптоза и интерлейки-нами 133
7.3. Зависимость продукции СБАГ от уровня гормонов '. 139
ГЛАВА 8 Клиническое изучение иммунохимического теста на СБАГ ... 141
8.1. Определение содержания СБАГ в крови женщин при физиологически протекающей и осложненной беременности 141
8.2. Изменение уровня СБАГ при воспалительных заболеваниях 148
8.3. Изменение уровня СБАГ при заболеваниях сердца 150
8.4. Изменение уровня СБАГ в крови при опухолях 154
8.5. Изменение уровня СБАГ при хирургических заболеваниях... 160
ГЛАВА 9 Обсуждение полученных результатов 173
Выводы 186
Список литературы 190
Доиложения 224
- Современные стратегические направления изучения белков в биологии и медицине
- Биохимические методы исследований
- Физико-химические свойства СБАГ
- Фракционирование осаждающими агентами
Введение к работе
XXI век международным научным сообществом объявлен веком биологии и информатики в связи с тем, что использование инновационных технологий привело к получению новых объемных данных о главных макромолекулах живого организма. На современном этапе развития науки гепомика, протеомика и биоинформатика определяют высокую скорость накопления данных о нуклеиновых кислотах и белках, обеспечивающих основные функции живой материи - саморегуляцию и самовоспроизведение. Причем, на первое место выходит протеомика, поскольку именно через белки, как структуры матричного синтеза, реализуются генетически обусловленные морфо-функциональные и физиологические особенности биологического вида вообще и отличительные особенности каждого индивида. В связи с этим изучение белков становится стратегическим направлением в биологии, биотехнологии, медицине и фармакологии [А.И. Арчаков, 2000; Л.Л. Киселев, 2000; JS. Albala, 2001; Р. Angenendt at al., 2004; O.Drews at al., 2002-2005; A. Gorg, 2003; N.Taniguchi, 2008].
Новые сведения породили, в свою очередь, обоснованные прогнозы и, одновременно, неоправданную эйфорию по поводу быстрой расшифровки молекулярного патогенеза, диагностики и лечения всех болезней. Теоретически все белки организма могут быть маркерами развития того или иного состояния и, в первую очередь, болезни.' Определение патогенетического и диагностического значения продукции индивидуальных белков крови и разработка на их основе диагностикумов представляет одну из важных проблем медицины [Г.И. Абелев, 2001; Л.А. Алексеева, 2003; Е.С. Герштейн, 2002; Л.С. Еремина, 2006; Е.Ю. Лысюк, 2004; А. В. Максимова, 2006; A.M. Сапожников, 2003; В.А. Фунт, 2005; П.Г. Прокопенко и соавт., 2002; В.П. Чехонин и соавт., 1999, 2003; L.P.Hale, 2001, 2002; J.C. Antoine, 2000; J.Solasol at al., 2005; A. Sutnar at al., 2007; M. Shabani at al., 2007; O. Topolcan, 2007].
По количественным и качественным характеристикам белки плазмы крови подразделяются на мажорные (основные) и минорные. Основные белки присутствуют в большой концентрации и выполняют постоянную выраженную функцию (например, гемоглобин, альфа2-макроглобулин, фибриноген и т.д.) Минорные же присутствуют в крови в малых количествах, а по функциональным свойствам, чаще всего, относятся к регуляторным молекулам или реактантам. К этой группе относятся также некоторые межоргапные и органоспецифические тканевые белки. В некоторых случаях - это продукты патологической генетической модификации В норме синтез многих минорных белков репрессирован, но при особых физиологических состояниях (например, беременность) или патологических - (воспаление, опухоль) продукция этих белков резко возрастает, не в разы, а на порядки и подобный феномен может быть использован в качестве диагностического критерия. Например, классический маркер воспаления -СРБ [В.А. Алешкин,1988; П.Г. Назаров, 1986, 2001; П.Г. Назаров, 2001; А.В. Полевщиков, 2001; М.В. Буракова, 2006; А. Koj, 1984; М.А. Zen Q., 1997].
Минорные белки крови остаются наименее изученными, что долгое время было обусловлено недостаточным уровнем чувствительности применяемых методов.
Наряду с новыми методами, не способными решить всех задач изучения белков, чрезвычайно востребованными остаются иммунохимические методы [А.Д. Дмитриев, 2003; В.В. Dzantiev at al., 1993; D.N.Ermolenko at al., 2002]. Именно их развитие позволило идентифицировать на молекулярном уровне ряд не известных ранее белков, что сразу раздвинуло горизонты представления о мозаике белков в биологических жидкостях и тканях организма человека.
Среди белков сыворотки крови уже более 30 лет пристальное внимание ученых и врачей привлекают так называемые белки беременности. Для диагностики состояния матери и плода важными являются специфические белки беременности, имеющие плодовое и плацентарное происхождение. К ним относятся альфа-фетопротеин (АФП), хорионический гонадотропин, плацентарный лактоген, плацентарная щелочная фосфатаза, трофобластический бета-глобулин (ТБГ) и другие [Н.Т. Молдогазиева, 2006; М.Б. Ыицветов, 2003; Д.Д. Петрунин,1988; Ю.С.Татаринов, 1988-2003; Л.В. Посисеева и соавт., 2004; А.А.Терентьев, 1990, 2006; Duc-Goiran at al., 2006; R.F.I-Iarrison, S.Biswas, 1980]. He менее интересными с позиций биологической роли и диагностического значения при беременности являются белки материнского происхождения, секретируемые в кровь. К этой группе белков относится, прежде всего, минорный белок сыворотки крови - связанный с беременностью альфа2-гликопротеин (СБАГ) [Ю.С. Татаринов и соавт., 1970; Н. Bohn, 1972; R. liof-mann at all., 1972; W.H. Stimson, 1972; W. G.N. Straube, 1972; Than, I.F. Csaba, D.G. Szabo, 1974].
В 1960 году Hirschfeld и Soderberg описали два самостоятельных антигена в дополнительной фракции, выявленной Smithis еще в 1959 г. при элек-трофоретическом разделении крови беременных женщин и названной им , «зоной беременности». Этими антигенами оказались связанный с беременностью альфа2-гликопротеин или alfa2-pregnancy associated glycoprotein (СБАГ или a2-PAG) и трофобластический бета-глобулин, он же trophoblastspecific beta-glycoprotein (ТБГ или TSG).
Белки беременности с момента их обнаружения и описания многими авторами в конце 60-х — начале 70-х годов прощлого века остаются в центре внимания медиков, биологов, химиков, так как до настоящего времени сведения об их структуре и свойствах остаются неполными и многие вопросы нуждаются в уточнении.
Анализ накопивщихся литературных данных о СБАГ нередко свидетельствует об их разноречивом характере, что не позволяет сделать окончательного вывода о месте синтеза, биологической роли и 101инической значимости этого белка [А.В. Афанасьева и соавт., 1976; Л.Г. Баженова, 1987; К. Bauer, 1986; G. Birkenmeier at al, 1989; S.M. Petersen at al, 1990; P. Maiynen at al, 1993; Н. Nielsen at al, 1993; R.F. Arbelaez at al, 1993; Hofmann, R., 1972, A. Philip at al, 1994; K. Guruprasad at al, 1996; B.F. Jr. Bebo, G.S. Dveksler, 2005]. Однако несомненно то, что СБАГ является очень важным звеном в формировании биологических взаимодействий в системе мать-плод-плацента и реакции организма на воспаление [12, 13, 30, 88, 135].
С позиций вышеизложенного уточнение ряда свойств и формирование целостного представления об этом белке является целесообразным и своевременным.
Цель исследования. Назлчно обосновать теоретические положения о свойствах и биологической роли минорного белка сыворотки крови - связанного с беременностью альфаг-гликопротеина, а также его клиническое применение в качестве диагностического теста для улучшения оценки течения беременности и воспалительного процесса.
Для достижения цели были поставлены следуюш,ие задачи: 1. Определить и уточнить физико-химические свойства СБАГ.
2. Выявить наличие и выраженность возможных межмолекулярных взаимодействий СБАГ с некоторыми белками сыворотки крови. , 3. Провести сравнительный анализ аминокислотного состава СБАГ и белков крови, участвующих в межмолекулярных взаимодействиях.
4. Разработать на основе результатов изучения физико-химических свойств новые подходы к получению высокоочищенных препаратов СБАГ для экспериментальных исследований и приготовления компонентов иммунохимических тест-систем.
5. Определить локализацию и возможное место синтеза СБАГ методом иммунофлюоресцентного анализа тканей различных органов и выявить изменение накопления СБАГ в малигнизированных тканях.
6. Изучить распределение СБАГ в биологических жидкостях организма человека и обезьян.
7. Провести параллельное изучение иммуномодулирующей активности СБАГ и других белков, ассоциированных с беременностью, в эксперименте ш vivo.
8. Установить уровень СБАГ в крови здоровых лиц и зависимость его продукции от возраста и пола.
9. Оценить клиническое значение иммунохимического теста на СБАГ при физиологически протекающей и осложненной беременности.
10.Установить диагностический диапазон применения теста на СБАГ при воспалительных и онкологических заболеваниях.
11.Сравнить продукцию СБАГ с другими молекулами, обеспечивающими физиологические и патогенетические процессы в клетке и организме при беременности и воспалении.
Научная новизна и теоретическая значимость исследования Исследование в значительной степени носило поисковый характер, что определило закономерную научную новизну в получении оригинальных данных по физико-химическим свойствам, определении подходов к установлению места локализации или синтеза, установлении патогенетического значения и диагностического диапазона продукции минорного альфа2-гликопротеина, связанного с беременностью.
Впервые выявлены и обоснованы межмолекулярные взаимодействия СБАГ с другими белками сыворотки крови, что, вероятно, связано с его функциональным предназначением, и отмечено изменение физико-химических характеристик нативного белка, обусловленное этими взаимодействиями.
Впервые получены результаты сравнительного анализа аминокислотного состава и последовательности СБАГ и МГ, позволяющие предположительно указать радикалы, обеспечивающие межмолекулярные взаимодействия СБАГ. Впервые иммунофлюоресцентными исследованиями показано повышение концентрации СБАГ в тканях эндометрия и толстого кишечника при и малигнизации.
Проведена сравнительная оценка иммуносупрессивных свойств СБАГ с другими белками беременности (ТБГ и АФП) и показана зависимость концентрации СБАГ в сыворотке крови матери не только от сроков и характера течения беременности, но и от уровня ТБГ, также обладающего иммуносу-прессивным действием.
Установлены параллели в продукции СБАГ и некоторых биологически активных компонентов гомеостаза, а именно: иммуноглобулинов, интерлей-кинов, маркера апоптоза.
Показано изменение продукции СБАГ в зависимости от характера и степени выраженности воспалительного процесса при разных локализациях.
Практическая ценность и внедрение результатов исследования Предложен рациональный метод одновременного выделения СБАГ и двух других белков, имеющих с ним межмолекулярные связи (МГ и ТБГ).
Этот метод позволяет экономить исходный биоматериал, реактивы, временные и финансовые ресурсы. Полученные белковые препараты могут быть использованы для научных исследований и практического применения.
Разработан метод иммуноферментного определения уровня СБАГ в биологических жидкостях организма с формированием опытного образца набора ИФА на СБАГ на производственной линии. Составлена инструкция по применению сформированного набора реагентов для ИФА-СБАГ. Обоснованы практические рекомендации по применению иммунохимического теста на СБАГ, которые могут быть направлены на улучшение диагностики течения беременности и воспалительного процесса.
Разработаны способы определения воспалительного заболевания и оценки течения беременности, рассчитан коэффициент иммунологической адаптации системы мать-плод-плацента, основанный на взаимозависимости уровня двух белков беременности, обладающих идентичной иммуномодули-рующей активностью, и позволяющий в динамике оценивать характер протекающей беременности. Разработки защищены патентами РФ. Результаты исследований внедрены в практику МУЗ «Клинический родильный дом» г. Астрахани, а таюке используются в научной и практической работе кафедр теоретического и ютинического профиля ГОУ ВПО АГМА: биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики, медицинской биологии и генетики, акушерства и гинекологии, педиатрии, госпитальной терапии с курсом функциональной диагностики, пропедевтики внутренних болезней с курсом ревматологии, хирургии, урологии.
Внедрение практических результатов диссертации может быть распространено на все лечебные учреждения акушерско-гинекологического, педиатрического и терапевтического профиля на федеральном уровне.
В 2007 и 2008 годах новые способы и иммунохимические тест-системы для лабораторной диагностики воспаления, течения беременности и оценки состояния новорожденных, включавшие результаты данного исследования, были удостоены 2 золотых медалей на VII и VIII Московских международных салонах инноваций и инвестиций. В 2007 году инвестиционный проект «Новые иммурюхимические тест-системы для лабораторной диагностики осложненного течения беременности, гипоксии и деструктивных процессов» был представлен на выставке: «Инновационные достижения России» XI Петербургского международного экономического форума.
Основные положения, выносимые на защиту 1. СБАГ, имеющий аналог у обезьян, является не строго гравидарным, а минорным сьшороточным белком, частота выявления и уровень в крови доноров и здоровых детей которого зависит от пола, возраста и группы крови.
Продукция СБАГ возрастает не только при беременности, но и при целом ряде патологических состояний: воспалении, опухолях, системных заболеваниях у взрослых и детей. Причем, в некоторых случаях (ревматизм, гломеру-лонефрит, бронхиальная астма и другие) уровень СБАГ достигает величин, сопоставимых с уровнем этого белка при беременности (до 100 и более мг/л).
2. СБАГ участвует в поддержании иммуногомеостаза матери и плода, а таюке больных воспалительными, аутоиммунными и опзосолевыми заболева-ниями, что подтверждено полученными результатами эксперимента in vivo по иммуносупрессивному эффекту СБАГ, связи его продукции с другими биологически активными компонентами гомеостаза, а именно: с иммуноглобулинами, интерлейкинами, маркером апоптоза.
3. Сывороточный СБАГ, обладая высокой молекулярной массой, практически не выявляется в других биологических жидкостях. Обнаруженная иммунофлгаоресцентным методом его локализация на лимфоцитах и в тканях некоторых органов с увеличением содержания СБАГ в плаценте и малигни-зированных клетках позволяет предположить наличие факторов, активирующих синтез СБАГ для реализизации его иммуномодулирующих свойств, наиболее выраженных при беременности и опухолях.
4. При выделении и очистке СБАГ из сыворотки крови следует учитывать возможность его мелсмолекулярных взаимодействий с некоторыми другими белками крови, например, с МГ, приводящих к изменению распределения этих белков на разделительных средах (эти взаимодействия снимаются воздействием детергентов), а таюке сродство СБАГ к гормональным компонентам сорбентов, содержащим эстрогены.
5. Использование теста на СБАГ в оценке течения беременности основано на достоверных изменениях концентрации СБАГ в зависимости от сроков нормально протекающей беременности и развития осложнений беременности. Его диагностическая значимость возрастает при одновременном определении СБАГ с ТБГ, так как синтез этих белков, обладающих идентичной иммуномодулирующей активностью, взаимозависим.
6. Применение иммунохимического теста на СБАГ позволяет выявлять воспаление, в том числе скрытые формы, вне зависимости от локализации и на всем протяжении процесса. Особенно полезен тест в оценке эффективности лечения при многих нозологических формах воспалительных заболеваний сердца, легких, почек и других органов.
Апробация работы Материалы диссертации были доложены на тематических и итоговых научно-практических конференциях сотрудников ГОУ ВПО АГМА и врачей Астраханской области, а также на российских и международных форумах: V Всесоюзном биохимическом съезде (Москва, 1986); конференции «Биохимия - медицине /молекулярные механизмы формирования патологических состояний/» (Ленинград, 1988); Всесоюзном симпозиуме с международным участием «Патогенез хронического воспаления» (Новосибирск, 1991); Всероссийской научной конференции «Современные проблемы диагностики и лечения хронических неспецифических заболеваний легких у детей» (Москва-Нальчик, 1991); 1-st International Conference on Immunoreabilitation (Sochi, 1992); 1-M съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992); of the Meetings FEBS (Federation of European Biochemical Societies) -1993 (Stocklюlm), 1995 (Basel); of the Meetings ISOBM (International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine) - 1989 (Freiburg), 1990 (Moscow), 1998 (Umea, Sweden), 2000 (Munich), 2004 (Helsinki), 2005 (Greece); 5-й научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге, 2001»; Европейском конгрессе по астме и IV съезде клинических иммунологов и аллергологов СНГ (Москва, 2001); 3-rd Central European Conference on Human Tumor Markers. - Cechtuma (Praga, 2001); Международной научно-практической школе-конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет» (С-Пб. - 23-26 июня 2002); 3-й научной конференции и школе-семинаре для молодых ученых «Белки-маркеры патологических состояний» (Астрахань-Москва, 2003); XVII Всемирном конгрессе по астме и V съезде иммунологов и аллергологов СНГ (С.-Пб., 2003); II Европейском конгрессе по Астме и I Международном конгресс «Здоровье и лекарство» (Тбилиси, Грузия, 2004); научно-практических конференциях и школах-семинарах для молодых учёных с международным участием «Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань-Москва, 2004, 2006); VI съезде иммунологов и аллергологов СИГ (Москва, 2006); II и IV международных ежегодных конференциях «Проблемы диагностики и лечения рака молочной железы» (С.-Пб. - 2005, 2007); IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликована 91 научная работа, из них 16 в рекомендуемых ВАК изданиях, 2 патента.
Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 253 страницах компыотерного текста, состоит из оглавления, введения, обзора литературы, шести глав собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций, 2 приложений, библиографического указателя, включающего в себя 302 литературных источника: 105 отечественных и 197 иностранных. Иллюстративный материал представлен 29 таблицами, 36 рисунками.
Личное участие автора в получении научных результатов заключается в формировании идеи исследования, планировании и выполнении основного объема экспериментальной части работы, в разработке плана изучения клинического материала и тестировании большей части коллекций образцов биоло-гического материала обследуемых лиц, статистической обработке, анализе и интерпретации полученных результатов, В работу вошли результаты исследований, проведенных совместно с представителями клинических кафедр и научных лабораторий АГМА, РГМУ, других учебных и научных учреждений. Автор выражает благодарность всем коллегам, в соавторстве с которыми были опубликованы работы.
Современные стратегические направления изучения белков в биологии и медицине
XXI век международным научным сообществом объявлен веком биологии и информатики в связи с тем, что использование инновационных технологий привело к получению новых объемных данных о главных макромолекулах живого организма: нуклеиновых кислотах и белках, обеспечивающих основные функции живой материи - саморегуляцию и самовоспроизведение.
Протеомика, геномика и биоинформатика определяют высокую скорость накопления данных о состоянии молекулярной биологии и биохимии белка. Новые сведения породили, в свою очередь, обоснованные прогнозы и, одновременно, неоправданную эйфорию по поводу быстрой расшифровки молекулярного патогенеза, диагностики и лечения всех болезней.
Подобная ситуация, на наш взгляд, требует критического анализа накопленной в течение длительного времени и появившейся в последние несколько лет информации о значении белков в организме и подходах к их изучению.
Стремительное развитие геномики началась в 1991 году проектом «Геном человека», который, по сути, завершился уже через 10 лет. В апреле 2000 года был представлен в практически окончательном варианте непрерывный сиквенс генома человека и была создана первая структурная база данных по инвентаризации генов человека и около 50 видов микроорганизмов и растений. Эти данные важны для развития фундаментальной биохимии, молекулярной биологии и многих прикладных наук, связанных с геномом [9, 108, 111, 161, 162, 179].
На современном этапе развития наук о жизни биоинформатика становится незаменимым звеном из-за накопления огромного объема информации. Она позволяет провести анализ биологических текстов с построением соответствующих структур макромолекул, предсказанием их функции и созданием новых лекарственных препаратов, основанный на эксперименте, а также определяет путь от генов к лекарствам через структуру макромолекул в компьютере (insilico) взамен эксперимента.
Задача биоинформатики - сравнить аминокислотную последовательность белка, транслированную из последовательности гена, с библиотекой последовательностей и определить наличие или отсутствие аналогов. При наличии подобных образцов можно предсказать с различной степенью точности и структуру, и функцию этого белка. Растущие базы данных этих библиотек используются также в сравнительном моделировании трехмерной структуры белков, что приводит к значительному ускорению процесса достижения конечного результата по сравнению с классическими методами биохимии [155, 205].
22 февраля 2000 года на заседании Президиума РАН председатель научного совета РАН по проблеме «Геном человека» член-корреспондент РАН Л.Л.Киселев [48] сообщил о последних достижениях мировой геномики, в котором было отмечено, что помимо научных задач по формированию банка данных геномов различных организмов имеются практические задачи: развитие молекулярной и ДНК-диагностики.
Помимо полимеразной цепной реакции появились новые подходы -создание диагностических полей. Плотность таких ячеек-полей составляет около 1 млн точек на 1 см , где каждая точка - отдельная проба. На такой биочип можно поместить сразу весь геном той или иной живой системы. Это, по сути дела, современная нанотехнология. Современные ДНК-поля уже сей час содержат до 10 тыс. генов на 1 чип [109, 112, 117, 177, 184, 224, 248, 258, 302].
Медицинская геномика позволяет проводить генодиагностику заболеваний и искать подходы к их лечению методами генотерапии [101]. В результате картирования всех двадцати трех хромосом человека стали известны десятки генов, которые ответственны за развитие наследственных заболеваний, в том числе контролирующие продолжительность жизни клетки и регулирующие опухолевый рост.
С позиций оценки функционирования генома была создана новая концепция в медицине о разделении всех заболеваний на два класса: наследственные болезни (от 2 до 5%), являющиеся следствием передачи от родителей к потомству дефектных генов, и ненаследственные заболевания, которые составляют 95 - 98% всех болезней человека и поэтому называются социально значимыми. Во второй группе, в отличие от первой, нарушается регуляция экспрессии нормального гена. [9].
Однако последствия закодированной в геноме ошибки проявляются не на уровне самого гена, а на уровне белка. В немногочисленных работах, выполненных с целью сопоставить карту мРНК с белковой картой в тех же самых клеточных системах, было показано, что строгой корреляции между информационной структурой - геном и реально работающим белком не существует [ПО, 122, 173].
Следовательно, геномный анализ - анализ экспрессии генома на уровне мРНК и реально существующие белковые карты биологических систем отражают различные свойства этих систем и несут, по сути, или комплементарную или, возможно, исключающую информацию. Это определило быстрое развитие протеомики (PROTEins и genOMe, 1995), исследующей совокупность всех белков, экспрессируемых клеткой, тканью, организмом.
Биохимические методы исследований
В качестве высаливающего агента был выбран широко распространенный для этих целей сульфат аммония - (NH SO имеющий ряд важных преимуществ перед другими аналогичными реактивами вследствие большого заряда его аниона, определяющего высокую растворимость соли, мало зависящую от температуры и рН (за исключением очень высоких значений) раствора. Белковый осадок 2-ЗМ раствора (NH SC стабилен в течение многих лет при хранении в холодильнике. Высокая концентрация этой соли предотвращает действие бактерий и протеолиз под действием находящихся в белковой смеси ферментов.
Для высаливания применяли твердую соль (ч.д.а.), предварительно перекристаллизованную, реже - насыщенный раствор сульфата аммония (при работе с ретроплацентарной кровью). Насыщенный раствор готовили из перекристаллизованного сульфата аммония, подщелачивая его до рН-8,0 раствором аммиака.
Высаливание с помощью кристаллической соли осуществляли добавлением ее в сыворотку крови беременных женщин небольшими порциями при тщательном перемешивании. Необходимое количество твердой соли, добавляемой к исходному биоматериалу, рассчитывали по формуле:
100-0,3S2 гдє 7 - количество сульфата аммония в граммах, который надо добавить к 1 л раствора со степенью насыщения Si, чтобы получить раствор со степенью насыщения S2 .
При использовании насыщенного раствора сульфата аммония требуемый объем рассчитывали по другой формуле:
После растворения последней порции соли перемешивание продолжали в течение 10-30 минут до достижения полного равновесия между растворенными и агрегированными белками. Раствор экспонировали 2-3 часа при температуре 24 С и затем центрифугировали при 5000g в течение 20 минут. Осадок, содержащий исследуемые белки, растворяли в 0,05М натрий-фосфатном буфере, рН 7,4, при этом объем буфера превышал объем осадка не более чем в 2 раза. Полученные концентрированные белковые растворы хранили при -18оС [93].
Вновь растворенный осадок содержал значительное количество сернокислого аммония, который удаляли перед следующей стадией очистки. диализом или гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-15.
Фракционирование риванолом
По данным Mody N. [232], с помощью риванола можно вывести в осадок анодную часть спектра сывороточных белков (альбумины, альфа1;2- и частично бетаг глобулины). Причем, наиболее активно осаждаются глико-протеиды.
К 1 объему сыворотки крови приливали 2,5 объема 0,5% риванола. После двух часов отстаивания и последующего центрифугирования надосадоч-ную жидкость сливали, а к осадку добавляли 2% раствор хлорида натрия (0,1 часть от первоначального объема). Смесь опять выдерживали в течение 2 часов. Риванол, взаимодействуя с хлористым натрием, уходит в осадок, а белки остаются в растворе в концентрированном состоянии. Рекомендуемые условия: рН раствора 6,25; температура - 20С.
Метод препаративного электрофореза в агаре
Для препаративного электрофореза, имеющего те же принципы, что и аналитический [25] использовали камеру, сконструированную таким образом, что в ней для разделяемых веществ отсутствует пристеночный эффект.
Камеру заливали 1% агаром, приготовленным на веронал-мединаловом буфере, рН 8,6. Перед заливкой камеры в стартовые участки помещали трубки, на месте которых после извлечения из застывшего агара образуются туннели для разделяемой смеси белков (в нашем случае, сыворотки крови). Общий объем вносимого материала составлял 15-17 мл. Условия электрофореза: напряжение тока 150-200 в, сила тока - 45-50 ам. длительность разделения — 12-18 часов. Маркерами скорости разделения служили красители: пиронин и синий Эванса.
Жидкость, извлеченную из туннелей, обозначали как стартовые фракции. Затем агар разрезали на равные полоски 8-10 мм шириной, последовательно нумеровали. Извлекали белки из агара путем замораживания и оттаивания с последующим центрифугированием при 3000-5000 об/мин. Фракции, содержащие нужный антиген, выявляли тестированием с соответствующей моноспецифической антисывороткой. Контроль присутствия балластных белков также осуществляли иммуиохимическим методом с поливалентной антисывороткой к белкам плазмы крови доноров. При необходимости элюи-рованные фракции концентрировали.
Физико-химические свойства СБАГ
Для уточнения природы СБАГ использовали окраску на белки, углеводы и липиды. Перед окрашиванием иммуноэлектрофореграммы тщательно отмывали и высушивали.
Окраску на белки проводили раствором амидового черного в 7% уксусной кислоте. Соответственно раствором для промывания являлся тот же раствор уксусной кислоты. Длительность окраски 3 часа. На отмытом препарате линия преципитации СБАГ была четко окрашена. Позднее использовали другие красители: бромфероловый синий в смеси этанол-вода-уксусная кислота в объемном соотношении 50 : 45 : 5; кумасси яркий синий R-250 в конечной концентрации 0,1% в смеси метанол-уксусная кислота-вода.
Наилучшие результаты при выявлении гликопротеинов получили при использовании реактива «холодный Шифф», приготовленном на основном фуксине для фуксинсернистой кислоты.
Окраска по методу Шифф-йодная кислота: 1. обработка йодной кислотой - 10 мин. 2. промывка в проточной воде - 10 мин. 3. окраска реактивом Шиффа - 3 мин. 4. троекратная промывка сернистой водой по 2 мин. Линия преципитации СБАГГ во всех опытах давала розовое окрашивание. Липидные компоненты раствором судана черного в 60% этаноле в СБАГ обнаружены не были.
Четкое а положительная реакция на реактив Шиффа и отрицательная на судан черный позволяют характеризовать СБАГ как гликопротеип.
Изучение СБАГ методами специфической окраски на выявление возможной ферментативной активности позволяет предположить, что он не обладает следующей активностью: - пероксидазной (1,5% раствор бензидина в метаноле); - эстераз эфиров карбоновых кислот (бета-нафталацетат в ацетоне на фосфатном буфере с рН 7,8. перед инкубацией добавляли прочный синий В.); - щелочной фосфатазы (бета-нафтилфосфат, вода и мединаловый буфер, рН 8,9, проявителем был также синий В); - ЛДГ-активностыо (метод Пирса, инкубационная среда: субстрат -Д-лактат натрия, фосфатный буфер, соль тетразолия).
В качестве исследуемого материала использовали сливную сыворотку беременных женщин. Образцы сыворотку объемом 5 мл подвергали нагреванию при 50, 60 , 70 и 80 С в течение 20 минут. Исходный титр СБАГ сохранялся при нагревании до 60 С.
После температурного воздействие в 60 С, белок, по-видимому, меняет свою конформацию таким образом, что только частично сохраняются детерминантные группировки и линии тест-системы «расплавляются», не доходя до лунки с антигеном, но не отклоняются. Этот феномен мы впервые отметили при изучении ТБГ. После воздействия 60 СБАГ утрачивает свои антигенные свойства, а после 70 воздействия СБАГ полностью денатурируется. То есть, он проявляет свойства термолабильного белка.
Также в смеси с другими белками сыворотки крови беременных исследуемый белок был подвергнут воздействию органическими кислотами: сульфосалициловой и трихлоруксусной. При добавлении равных объемов 10% раствора трихлоруксусной и 20% раствора сульфосалициловой кислот СБАГ теряет свои нативные свойства: выпадает в осадок и не растворяется в первоначальном растворителе.
Приступая к изучению физико-химических свойств СБАГ, мы располагали данными о том, что дуга его на иммуноэлектрофореграмме локализуется в зоне альфаг-глобулинов и немного смещена к траншее с антисывороткой, но менее чем ТБГ [70], рис. 3.
1 Определение относительной электрофоретической подвижности СБАГ было проведено классическим методом в агаре «Дифко», в агарозе «Calbiochem» [292].
Так как перемещение белка в геле происходит счет заряда и за счет электроосмотического потока жидкости внутри носителя, для установления точки нулевой подвижности (точки отсчета) в качестве электронейтрального вещества был использован декстран (м.в. 40000). 2% раствор декстрана подвергали электрофорезу одновременно с сыворотками крови доноров и беременных женщин. Условия и длительность электрофореза обычные.
Фракционирование осаждающими агентами
Для изучения подходов к выделению и очистке СБАГ было изучено его отношение к ряду осаждающих агентов. По описанному во 2 главе алгоритму сначала определяли оптимальные условия высаливания СБАГ сульфатом аммония - (NH.i SCXi. Подробно было изучено поведение белка в последовательных растворах соли в конечной концентрации от 10 до 55% (табл 4).
Определение СБАГ в осадке и надосадочной жидкости проводили титрованием со стандартной тест-системой.
СБАГ появляется в осадке уже на первом этапе, но основная его часть осаждается до 35% насыщения раствора сульфатом аммония (табл 4, рис 13).
Если последующие задачи требуют максимального освобождения от других белков, можно пренебречь небольшим объемом очищаемого белка, который оказывается в осадке при 40% насыщения. Для рационального использования исходного материала, мы пользовались последним вариантом.
Осадок для накопления большого объема в препаративных целях хранили в холодильнике. Еще ранее нами при работе с ТБГ было замечено, что после длительного хранения в сульфате аммония при + 4С и последующего растворения осадка в физиологическом растворе или буферном растворе, белок менял свою подвижность в электрофорезе, но сохранял антигенные свойства. СБАГ оказался более устойчивым к подобному воздействию соли, хотя в некоторых случаях также отмечалось слабо выраженное изменение линии и подвижности СБАГ при электрофоретическом анализе белков осадка.
На иммуноэлектрофореграмме осадка кроме СБАГ из интересующих нас индивидуальных белков обнаруживали МГ, ТБГ, иммуноглобулины.
Для последующей работы осадок, содержащий СБАГ, ТБГ и МГ, растворяли в 0,05 М натрий-фосфатном буфере с рН 7,4 в объеме, не превышающем исходный объем осадка не более чем в 2 раза. Растворенный осадок содержал значительное количество сульфата аммония, который удаляли перед следующим этапом очистки диализом против буферного раствора, необходимого для следующего этапа очистки белков. Такой вариант диализа позволяет решить сразу две задачи: удалеть соли сернокислого аммония из растворенного осадка и создать в белковом растворе соответствующие ионную силу, ионный состав и рН.
Фракционирование риванолом
Как было указано в главе 2 риванол целесообразно использовать для осаждения из раствора гликопротеинов анодной части спектра белков крови. Исследованию были подвергнуты индивидуальные образцы, а также пул сыворотки крови рожениц.
При риваноловом фракционировании с рН раствора 6,25 и температурой 20-23С СБАГ полностью выходил в осадок в отличие от БГГ, две трети которого остаются в надосадочной жидкости. Следовательно, этот метод с учетом его простоты и экономической доступности можно применять как на начальных, так и промежуточных этапах выделения изучаемого белка.
В риваноловом осадке белки хорошо сохраняли нативные свойства аналогично их состояния в осадке сульфата аммония.
Осаждение этанолом и полиэтиленгликолем
Сыворотку крови беременных женщин в разведении 2:1 с ацетатным буфером, рН 4,7, смешивали с раствором этанола в объемах для достижения конечной концентрации от 50 до 10% при условиях: рН раствора = pi белка, экспонирование в течение 30 при комнатной t или в холодильнике с последующим центрифугированием при 3000 g 15 . При 50% концентрации этанол полностью выводит СБАГ в осадок вместе с многими глобулинами. При этом часть ТБГ остается в растворе. При 40% - оба белка присутствуют как осадке, так и в надосадке. При 10% - осаждалась незначительная часть белка, большая — оставалась в надосадке.
