Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние годы интенсивное развитие получило новое научное направление в биохимии, касающееся изучения факторов гуморального иммунитета - естественных антител (EAT). Эти иммуноглобулины (lg) продуцируются нормальными В-клетками в отсутствии антигенной стимуляции.
Обобщенный анализ накопленных к настоящему времени экспериментальных данных в отношении EAT [Coutinho A. et al. 1995] дает представление об основных биохимических характеристиках и некоторых отличительных особенностях этих AT. Установлена принадлежность EAT к основным классам иммуноглобулинов - М, G, А. Репертуар таких антител продуцируется популяцией В-лимфоцитов незрелого фенотипа и кодируется зародышевой линией VH и VL - генов ограниченного числа семейств с незначительным числом мутаций, что обеспечивает их конститутивный синтез в физиологических условиях. Для этих AT, как правило, характерна полиреактивность и меньшая аффинность, по сравнению с антителами, индуцированными активной иммунизацией. EAT способны принимать участие в широком спектре физиологических реакций организма: от иммунного регулирования, обеспечения внутреннего гомеоотаза, неспецифической барьерной роли против чужеродных патогенных антигенов до транспортной функции и модуляции действия биологически активных веществ.
Высокая биологическая активность эндогенных низкомолекулярных соединений группы простагландинов (ПГ), являющихся универсальными медиаторами различных физиологических процессов, послужила основанием для проведения исследований по выявлению и изучению EAT к этим соединениям. Можно ожидать, что связывание EAT с такими биорегуляторами будет оказывать влияние на физиологические реакции организма.
Направленный поиск AT к простагландинам А, В, F2a, Е2 и D2 по связыванию радиоактивно меченных ПГ с lg сыворотки здоровых доноров и больных СПИД не выявил различий в уровнях связывания по сравнению с 4юном, что послужило основанием для вывода об отсутствии EAT к ni~[Knazek R.A., Raphael М., Costa J. 1986].
С другой стороны, были идругие попытки выявления EAT к простагландинам. Так, был разработан твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), при проведении которого в качестве антигена (АГ) использовали конъюгат бычьего сывороточного альбумина (БСА) с ковалентно присоединенными молекулами простагландина F2a (ПІТг,,) [Полевая О.Ю. и др. 1986]. Применение данного метода позволило обнаружить в сыворотках крови здоровых людей присутствие IgG к ПІТ2а [Полевая О.Ю. и др. 1988]. Кроме того, было показано, что у пациентов, страдающих гипертонической болезнью (ГБ) и инфарктом миокарда (ИМ) уровень таких lg отличался от нормального и в некоторых случаях коррелировал с тяжестью патологического процесса и эффективностью проводимой терапии. В результате проведенных исследований было установлено наличие спонтанного синтеза естественных
2 антител к эндогенному низкомолекулярному соединению простагландину F2a. Присутствие таких AT в сыворотках здоровых доноров свидельствовапо о том, что продукция анти-ПГР2а-АТ является нормальным физиологическим процессом. В совокупности с известным фактом о вазоконстрикторном действии nrF2a, полученные данные позволяли сделать вывод, что естественные антитела к nrF2cl выступают как антагонисты этого медиатора и, нейтрализуя его патогенетическое действие, обеспечивают защитный эффект при ГБ и ИМ [Крупник В.Е. и др. 1987; Полевая О.Ю., Крупник В.Е. 1988].
Однако, в проведенных исследованиях связывание lg с конъюгированным антигеном не ингабировалось свободным nrF2a, что не позволило авторам изучить аффинность и специфичность выявляемых IgG к nrF2a, исследовать связывающую способность F(ab')2 -фрагментов lg и получить ответ на важный вопрос об антительной природе анти-ПГР2а-Ід.
Учитывая актуальность рассматриваемой научной проблемы как для теоретических аспектов биохимии и иммунологии, так и для практической медицины, в настоящей работе была предпринята попытка выявления и изучения естественных антител к низкомолекулярному эндогенному биорегулятору простагландину F2„, который является медиатором различных физиологических процессов, обладающим высокой биологической активностью.
Цепь и задачи исследования. Цель данной работы заключается в изучении биохимических свойств естественных антител к простагландину F2„ на основе использования различных вариантов твердофазного иммуноферментного анализа.
Задачи исследования, определенные в соответствии с поставленной целью:
синтезировать конъюгированные антигены простагландина F2a на белковом носителе, содержащие в своем составе различное количество ковалентно связанных остатков простагландина F2a, а также получить макромолекулярный сорбент для выделения антител к; простагландину F2„ из сыворотки крови;
выделить с помощью аффинной хроматографии из сыворотки крови здоровых доноров и неиммунизированных животных иммуноглобулины, связывающие простагландин F2a;
определить содержание в сыворотке крови и изотипический состав аффинно очищенных иммуноглобулинов к простагландину F2a, исследовать их основные биохимические свойства - специфичность, аффинность и участие F(ab')2- фрагментов в связывании с простагландином F2a;
исследовать зависимость синтеза естественных антител к простагландину F2« при увеличении его концентрации в организме, используя модельные эксперименты на животных;
провести сравнительный анализ уровней естественных антител к простагландину F2<, в норме и при различных заболеваниях человека, связанных с нарушением обмена этого биорегулятора, для оценки диагностической значимости такого тестирования.
Научная новизна работы. Из сыворотки крови практически здоровых людей 1 нормальных животных с помощью аффинной хроматографии выделены иммуноглобулины к шкомопекулярному эндогенному соединению простагландину F2t„ установлен их ізотипический состав и количественное содержание в сыворотке крови, исследованы биохимические характеристики иммуноглобулинов, связывающих простагландин F2a. изучение свойств этих иммуноглобулинов позволило установить их принадлежность к ютинным антителам, специфично связывающим простагландин F2a своим активным центром Р(аЬ')2-фрагментом, причем такое связывание характеризуется определенной константой іффинности (от 1x104 до 6x106 М"1).
Обнаружено увеличение содержания антител к простагландину F2a при инфаркте /іиокарда, а также при интегументной и системной формах красной волчанки. Показана (елесообразность определения антител к простагландину F2et при указанных заболеваниях, ібусповленная значительным увеличением выявления количества пациентов с нарушением уморального иммунитета.
Практическая ценность работы. Полученные в настоящей работе результаты по «явлению уровня антител к простагландину F2a используются с 1991 г. в Нижегородском иучно-исследовательском кожно-венерологическом институте в целях дополнительного іиагностического тестирования и мониторинга иммунного статуса больных красной юлчанкой. Определение содержания анти-ПГР2„-антител применяется с 1992 г. в НИИ юкарственных средств (г. Купавна) при изучении влияния на организм человека препаратов, израбатываемых для лечения заболеваний, связанных с нарушением обмена іростагландина F2o. Анализ динамики содержания антител к простагландину F2a применяется : 1995 г. на кафедре кардиологии Пензенского института усовершенствования врачей для [Ополнительной оценки эффективности проводимой терапии при инфаркте миокарда у лиц с сраженными нарушениями иммунореактивности организма. Основные положения, выносимые на защиту.
В сыворотке крови здоровых людей и нормальных животных обнаружено наличие естественных антител к эндогенному низкомолекулярному биорегулятору простагландину F2a с помощью метода твердофазного иммуноферментного анализа. !. Исследованы биохимические свойства аффинно очищенных естественных антител к простагландину F2oi, определено их количественное содержание в сыворотке крови, изучена специфичность, рассчитана константа аффинности, установлена их связывающая способность с антигеном на субмолекулярном уровне. :. Проведен сравнительный анализ содержания антител к простагландину F2a в сыворотке крови здоровых доноров и больных сердечно-сосудистыми и аутоиммунными заболеваниями. Показано, что увеличение уровня простагландине F2o в организме вызывает активацию синтеза естественных антител к нему.
Апробация работы. Основные материалы и положения диссертационно; работы доложены и утверждены на межлабораторной конференции ВНИИ Биотехнологиі (протокол №42 от 19 ноября 1990 года.).
Результаты исследований также были доложены на:
Всесоюзной конференции "Современные направления создания медицински: диагностакумов" (Москва, 1990 год);
Российском конгрессе "Национальные дни лабораторной медицины России" (Москва, 1999 год);
Международном конгрессе "Современные методы диагностики и лечения аллергии астмы и иммунодефицитов" (г. Тбилиси, 1999 год).
Международном конгрессе "Биокатализ 2000" (Москва, 2000 год).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ, список которых приведен і конце реферата.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзор; литературы, материалов и методов исследований, результатов работы и их обсуждения (і подглав), выводов и списка литературы (223 источника). Работа содержит 9 таблиц и 1 рисунков. Материалы изложены на 100 страницах машинописного текста.
