Введение к работе
Актуальность проблемы
Проблема предотвращения угрозы биологической безопасности в настоящее время является приоритетной не только для России, но и для мирового сообщества в целом. Важнейшим направлением по обеспечению биологической безопасности является развитие новых методов диагностики биопатогенов. Одной из самых серьезных угроз является биологический терроризм, который представляет собой использование биологических агентов для нанесения ущерба жизни и здоровью людей. Центральным звеном в системе безопасности человека является оценка риска для здоровья воздействия того или иного агента, оценка его содержания в объектах окружающей среды. К основным современным источникам биологической опасности относятся патогенные микроорганизмы, вирусы, микроскопические грибы и продукты их жизнедеятельности.
Токсические продукты микроорганизмов Vibrio cholerae и энтеротоксигенных Escherichia coli обладают высокой активностью и чрезвычайно токсичны для человека. Эти токсины определяют симптомы таких заболеваний, как холера и «диарея путешественников». Методы диагностики этих заболеваний базируются как на основе классических схем микробиологического анализа, так и на иммунохимических и генно-инженерных методах, обладающих высокой чувствительностью и специфичностью. Для обнаружения и мониторинга токсинов в лабораторных условиях используют биологические тесты на животных и клеточных культурах, иммунохимические методы, включающие непрямой и конкурентный иммуноанализ, иммупреципитацию, иммунофлуоресцентный анализ или ИФА.
В условиях, требующих определения на присутствие нескольких токсинов в значительном количестве опытных образцов, используются методы мультиплексного анализа. К их числу относятся 2-х мерные и 3-х мерные биочипы, позволяющие проводить параллельное определение нескольких токсинов на одной поверхности и мультиплексный иммунофлуоресцентный анализ (МИА), сочетающий проточную флуориметрию и иммунохимический «сэндвич»-анализ на основе моноклональных антител. Именно этот метод позволяет проводить одновременную детекцию различных токсинов (исчисляемых десятками) в одной анализируемой пробе. Однако формат этого метода требует использования моноклональных антител (как связывающих, так и детектирующих) к токсинам, не проявляющих перекрестной активности ни с одним из других токсинов, присутствующих в пробе. Это требование усугубляется при исследовании в одном образце токсинов, обладающих значительной гомологией, как например, холерного токсина (СТ) и термолабильного энтеротоксина E. coli (LT), обладающих гомологией аминокислотной последовательности (более 80%), пространственной структуры и иммунологических свойств.
Все вышеперечисленное однозначно указывает на актуальность создания тест-системы на основе мультиплексного иммунофлуоресцентного анализа (МИА)
и и /—і rp т гр и и
для одновременной количественной детекции СТ и LT в одной анализируемой пробе.
Цели и задачи работы
Целью настоящей работы явилось получение моноклональных антител (МА) к холерному токсину и термолабильному энтеротоксину E.coli, а также разработка на их основе тест-системы для одновременной идентификации и количественной регистрации токсинов в биологических образцах.
В ходе работы были решены следующие задачи:
-
Методом гибридомной технологии получены и охарактеризованы моноклональные антитела к холерному токсину и термолабильному энтеротоксину E. coli, не обладающие перекрестной активностью;
-
Из полученных панелей моноклональных антител к холерному токсину и термолабильному энтеротоксину E. coli выбраны пары для количественного определения СТ и LT методом «сэндвич»-ИФА в формате планшета;
-
Разработана биплексная тест-система «сэндвич»-хМАР анализа с применением технологии Luminex для одновременного количественного определения холерного токсина и термолабильного энтеротоксина E. coli в одном аналите;
4. Показана пригодность разработанной тест-системы идентификации и количественного определения холерного токсина и термолабильного энтеротоксина E. coli для объектов окружающей среды и продуктов питания.
Научная новизна
Получены моноклональные антитела к двум близкородственным токсинам: холерному и термолабильному энтеротоксину E. coli, не обладающие перекрестной активностью.
Впервые разработана тест-система на основе «сэндвич»-варианта ИФА для дифференцированной детекции СТ и LT с использованием моноклональных антител в роли связывающих и детектирующих антител.
Впервые создана тест-система для одновременного количественного определения холерного токсина и термолабильного энтеротоксина E. coli в одном образце методом мультиплексного иммунофлуоресцентного анализа с применением технологии хМАР.
Практическая значимость работы
Полученные результаты дают основания тиражировать в дальнейшем разработанные тест-системы для использования их в мониторинге холерного токсина и термолабильного энтеротоксина E. coli. в объектах окружающей среды, а образцах пищевых продуктов, в воде. Определение биотоксинов необходимо в больницах для идентификации токсина, вызывающего отравление, и выбора соответствующего лечения.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 3 статьи из списка журналов, рекомендованных ВАК.
Апробация работы
Результаты были представлены на российских и международных конференциях: XXI зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2009); Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва, 2009); Научная конференция по биоорганической химии и биотехнологии «Х чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова» (Москва-Пущино, 2011)
Структура работы
Диссертационная работа изложена на 120 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, основных выводов и списка цитируемой литературы, включающего 172 ссылки. Диссертация содержит 20 таблиц и 36 рисунков.
