Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I.Обзор литературы 12
Глава 1.1. Биохимические и патофизиологические изменения при гипокинетическом и вестибулярном воздействиях на организм 12
Глава 1.2. Фармакологическая коррекция гипокинетического и вестибулярного стрессовых воздействий 30
Глава 1.3. Структурно-функциональные особенности молекул сывороточного альбумина в норме и при стрессорных воздействиях 44
ГЛАВА 2. Постановка и методы исследования 60
Глава 2.1. Постановка эксперимента 60
2.1.1. Постановка опытов in vivo 60
2.1.2. Постановка опытов in vitro 63
Глава 2.2. Методы исследования 64
2.2.1. Определение концентрации белка методом Лоури 64
2.2.2. Определение концентрации сывороточного альбумина 66
2.2.3. Определение транспортной функции сывороточного альбумина по Чёгеру 68
2.2.4. Метод определения ТБК-положительных продуктов в сыворотке крови и гомогенатах тканей 70
2.2.5. Определение суммарной пероксидазной активности 71
2.2.6. Определение проницаемости эритроцитарных мембран (осмотической стойкости эритроцитов) 72
2.2.7. Постановка диск-эликтрофореза 73
2.2.7.1. Идентификация цистеин-содержащих белков после их разделения методом ДЭФ 77
2.2.7.2. Окрашивание гелей для определения общего белкового спектра 80
2.2.8. Определение концентрации общих сульфгидрильных групп белка и небелковых соединений по Фоломееву 81
ГЛАВА 3. Результаты исследования 83
Глава 3.1. Влияние кратковременной гипокинезии на биохимии-ческие показатели сыворотки крови и гомогенатов тканей крыс ... 83
Глава 3.2. Влияние кратковременного комбинированного стрессового воздействия на биохимические показатели сыворотки крови и гомогенатов тканей крыс 98
Глава 3.3. Влияние нитроглицерина на биохимические показатели сыворотки крови и гомогенатов тканей на фоне кратковременной гипокинезии и комбинированного стрессового воздействий 109
Глава 3.4. Влияние протимозина а на биохимические показатели сыворотки крови и гомогенатов тканей на фоне кратковременной гипокинезии 134
Обсуждение результатов 143
Выводы 160
Список литературы 163
- Биохимические и патофизиологические изменения при гипокинетическом и вестибулярном воздействиях на организм
- Структурно-функциональные особенности молекул сывороточного альбумина в норме и при стрессорных воздействиях
- Идентификация цистеин-содержащих белков после их разделения методом ДЭФ
- Влияние кратковременной гипокинезии на биохимии-ческие показатели сыворотки крови и гомогенатов тканей крыс
Введение к работе
В условиях развития современного общества человек все чаще оказывается в ситуациях, которые предъявляют к его организму новые требования, согласно которым развивается новая стратегия существования, определяющая жизнь организма. Проблема изучения роли общих неспецифических адаптационных реакций в регуляции резистентности организма привлекает все большее число исследователей, несмотря на свою более чем пятидесятилетнюю историю (Баженов Ю.И., 1981; Панин Л.Е., 1984; Овсянников В.Г., 1987; Гаркави, Л.Х., Квакина Е.Б. и соавт., 1978, 1990, 2002; Зайчик А.Ш., ЧуриловЛ.П, 1999).
Стресс-реакция является необходимым звеном формирования структурного следа адаптации, без которого невозможно приспособление организма к изменяющимся условиям существования, а также выживание организма в чрезвычайных условиях (Меерсон Ф.З. и соавт., 1987, 1988; Овсянников В.Г., 1987; Пшенникова М.Г., 2001). Чрезмерная реакция на стрессор-ное воздействие приводит не к адаптации, а, наоборот, к развитию заболевания и даже к гибели организма (Пшенникова М.Г., 2001).
В современных условиях человек часто осознанно или не осознанно находится в ситуации ограничения мышечной подвижности различной выраженности, которые могут сочетаться с параллельным действием различных видов ускорений (Шашков B.C., 1994). С подобными ситуациями мы сталкиваемся при длительных перемещениях на различных видах транспорта, а в недалеком будущем - при космических перелетах. Рассматриваемые случаи нередко приобретают характер чрезвычайных, неожиданных событий, приводящих к нежелательному исходу.
Ограничение двигательной активности - гипокинезия, гиподинамия, иммобилизация, а также болезнь движения являются ярко выраженными стрессорными факторами, вызывающими различные физиологические и биохимические сдвиги в организме, направленные на приспособление организма (Яснецов В.В. и соавт., 1993; Панферова Н.Е., 1977; Федоров И.В., 1984; Шидловская Т.Е.. 1984). .
Биохимические сдвиги при действии на организм указанных ситуаций уже давно привлекают внимание исследователей, работы которых в большинстве случаев затрагивали последствия действия длительных сроков рассматриваемых стрессовых воздействий, в то время как события, происходящие на ранних этапах воздействий, особенно в чрезвычайных условиях, оставались за пределами их внимания.
Согласно современным представлениям биохимические сдвиги, происходящие на ранних этапах формирования ответной реакции организма на любое стрессороное воздействие имеют чрезвычайное значение, так как именно их характер, направление и соотношение определяет вероятность эффективного приспособления организма, а значит и его жизнь (Гусев Е.И., СкворцоваВ.И., 2001).
С этой точки зрения особое значение имеют молекулы сывороточного альбумина, представляющие собой сложную, полифункциональную, коммуникативную систему, осуществляющую гомеостатическую функцию в организме, способные проникать через различные межтканевые барьеры (Синичкин А.А., 2000). Особенности структурно-функционального состояния альбумина определяют его место в жизнедеятельности организма в целом. В настоящее время выявлено особое значение изменение структурно-функционального состояния молекул альбумина как для нормальной жизнедеятельности организма, так и при различных видах патологии (Чегер СП., 1975; Лопухин Ю.М. и соавт., 2000; Титов В.Н., 1999; Foster J. F., 1992). В то же время особенности «поведения» белка при стрессовых ситуациях практически не исследовались.
Исследование подобного вопроса также является актуальным и по причине выделения в настоящее время новой формы патологии - «конформаци-онных болезней», являющиеся молекулярной основы целого ряда заболева-
7 ний центральной нервной системы (Троицкий Г.В., 1991; Иллариошкин С.Н., 2003).
Актуальным также является поиск наиболее эффективных средств профилактики и лечения патологических процессов, вызываемых этими стрессовыми воздействиями. Список фармакологических препаратов, которые используются для профилактики последствий гипокинезии и вестибулярного воздействия достаточно широк, но возможность фармакологической коррекции функциональных сдвигов при данных воздействиях по-прежнему ограничивается весьма низкой эффективностью применяемых средств, а также обилием побочных явлений, развивающихся при их использовании (Ja-nowsky D.S. et al., 1984; Налетов СВ. и соавт., 1998).
С этой точки зрения актуальными являются исследования протимозина альфа, секретируемого тимусом и рядом других клеток живых организмов и являющийся белком с молекулярной массой 12,6 кДа, проявившим протекторный эффект при некоторых формах стрессового воздействия (Каркищенко В.Н., 2001). Молекулярные механизмы эффектов протимозина альфа до настоящего времени не выяснены.
В условиях ограничения мышечной подвижности определенным образом меняются механизмы действия практически всех фармакологических препаратов. С подобной ситуацией (частичная или полная иммобилизация) часто сталкиваются в кардиологической практике при различных формах заболевания сердечно-сосудистой системы. Поэтому актуальным является исследование особенностей действия нитроглицерина в условиях гипокинезии.
Исходя из особенностей строения и метаболизма протимозина альфа, а также нитроглицерина, можно предположить возможность их взаимодействия с различными белками крови, в частности с молекулами сывороточного альбумина, характер и значение которых в условиях действия стрессорных факторов на ранних этапах практически не исследовался. Также практически не изучено влияние введения экзогенного сывороточного альбумина при стрессорных воздействиях на организм.
Целью настоящей работы явилось исследование биохимических механизмов протекторного действия сывороточного альбумина, нитроглицерина и протимозина альфа при гипокинетическом и вестибулярном воздействиях.
Задачи исследования:
Изучить в сыворотке крови и тканях лабораторных животных крыс динамику выбранных биохимических показателей при гипокинетическом и комбинированном (гипокинезия + укачивание) стрессовых воздействиях;
Изучить влияние введения сывороточного альбумина, нитроглицерина, протимозина а на динамику выбранных биохимических показателей сыворотки крови и тканей лабораторных животных на фоне гипокинетического и комбинированного (гипокинезия + укачивание) стрессовых воздействий.
Изучить показатели сывороточного альбумина в норме, при гипокинетическом и комбинированном стрессовых воздействиях, а также на фоне введения сывороточного альбумина, нитроглицерина, протимозина а;
Изучить спектр цистеин-содержащих белков, общебелковый спектр сыворотки крови (зона альбумина) и гомогенатов тканей при гипокинетическом и комбинированном (гипокинезия+укачивание) стрессовых воздействиях, а также при введении экзогенного альбумина, нитроглицерина, протимозина а;
В опытах in vitro исследовать предполагаемые механизмы действия нитроглицерина, сывороточного альбумина и протимозина альфа.
Научная новизна результатов. Впервые изучены биохимические показатели, которые отражают характер изменений на ранних этапах формирования ответной реакции организма животных при гипокинетическом и вестибулярном стрессорных воздействиях. Выявлено снижение интенсивности свободнорадикальных реакций в изученных тканях, увеличение проницаемости эритроцитарных мембран, а также изменения в спектре цистеин-
9 содержащих белков и общем белковом спектре, снижении функциональной способности сывороточного альбумина.
Впервые установлена возможность фармакологической коррекции изученных форм стресса с помощью экзогенного альбумина, нитроглицерина и протимозина альфа.
Впервые изучены структурно-функциональные особенности молекул альбумина как на фоне стрессорных воздействий, так и при их фармакологической коррекции нитроглицерином и протимозином альфа, путем исследования спектра цистеин-содержащих белков и общего белкового спектра, а также исследования «альбуминовых» показателей.
Впервые изучены некоторые стороны биохимических механизмов ан-тистрессорного воздействия альбумина, способного менять свою структуру в условиях действия повреждающих факторов, протимозина альфа, способного ингибировать свободнорадикальные реакции, что проявлялось в снижении концентрации продуктов перекисного окисления липидов, и нитроглицерина, способного взаимодействовать с молекулами альбумина. Выявлена способность протимозина альфа и нитроглицерина изменять структуру альбумина и нормализовать тем самым биохимические изменения, вызванные стрессом.
Основные положения, выносимые на защиту:
На ранних этапах гипокинетического и вестибулярного воздействий наблюдаются выраженные сдвиги в биохимических показателях крови и тканей, выражающиеся в изменении интенсивности свободнорадикальных реакций, активности антиоксидантной системы, а также в нарушении структурно-функциональной целостности молекул сывороточного альбумина.
Сывороточный альбумин представляет собой сложную, полифункциональную, антиоксидантно-прооксидантуную систему, реагирующую на изменение окружающей ее биохимической среды, что выражается в изменении структуры молекулы, изменении её транспортных свойств, перераспределении центров связывания для молекул экзо- и эндогенной природы. Одной из причин может выступать изменение количества цистеин-содержащих
10 белков в зоне сывороточного альбумина в сыворотке крови и тканевых белков.
Экзогенный сывороточный альбумин способен положительно влиять на организм в условиях гипокинетического и вестибулярного воздействий, нормализуя протекание биохимических процессов. Механизм подобного влияния связан с структурно-функциональными особенностями белка, с его антиоксидантными свойствами.
Выявлено положительное влияние нитроглицерина и протимозина альфа на биохимические показатели тканей животных в условиях гипокинетического и вестибулярного воздействий, один из механизмов которого связан с изменением структурно-функциональной целостности молекул альбумина.
Нитроглицерин и протимозин альфа, взаимодействуя с молекулами сывороточного альбумина, приводят к изменению его структуры и функциональных свойств, увеличению количества свободных сульфгидрильных групп и выделению в среду прежде связанных с альбумином низкомолекулярных серу-содержащих продуктов, оказывающих определенное влияние на интенсивность биохимических реакций.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в настоящей работе результаты расширяют представления о «биохимической» среде, формирующейся на ранних этапах ответной реакции организма на стрессорное воздействие. Получены новые экспериментальные материалы о предполагаемых биохимических механизмах протекторного действия сывороточного альбумина, нитроглицерина и протимозина альфа при стрессор-ных воздействиях. Причем антистрессорное действие нитроглицерина и протимозина альфа реализуется через влияние на структуру и функции сывороточного и тканевого альбумина.
Материалы работы используются при чтении лекций и проведении практических занятий в Ростовском государственном университете по курсам: «Биохимия аминокислот и белка», «Биохимия макромолекул».
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых Северного Кавказа по физиологии и валеологии (2000, 2001 г.г.); на XXX, XXXI итоговых научных конференциях Ростовского государственного университета (2002, 2003 г.г.); на IX и X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», город Москва (2002-2003 г.г.); на второй межвузовской международной конференции молодых ученых, специалистов и студентов «Обмен веществ при адаптации и повреждении», Ростов-на-Дону, РГМУ, 2003 год.
Публикации материалов диссертации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 182 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, постановки и методов исследования, результатов исследования, их обсуждения, выводов; содержит 31 таблицу и 35 рисунков, 2-х схем. Список литературы включает 218 источников, 42 - иностранных авторов.
Биохимические и патофизиологические изменения при гипокинетическом и вестибулярном воздействиях на организм
Современные исследователи для обозначения состояния ограничения мышечной деятельности наиболее часто используют два термина: гиподинамия и гипокинезия. Оба термина заимствованы из греческого языка: hypo-понижение, dinamis- сила, kines- движение. В переводе на русский язык гиподинамия обозначает снижение силы, а гипокинезия - снижение двигательной активности (Панфёрова Н.Е., 1977).
Гиподинамия с сохранением изотонического режима сократительной деятельности скелетных мышц свойственна длительному строгому постельному режиму, невесомости, сидячему образу жизни (Михайлов В.В., 2001).
Термин «гипокинезия» в современном понимании употребляется для обозначения фактора малоподвижности, приводящего к дефициту мышечных нагрузок, детренированности и многообразным нарушениям функций организма (Коваленко Е.А., Горовский Н.Н., 1980). «Гипокинезия» является более широким понятием, чем «гиподинамия», поскольку снижение или ограничение движений (гипокинезия) в ряде случаев приводит к снижению мышечной силы (гиподинамия), тогда как снижение мышечной силы приводит к гипокинезии лишь при патологических состояниях (Лобзин B.C. и др., 1978).
С патофизиологической точки зрения можно выделить следующие наиболее характерные проявления действия гипокинезии на организм (Баранов В.М. и соавт., 1997; Коваленко Е.А., Туровский Н.Н., 1980;Смирнов К.В., 1990; Тизул А.Я., 1999; Михайлов В.М., 2001): 1) детренированность сердечно-сосудистой системы, проявляющуюся снижением ортостатической устойчивости, физической работоспособности; 2) функциональная гиподинамия миокарда, аритмии, дисрегуляция сосудистого тонуса; 3) уменьшение жизненной емкости легких, застойные явления, снижение легочной вентиляции, детернированность дыхательных мышц; 4) ухудшение показателей экономичности работы и регуляции кислородного режима организма в покое и особенно при физических нагрузках; 5) изменения в моторной системе и мышцах, в управлении движениями (атаксия, атония, дискоординация движений и др.); 6) уменьшение минеральной плотности костной ткани; 7) минимализация обмена веществ; 8) сдвиги в эндокринной регуляции функций, изменение чувствительности эфферентных органов к гормонам, рассогласование систем регуляции; 9) гиперсекреторное состояние желудка, изменение экзо- и эндокринной функций поджелудочной железы, снижение желчеобразовательной функции печени, дисбактериоз; 10) гиповолемия, изменение осмо- и ионорегулирующей функции почек, отрицательный баланс электролитов, мочекислые диатезы; 11) анемия, изменения в свертывающей системе крови; 12) снижение иммунологической реактивности (сенсибилизация, аллергические реакции); 13) нервно-психическая астенизация и другие изменения функций ЦНС. Даже при кратковременной гипокинезии отмечено развитие синдрома «застойных паренхиматозных органов», сопровождающийся длительным венозным застоем крови в единой системе «органы-сосуды» брюшной полости с увеличением размеров и кровенаполнения печени, селезенки, поджелудочной железы, почек, а также магистральных артерий и вен этого гемодинами-ческого региона, причем отмеченные изменения сопровождали развитие адаптивных реакций организма на данный патологический фактор (Бедненко B.C. и соавт., 1999). Патобиохимические основы гипокинезии. Гипокинезия является мощным стрессорным фактором (Хасина Э.И., Кириллов О.И., 1987) и вызываемая ею стресс-реакция развивается у животных с первых часов ограничения локомоции, поскольку резкое снижение подвижности в случае иммобилизации или помещения в тесные клетки-пеналы осложняется невозможностью освобождения (Коваленко Е.А., Горов-ский Н.Н., 1980). Кроме этого, гипокинезию следует рассматривать как один из вариантов стрессового состояния, в основе которого лежит стресс-реакция (Тигранян Р.А., 1990). Стресс-реакция при гипокинезии реализуется по тем же путям и механизмам, которые выявляются при других самых разнообразных стрессорных реакциях. Ведущими и определяющими в подобных реакциях являются органы центральной и периферической частей стресс-системы организма: гипоталамус и другие отделы ствола мозга, гипоталамо-гипофизарно-адреналовая ось и симпатоадреналовая система (Пшенникова М.Г., 2001). Активация всей стресс-системы организма при ограничении подвижности организма приводит к повышению содержания АКТГ в гипофизе, увеличению массы надпочечников и снижению массы иммунокомпетентных органов - тимуса и селезенки (Ли СЕ. и соавт., 1989), уменьшению абсолютного числа эозинофилов в крови и количества лимфоцитов в лимфоидных органах (Лысак В.Ф., 1978). При ограничении подвижности в организме лабораторных животных наблюдаются нарушения в работе желудочно-кишечного тракта, выражающиеся в желудочной гиперсекреции, дисфункции поджелудочной железы, нарушении желчеобразования и желчевыделения, появлении язв желудка и двенадцатиперстной кишки (Лобзин B.C. и др., 1978). Исходя из современных представлений, можно выделить три этапа развития гипокинезии у животных: 1) на первом этапе наблюдается гипертрофия коркового вещества надпочечников, наиболее выраженная в первые 12 часов - 6 суток (Юргенс И.Л., Кириллов О.И., 1972). Эта стадия характеризуется увеличением концентрации в крови катехол аминов, АКТГ, кортикостероидов. Возникает состояние острого стресса довольно тяжело переносимое животными и часто приводящее к их гибели;
2) вторая стадия развивается в конце 1-го начале 2-го месяца, характеризуется развитием адаптационных приспособлений в организме животного - фаза резистентности. Однако нормализации в этот период обменных процессов не происходит и процесс быстро переходит к третьей стадии;
3) третья стадия- стадия истощения, развивается в конце 2-го, начале 3-его месяца. В этот период особо значительными являются изменения в фос-форно-кальциевом обмене, что связано с уменьшением нагрузки на костный аппарат и относительной недостаточности выработки кальцитонина (Бакулин А.В. и др., 1994). В указанные сроки отмечается преобладание катаболиче-ских процессов над анаболическими.
Структурно-функциональные особенности молекул сывороточного альбумина в норме и при стрессорных воздействиях
Тимус секретирует более трех десятков различных пептидов, одним из самых хорошо изученных является протимозин al (Tal), который оказался эффективным при лечении врожденных и приобретенных иммунодефицит-ных состояний (Каркищенко Н.Н., 2001).
На штаммах Е. coli разработана технология получения рекомбинантно-го белка - rHuProTa. Как показали исследования, физиологическая роль ProTa не сводится только к иммунологическим функциям. Центральная часть молекулы содержит полимерные участки глутаминовой кислоты, которая может выполнять роль нейротрансмиттера (Ашмарин И.П. и соавт., 1997).
Притимозин а белок с необычной аминокислотной последовательностью, содержащий 109-113 аминокислот (Ходякова А.В., 2000). Человеческий протимозин а включает 110 аминокислотных остатков, из них 19 радикалов аспарагиновой кислоты и 35 - глутаминовой аминокислоты. Молекулярная масса белка составляет 12,6 кДа (Ходякова А.В., 2000).
Протимозин альфа не содержит сигналов секреции, он лишен гистиди-на, серусодержащих и ароматических аминокислот. Остатки аспарагиновой и глутаминовой аминокислот составляют около 50% всех аминокислот, сгруппированных в центральной части молекулы, поэтому этот белок является высоко гидрофильным и кислым (pl= 3,3-3,55). Большинство кислых остатков сгруппированы в центральной части молекулы. Предполагается, что этот участок является доменом, отвечающим за связывание с гистоном НІ. На концах молекулы ProTa отмечается два небольших участка, состоящих из основных аминокислотных остатков.
Ген ProTa. При скрининге геномных клонотек было выявлено семейство высоко гомологичных генов ProTa -РТМА, состоящее из одного гена, содержащего интроны, и пяти безинтронных генов, которые, по-видимому, являются псевдогенами (Ходякова А.В., 2000). Транскрипты, соответсвующие соответствующие псевдогенам, не обнаружены. Возможно, что экспрессия генов, не содержащих интроны, может быть тканевоспецифичной, а продукция белка в этих тканях очень низкой (Ходякова А.В., 2000). Ген РгоТа, имеющий типичную экзон-интронную структуру, картирован у человека на хромосоме 2. Он работает как латентный сплайсовый сайт, дающий увеличение до двух мРНК, чья трансляция ведет к продукции двух вариантов РгоТа, различающихся по одному остатку глутаминовой кислоты. Особенности мРНК РгоТа (наличие стоп-кодона, концевая нетранслируемая последовательность, а также сигнал полиаденилирования) указывают на принадлежность этой молекулы к долгоживущим (Ходякова А.И., 2000).
Свойства: в физиологических условиях является мономером и имеет неупорядоченную конформацию. В кислых условиях и при наличии трифто-рэтанола наблюдается конформационный переход, сопровождающийся ком-пактизацией белка и образованием стабильной а-спирали (Ходякова А.И., 2000).
Функциональная значимость определяется тем, что протимозин альфа является предшественником тимозина альфа - важнейшего пептида иммунной системы, определяющей как созревание иммунокомпетентных клеток, так и работу иммунной системы в целом. РгоТа характеризуется высокой эволюционной консервативностью, гены сходные с генами РгоТа обнаружены у представителей архибактерий, беспозвоночных, амфибий и млекопитающих. Подобный факт эволюционного консерватизма может быть обусловлен тем, что данный белок выполняет в организме универсальные, жизненно важные функции (Ходякова А.И., 2000).
Протимозин альфа - ядерный белок, способный связываться с НІ гис-тонами, в связи с этим данный белок возможно участвует в регуляции клеточного цикла, а также в процессах сборки и деконденсации нуклеосомы.
Исследования рецепторов к РгоТа в настоящее время находится на уровне идентификации и оценки кинетических параметров специфического связывания с эффекторными клетками. Тем не менее, на поверхности моноцитов обнаружено два типа рецепторов, отличающихся по сродству к белку. Были также обнаружены рецепторы к РгоТа на Т-клеточных линиях человека (Ходякова А.И., 2000).
В крови человека обнаружен как тимозин альфа (500-650 пкг/мл), так и протимозин альфа (0,67-2,34 мкг/мл).
Можно предположить, что в результате процессинга РгоТа происходит высвобождение глутаминовой кислоты, для которой известны глутаминовые рецепторы как на иммунокомпетентных клетках, так и на клетках нервной и эндокринной систем (Ашмарин И.П., Данилова Р.А. и др., 1997). Через глу-таматные рецепторы РгоТа может, по-видимому, принимать участие в регуляции взаимодействия между иммунной, нервной и эндокринной системами, проявляя адаптогенное и ноопсихостимулирующее действия (Ходякова А.И., 2000; Каркищенко Н.Н., 2001).
Необходимо указать на взаимосвязь выработки РгоТа и работы иммунной системы. В частности, в опытах in vivo и in vitro выявлена способность РгоТа повышать уровень мРНК антигенов главного комплекса гистосовме-стимости класса 2 и экспрессию этих белков на поверхности моноцитов и спленоцитов мышей. Таким образом, РгоТа играет важную роль в регуляции иммунного ответа путем усиления экспрессии антигенов МНС класса 2 и в регуляции иммунологического контроля, обеспечивающего элиминацию опухолевых клеток в момент их образования.
Наличие в организме интерлейкинов (IL 2) и различных митогенов приводит к фосфорилированию протимозина альфа. Было установлено, что внутрибрюшинное введение РгоТа, выделенного из тимуса теленка, мышам стимулирует продукцию интерферона у и фактора некроза опухолей а.
Идентификация цистеин-содержащих белков после их разделения методом ДЭФ
В настоящее время для изучения индивидуальных цистеин-содержащих белков применяют два основных метода: метод Бурфорда-Моенса (Moens, Burford, 1973), и радиоизотопный метод. Первый метод основан на жестком окислении остатков цистеина в белках до цистеиновой (сульфоновой) кислоты с последующим окрашиванием альдегид-фуксином (Burford G.D. et al., 1971). Метод имеет высокую специфичность, но низкую чувствительность и большую длительность выполнения - до трех недель. К тому же, при его использовании в гелях образуется сильный фен, мешающий их денситометрированию.
Радиоактивный метод включает: введение в анализируемые белки in vitro цистеина, меченного по сере (S35), разделение белков методом ДЭФ (или другими методами) и определение спектра цистеин-содержащих белков по радиоактивным меткам. Основным недостатком этого метода является сложность процесса из-за необходимости использования специально оборудованных помещений, приборов и средств защиты от ионизирующей радиации, дорогостоящих реактивов и привлечение специально обученного персонала. Кроме того, применение радиоактивного изотопа S35 in vivo может привести к изменению нормального метаболизма животных, что не может не сказаться на точности получаемых результатов.
В настоящее время широко распространен также метод амперметри-ческого титрования образца для определения концентрации цистеина (сульфгдрильных групп), однако данный метод имеет ряд особенностей проведения, что затрудняет его использование целым рядом лабораторий.
Для идентификации цистеин-содержащих белков могут также использоваться ряд методов гистохимии (Пирс Э., 1962; Лилли Р., 1969; Кост Е. A., 1975) и аналитической химии (Алексеев В.Н., 1972; Алексеев В.Н., 1972, 1973). Некоторыми из этих методов удается зарегистрировать и идентифицировать цистеин-содержащие белки в электрофоретических спектрах, но они либо недостаточно специфичны (осаждение ионов тяжёлых металлов на SH- и S-S-группах; реакция Са2+ и Ва2+ на цистеиновую кислоту после жесткого окисления цистеина), либо имеют низкую чувствительность и создают дополнительный фон в гелях, затрудняющий их денситометрирование - нитропруссидная реакция (Кост Е. А., 1975). Наиболее удачным оказался метод, разработанный Синичкиным А. А. и Сумряковым Б.И. в 1984 году на кафедре биохимии и микробиологии РГУ (заявка на изобретение MKH3J01 № 33/48). Метод включает: разделение индивидуальных белков при помощи ДЭФ в 7,5% ПААГ и определение в них цистеина модернезированным способом Мульдера (Mulder J.L., 1838). Для идентификации цистеин-содержащих белков используются следующие реактивы: Для идентификации цистеин-содержащих белков готовили щелочной раствор плюмбита калия (КгРЬОг). Для этого к 5% раствору ацетата свинца мебленно приливали при постоянном помешивании насыщенный раствор гидрооксида калия до полного растворения выпавшего в начале белого осадка гидрооксида свинца, схема реакций: К2Р02 »2К++РЬ022" Извлеченные из трубок гели после ДЭФ, погружали в свежеприготовленный раствор плюмбита калия и инкубировали на кипящей водяной бане 10 минут. При этом в гелях в зонах цистеин-содержащих белков проявлялись черные полосы. Необходимо отметить, что при таком способе обработки гелей после ДЭФ нередко образовывались дефекты, что затрудняло дальнейшее денситометрирование гелей. Кроме того, гели после такой обработки становились более хрупкими и часто ломались. С целью улучшения методики и преодоления возникающих трудностей нами была предпринята попытка модернизации данной методики. В результате проведенной работы был несколько изменен ход работы: гели после диск-электрофореза помещали в свежеприготовленный раствор плюмбита калия, который предварительно инкубировали на кипящей водяной бане в течение 15 минут. Помещенные в "активированный" рабочий раствор гели оставляли на 10-15 минут для проявления черных полос сульфида свинца в зонах, где присутствуют цистеин-содержащие белки. Изменение порядка операций привело к тому, что гели после такой обработки не деформировались, что не мешало дальнейшей работе с ними. Схема реакций, происходящих при окрашивании зон цистеин-содержащих белков: 1. для остатков цистеина со свободной сульфгидрильной группой: Сущность приведенных реакций сводится к образованию черного, нерастворимого в воде осадка сульфида свинца, появляющегося при взаимодействии плюмбита с сульфид-анионом, выделяющиеся при разложении остатков цистеина в щелочной среде при нагревании. В данной реакции обнаруживаются как свободные SH-группы, так и S-S-связи, сера, входя 80 щая в состав метионина - не идентифицируется (Ермаков В.В и соавт., 1952). После 10-15 минутного инкубирования гелей в темноте в щелочном растворе плюмбита калия, их погружали на 10-15 минут в 7 % раствор уксусной кислоты, для нейтрализации щелочи. Затем гели ополаскивали дистиллированной водой и помещали в глицерин, который хорошо сохраняет окраску и не нарушает структуру геля. Обработанные гели некоторое время можно хранить и в 7 % растворе уксусной кислоты. Гели денситометрировали на микроденситометре Карл Цейс, Йена, ГДР, в проходящем свете при длине волны 535 нм и амплитуде 0,2.
Влияние кратковременной гипокинезии на биохимии-ческие показатели сыворотки крови и гомогенатов тканей крыс
Природа этих белков может быть разнообразной. Возможно, определенное количество этих белков представляет собой отдельные виды молекул белков теплового шока (шаперонов), способность которых синтезироваться за столь короткий промежуток времени в настоящее время показана несколькими авторами (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001). Исключение составляет мозг, где происходит существенное снижение концентрации общего белка (на 28%, по сравнению с контрольными животными), что не приводит к активации АОС. Поэтому следует ожидать, что именно этот орган будет страдать от стресса первым.
В таблице 3 и на рисунке 3 представлены данные об изменении такого показателя, как суммарной пероксидазной активности, который отражает изменение концентрации разных по массе молекул, способных выступать в роли агентов, разрушающих перекисные соединения, что может приводить к увеличению интенсивности реакций ПОЛ. Данный показатель может указывать на изменение антиоксидантно- прооксидантного равновесия в данной ткани, отражая количество про- и антиоксидантов в ткани.
Из представленных данных следует, что при действии иммобилизаци-онного стресса отмечается снижение СПА в сыворотке крови, печени и мозгу на 53%, 35% и 23%, соответственно. Незначительное снижение СПА отмечено в селезенке. Уменьшение СПА также можно связывать с активацией анти-оксидантной системы. При этом следует отметить увеличение СПА в тимусе и почках на 152% и 20%, соответственно по сравнению с контрольными животными. В мышечной ткани изменение со стороны СПА не отмечалось (таб.3, рис.3).
Жесткая, кратковременная иммобилизация животного также отражается на «альбуминовых» показателях, изменения в которых отражены в таблице 4 и на рисунке 4.
Из представленных результатов видно, что действие данного вида стресса сопровождается снижением общей концентрации сывороточного альбумина (ОКА) на 18% по сравнению с контрольными животными. Наблюдаемое в опыте увеличение концентрации общего белка в сыворотке крови, поэтому, нельзя связывать с увеличением концентрации сывороточного альбумина. Снижение ОКА сопровождается снижением эффективной концентрации альбумина (ЭКА) на 36% по сравнению с контролем (таб.7). Подобное уменьшение количества активно участвующих в транспорте молекул альбумина связано, по-видимому, с пространственными перестройками молекул белка СА. Изменение конформации молекул СА может происходить вследствие действия целого ряда факторов: либо свободнорадикальные формы кислорода и другие молекулы взаимодействуют с СА, что может приводить к нарушению структуры белка, либо молекулы СА взаимодействуют различным способом с новыми молекулами, появившимися в сыворотке крови, что также может приводить к нарушению структуры белка. В связи с тем, что в нашей работе отмечено снижение интенсивности ПОЛ по количеству МДА (таб.3), то можно сделать вывод, что, вероятно, действие стрессорного фактора (иммобилизации) сопровождается с появлением в сыворотке крови молекул, обладающих антиоксидантными свойствами, но не свободными радикалами.
Влияние таких молекул на протекающие в организме процессы не является однозначным: наблюдается явно положительное влияние на активацию защитных систем организма, но при этом отмечается снижение ЭКА, а также резерва связывания альбумина - наблюдается снижение этого показателя по сравнению с контролем на 24% (таб. 4, рис. 4). Возможно, что названное отрицательное влияние стресса на организацию молекул сывороточного альбумина связано не с водорастворимыми белками, концентрация которых увеличивается, а с различными низкомолекулярными веществами, представляющими собой продукты деструкции клеток или продукты метаболизма, выделяющиеся при повреждении клеток. В любом случае появление таких молекул приводит к тому, что изменяется структурно-функциональная организация альбуминовых и тканевых рецепторов токсическими веществами, результатом чего является нарушение работы клеток и органов в целом.
При действии гипокинетического стресса наблюдалось увеличение ИТ на 173% по сравнению с контрольными животными (таб.4., рис.4). Увеличение данного показателя является отражением процессов, происходящих в организме при действии данного фактора. Вероятно увеличение ИТ является отражением негативных процессов, интенсивность которых на начальных этапах низка, но со временем может приводить к разрушению клеток и тканей. ИТ является чувствительным показателем появления и течения разрушительных процессов.
Изменение структурно-функциональной целостности молекул сывороточного альбумина при действии на организм животного жесткой гипокинезии может проявляться и в изменении количества важных в функциональном отношении цистеиновых остатков данного белка. Результаты исследования количества общего белка и количества цистеин-содержащих белков в зоне альбумина сыворотки крови и тканей крыс после их разделения методом диск-электрофореза при гипокинетическом воздействии представлены в таблице 5 и на рисунке 5.
Необходимо отметить, что при данном способе подготовки образца не удалось выявить окрашивание ни на общий белковый спектр, ни на спектр ЦСБ в гомогенатах мозга, селезенки, тимуса.
Из представленных результатов видно, что действие на организм животного кратковременной гипокинезии приводит к увеличению концентрации общего белка в зоне сывороточного альбумина особенно выраженное - в мышцах и почках, наблюдается увеличение этого показателя на 233% и 131%, соответственно (рис. 5).
