Введение к работе
Актуальность темы. Среди проблем современной биохимии и витаминологии, относящихся к изучению механизмов поддержания метаболического гомеостаза, одно из важнейших мест принадлежит системе коферменте ацетилирозания (СоА). Многочисленность и разнообразие СоА-зависимых ферментативных реакций открывает широкие перспективы для направленной (коферментной) регуляции метаболизма, однако реализация данного подхода ограничивается недостаточным уровнем знаний о биосинтезе СоА. механизмах стабилизации внутриклеточного фонда (фракций) кофермента, возможности использования предшественников его биосинтеза для регуляции уровня свободной формы СоА. Несмотря на методологические сложности, препятствующие детальному изучению предшественников и промежуточных продуктов биосинтеза СоА, достигнут определенный прогресс в изучении ферментов биосинтеза кофермента, ряда СоА-зависимых ферментов, чему способствовала разработка оригинальных методов получения фрагментов СоА (Skrede, 1973; Abiko, 1975; Robishaw, Neely, 1981; И.Б. Лихциер, В.Б. Спиричев. 1974; А.Я.Розанов, 1976; В.М.Копелевич, В.И.Гунар, 1988; Копелевич, 1991). В последние годы внимание специалистов сосредоточилось на внутриклеточных этапах формирования и стабилизации системы СоА, ее взаимодействия с относительно недавно открытым и пополняющимся классом пантотенатбелковых комплексов, прежде всего, относящихся к главному СоА-аккумулирущему компарт-менту клетки - митохондриям ( Rooisfiaw, Weely, 1985; Tahiliani, Beinlich, 1991; Huth et al.,1991; Scnwerdt, Moller, Huth, 1991; Brass, 1994; А. Я. Розанов. 1976; А.Г. Мойпеенок, 1980; А. Г. Халму-радов, В. Н. Топкий, Р. В. Чаговец, 1982; Л.М. Карпов, 1994).
Формирование внутримитохондриального фонда СоА связывается с ключевой ролью ФИН. идентифицированного в значительных количествах в клеточном материале, субстрате для бифункционального
Список использованных сокращений: АПБ - ацилпереносящий белок, АФ - N-ацетилтрансфераза, ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хиома-тография, ГАМК - "Х-аминомасляная кислота, ДТТ- дитиотройтол, ЛЦА-СоА - длинноцепочечные ацил-СоА, КР(КНР)-СоА - 'кисло-то (не) растворимый СоА (фракция), КРА-СоА - кислоторастворимые ацил-СоА (короткоцегочечные ацил-СоА), КГД - 2-оксоглутаратдегид-рогеназа. ПАБК - пара-аминобензойная кислота, ПАК - пантотеновая кислота, ПБК - пантотенатбелковые комплексы, ИЛ - пантенол, ПТ(ПН) - пантетин (пантетеин), ШЯ - 4-фосфопантетеин, ФПК -4'-фосфопантотеновая кислота, ФТА - фосфотрансацетилаза.
- 4 -СоА-синтетазного комплекса митохондрий и являющемуся простетичес-кой группой фосфопантетинпротеидов (Larrabee et al.,1965; Vol-ре, Vagelos, 1973; Ю.M.Торчинский, 1977). Важным элементом биосинтеза СоА из ФПН постулируется ферментативная система биосинтеза последнего путем прямого фосфорилирования ПТ (АТФ:пантете-ин-4'-фосфотрансферсза, КФ 2.7.1.34) (Novelli, 1953, 1954; Brown, 1960; Robishaw, Neely, 1984, 1985). Изначально предполагаемая непроницаемость внутренней митохондриальной мембраны (Domschke, Liersch, Decker, 1971) в последние годы была опровергнута, что инициировало изучение механизма прямого транспорта СоА через ми-тохондриальные мембраны с участием специфической СоА-транспорти-рующей системы (Tahiliani, 1989, 1991; Tahiliani, Keene, Kaplan, 1992), однако оставило открытым вопрос о соотношении специфического транспорта СоА с альтернативным транспортом ФПН или дефос-фо-СоА. Роль последнего в формировании внутримитохондриального фонда СоА представляется особенно убедительной, поскольку дефос-фо-СоА-киназа митохондрий локализована на наружной поверхности внутренней митохондриальной мембраны (Skrede, Halvorsen, 1979, 1983; Tahiliani, Neely, 1987).
Все чаще наблюдаемые в медицинской и ветеринарной практике болезни витаминной недостаточности, вызванные алиментарным дефицитом ПАК, либо нарушением метаболизма коферментной формы, неэффективность и трудоемкость существующих методов диагностики витаминного дефицита и механизмов его развития обусловливают необходимость поиска адекватных и эффективных подходов, диагностики, профилактики и лечения, прежде всего, на основе изучения функционирования системы кофермента А и ее взаимодействия с каскадом ферментов биосинтеза. В этом плане существуют особенно большие трудности, исходя из относительной ограниченности спектра выбора методов для анализа пантотената или ПАК-содержащих метаболитов в отличие от расширенных возможностей исследования самого СоА и ацил-СоА (Decker, 1959; Hotzel, 1980; Isler, Brubacher, 1982; Bi-eber, 1992; А.Г. Мойсеенок, 1979, 1984).
Широкий поиск лекарственных и витаминных средств в ряду производных ПАК, всестороннее использование фармакотерапевтических свойств производных витамина,таких как ПТ, ПЛ, ПАК-содержащих лекарственных форм (Szorady. 1967; Ю. В. Хмелевский, А.Я. Розанов, 1975; А. Г. Мойсеенок, В. М. Копелевнч. В. И.Шейбак,В. А. Гуринович, 1989) не могут быть полноценно реализованы в практике из-за отсутствия
- 5 -четких представлений о механизмах их биотрансформации, возможности полноценной утилизации системой СоА и способности вызывать специфические эффекты на СоА-зависимые реакции, необходимые для достижения фармакотерапевтических-и профилактических целей. Цель и задачи исследования. Изучить роль системы биосинтеза кофермента А и пантотенатбелковых комплексов в формировании внутриклеточного фонда кофермента в печени при различных метаболических состояниях организма животных и молекулярные механизмы регуляции начальных реакций биосинтеза СоА.
Экспериментальные задачи диссертационной работы включали:
исследование структуры фонда СоА, биотрансформации предшественников биосинтеза кофермента, активности ключевых ферментов системы СоА при развитии В3-витаминной недостаточности;
разработку метода выделения и очистки пантотенаткиназы из печени крыс и изучение свойств и механизмов регуляции фермента;
изучение роли начальных этапов биосинтеза СоА как потенциально регуляторних, а также транспортных (депонирующих) систем (ПЕК) в функционировании всей системы биогранформации производных пантотеновой кислоты и их взаимоотношения с формированием внутриклеточного фонда СоА при различных метаболических состояниях;
выяснение возможной роли метаболитов биосинтеза СоА - ФПН, дефосфо-СоА и CoASH в качестве внутриклеточных транспортных факторов системы СоА и возможности использования субстанции кофермента в качестве лекарственной формы;
определение возможности использования препаратов пантотеновой кислоты в качестве эффективных витаминных и фармакотерапевти-ческих средств при развитии алиментарной В3-недостаточности организма, хронической алкогольной интоксикации, глубокой гипотермии и некоторых других патологических состояниях организма.
Научная новизна. Выдвинуто и экспериментально подтверждено положение о клеточной структуре фонда СоА - объекте метаболической регуляции, ведущем механизме реализации витаминной и фармакотера-певтической активности производных пантотеновой кислоты.
Выявлена широкая субстратная специфичность в отношении природных аналогов витамина ключевого фермента биосинтеза СоА - АТФ: Б-пантотенат-4-фосфотрансферазы, КФ 2.7.1.33 - пантотенаткиназы, что позволяет исключить существование фермента, осуществляющего прямое фосфорилирование пантетеина (пантетеинкиназа, КФ 2.7.1.34).
Установлен физиологический механизм регуляции активности пантотенаткиназы. заключающийся в деингибировании фермента (подверженного воздействию физиологического уровня свободного СоА) посредством образования симметричного дисульфида СоА и смешанных дисульфидов СоА с низкомолекулярными соединениями (цистин, панте-тин, окисленный глутатион).
В качестве компонентов внутриклеточного метаболизма и транспорта ПАК-содержащих соединений идентифицированы дефосфо-СоА и СоА-протеидизируищий белок цитозоля гепатоцигов с N-ацетилтранс-феразной активностью (мол.масса 50-70 кД).
Установлено, что снижение уровня предшественников биосинтеза СоА, участвующих в реакции ацегилирования, является, наряду с активностью N-ацетилтрансферазы, наиболее ранним критерием развития в организме дефицита пантотеновой кислоты. Недостаточность витамина приводит к перестройке структуры фонда СоА и адаптивному увеличению активности пантотенаткиназы.
Научно-практическое значение. На основании результатов проведенной работы были расширены показания к клиническому применению отечественного препарата кальция пантотената, в частности, для лечения различных форм алкогольной болезни. Препарат пантетин (пантосин Дайичи) впервые применен для купирования алкогольных и сенильных психозов, а также для профилактики холодовой кардиопле-гии и постваготомического гастростаза.
В сотрудничестве с НПО "Витамины" разработан и внедрен в медицинскую практику препарат стабилизированного кальция пантотената (10% р-р, ампулы), одним из основных назначений которого явилось потенцирование дезинтоксикационной терапии алкоголизма.
Разработан и внедрен в клиническую практику ферментативный метод анализа в лейкоцитах уровня СоА и его предшественников, участвующих в реакции ацетилирования, для ранней диагностики недостаточности в организме коферментной формы пантотеновой кислоты и контроля биотрансформации ее препаратов в клинических условиях.
Адаптирован для клинико-биохимических исследований метод анализа ФТА-реагирующих эфиров СоА и активности М-ацетилтрансера-зы, апробированный для оценки тяжести интоксикационного синдрома у больных алкоголизмом и легочными формами туберкулеза, а также контроля эффективности терапии ПАК-содержащими препаратами.
- 7 -Апробация работы и публикации. Основные результаты работы докладывались на Всесоюзной конференции "Теоретические и практические аспекты изучения питания человека" (Москва, 1980). 6 обьединенном симпозиуме биохимических обществ СССР и ГДР (Таллин, 1981), Всесоюзном научно-техническом совещании "Состояние и перспективы научных исследований и производства витаминов и их полупродуктов" (Белгород, 1983), симпозиуме "Биохимия, фармакология и медицинское применение производных витаминов и других предшественников коферментов" (Иркутск, 1983), 16-ой конференции ФЕБО (Москва, 1984), Пленуме проблемной комиссии АМН СССР "Проблемы витаминологии" (Самарканд. 1985), 17-ой конференции ФЕБО (Берлин, 1986),Всесоюзном симпозиуме по биохимии липидов (Алма-Ата, 1987), 23-ем съезде Польского биохимического общества (Белосток, 1987), 24-м съезде Польского биохимического общества (Познань, 1988), Всесоюзной конференции "Клиническая витаминология" (Москва, 1991), 2-ой Всесоюзной конференции "Фармакологическая коррекция гипоксических состояний" (Гродно, 1991), 1-м Российском конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1992), Российском симпозиуме "Витамины и здоровье" (Москва, 1993), Международной конференции "Наука и медицина - Чернобылю" (Минск, 1993), 1-м Польском конгрессе по питанию (Варшава, 1994.), 2-й международной конференции "Анти-оксидантные витамины и бета-каротин в предупреждении заболеваний" (Берлин, 1994), международном симпозиуме "Витамины и здоровье" (Гродно, 1995), межлабораторном заседании сотрудников Института биохимии АН Беларуси (Гродно, 1995).
По материалам диссертации опубликовано 7 монографий и глав в методических руководствах, 89 научных работ, в т.ч. 2 обзора литературы, получено 8 авторских свидетельств на изобретения.
