Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Структура триазиновых пестицидов 9
1.2. Циркуляция триазиновых пестицидов в экосистемах 14
1.3. Общие принципы действия атразина на живые организмы и его метаболизм 16
1.4. Действие триазиновых пестицидов на живые организмы 19
1.4.1. Высшие растения и водоросли 19
1.4.2. Беспозвоночные 19
1.4.3. Позвоночные 20
1.4.4. Бактерии и грибы 24
1.5. Биодеградация триазиновых соединений 25
1.5.1. Высшие растения и водоросли 25
1.5.2. Млекопитающие 27
1.5.3. Бактерии 29
1.5.4. Грибы 32
1.5.4.1 Лигнинпероксидазы 34
1.5.4.2 Марганецпероксидазы 35
1.5.4.3 Лакказы 36
1.6. Неферментативная деструкция триазиновых соединений 49
1.7. Заключение 51
Глава 2. Материалы и методы 52
2.1. Материалы, используемые в работе 52
2.1.1. Реактивы 52
2.1.2. Комплексы рутения 53
2.1.3. Штаммы 53
2.2. Поверхностное культивирование 53
2.3. Глубинное культивирование 54
2.4. Индукция биосинтеза лакказы при глубинном культивировании 55
2.4.1. Индукция биосинтеза лакказы базидиомицета Coriolus hirsutus при получении индуцибельных форм фермента 55
2.4.2. Индукция биосинтеза лакказы при деструкции атразина 55
2.5. Выделение и очистка конститутивных и индуцибельных форм лакказы 55
2.6. Определение молекулярных масс ферментов 56
2.7. Определение активности оксидоредуктаз 57
2.7.1. Активность лакказы 57
2.7.2. Активность Мп-пероксидазы 57
2.8. Спектральные измерения 58
2.9. Определение количества ионов меди 58
2.10. Определение оптимумов рН каталитической активности лакказы 58
2.11. Определение термостабильности (или термической инактивации) лакказы 59
2.12. Определение оптимумов температуры каталитической активности лакказы. 59
2.13. Определение кинетических параметров субстратов лакказы 59
2.14. Анализ углеводной части лакказы 60
2.15. Анализ аминокислотного состава лакказы 60
2.16. Определение концентрации белка 61
2.17. Определение концентрации атразина методом иммуноферментного анализа 61
2.18. Определение сорбции атразина на мицелии базидиальных грибов 62
2.19. Методы анализа систем «медиатор/лакказа Coriolopsis fulvocinerea» 62
2.19.1. Электрохимическая характеристика медиаторов 62
2.19.2. Спектрофотометрия медиаторов, систем «атразин/медиатор» и «атразин/медиатор/лакказа» 62
2.20. Модельные системы «атразин/медиатор/лакказа Coriolopsis fulvocinerea» и анализ
образующихся продуктов трансформации 63
2.20.1. Состав модельных систем 63
2.20.2. Анализ модельных систем методом высокоэффективной жидкостной хроматографии 64
2.20.3. Анализ методом протонного ядерного магнитного резонанса 64
2.20.4. Анализ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии -тандемной масс-спектрометрии 65
Глава 3. Результаты и их обсуждение 66
3.1. Сравнительное исследование индуцибельных и конститутивных форм лакказы
Coriolus hirsutus 66
3.1.1. Глубинное культивирование Coriolus hirsutus, выделение и очистка форм фермента 67
3.1.2. Биохимические свойства форм лакказы Coriolus hirsutus 70
3.1.3. Физико-химические свойства форм лакказы Coriolus hirsutus 74
3.1.4. Субстратная специфичность лакказ 77
3.2. Влияние индукторов на деградацию атразина и биосинтез оксидоредуктаз при
глубинном культивировании базидиомицетов 79
3.2.1. Изменение Мп-пероксидазной активности в глубинной культуре в отсутствие и в присутствии атразина 80
3.2.2. Динамика лакказной активности в глубинной культуре в отсутствие и в присутствии атразина 83
3.2.3. Выбор индуктора и времени его внесения 86
3.2.4. Изучение сорбции атразина на мицелии 91
3.3. Характеристика внеклеточной лакказы базидиомицета Coriolopsis fulvocinerea 91
3.4. Сравнительная характеристика субстратов, используемых в качестве медиаторов в реакции с лакказой базидиомицета Coriolopsis fulvocinerea 97
3.4.1. Электрохимическая характеристика медиаторов 98
3.4.2. Изучение кинетических параметров исследуемых субстратов 103
3.5. Исследование трансформации атразина в модельных системах, содержащих лакказу
Coriolopsis fulvocinerea и редокс-медиатор 105
3.5.1. Характеристика модельных систем методом высокоэффективной жидкостной хроматографии 105
3.5.2. Характеристика продуктов трансформации атразина в модельных системах методом протонного ядерного магнитного резонанса 113
3.5.3. Исследование продуктов трансформации атразина в модельных системах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии-тандемной масс- спектрометрии 117
3.6. Механизм окисления атразина лакказой в присутствии редокс-медиатора (ГБТ) 122
Выводы 124
Список литературы 125
- Общие принципы действия атразина на живые организмы и его метаболизм
- Неферментативная деструкция триазиновых соединений
- Глубинное культивирование Coriolus hirsutus, выделение и очистка форм фермента
- Характеристика модельных систем методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Введение к работе
Деградация ксенобиотиков в природе является процессом, интенсивное изучение которого вызвано, прежде всего, необходимостью создания экологически безопасных биотехнологий.
Пестициды выступают как мощный целенаправленный фактор в агроценозах, сокращая видовое разнообразие экосистем. Действие гербицидов приводит к сублетальным поражениям и смертности. Наиболее значительные изменения происходят при воздействии гербицидов на растительные сообщества. Уничтожение сорняков приводит к сокращению разнообразия фитофагов за счет выпадения видов, облигатно питающихся сорняками. Эти изменения затрагивают, прежде всего, личиночное и эмбриональное развитие. Под влиянием гербицидов изменяются микроклиматические условия.
В связи этим большое внимание в современных исследованиях уделяется вопросам транслокации и трансформации пестицидов в системах растение-почва-вода в сочетании с характеристикой токсического воздействия на компоненты природных сообществ.
Гербицид атразин и продукты его метаболизма широко представлены в биогеоценозах многих стран и различных природных зон. Мировое производство атразина составляет около 500 т/год. Поскольку триазиновые гербициды на сегодняшний день являются одним из наиболее широко используемых классов пестицидов и остаются неотъемлемой частью сельскохозяйственных технологий, то речь идет не об отказе от них, а о выборе оптимальных стратегий трансформации и удаления из окружающей среды.
Атразин, как и продукты его метаболизма, токсичны и лабильны; они легко уходят в грунтовые воды и широко распространяются в вертикальных и горизонтальных биогеоценозах. Описаны разнообразные последствия воздействия триазиновых гербицидов как на растительные, так и на животные организмы [Bester К. и др. 2000, Dewey S.L. и др. 1986, Lakshminarayana J.S.S. и др. 1992, Graymore М. и др. 2001, Hall L.W. и др. 1997]. Показана генотоксичность атразина; имеется ряд данных о его негативном влиянии на человеческий организм [U.S.ЕРА 2002, Sanderson J.T. и др. 2001, Timchalk С. и др. 1990, Buchholz В.А. и др. 1999, Ribas G. и др. 1998].
С нашей точки зрения, изучение деградации ксенобиотиков, в частности
пестицидов, в природных сообществах следует проводить с учетом состава микрофлоры,
имеющей непосредственных контакт с данным пестицидом в процессе его метаболизма в цепи: растение - почва - воды (в том числе грунтовые). Основываясь на этом положении, особое внимание необходимо уделять поверхностному слою почвы с растительными остатками, основным компонентом микробиальных консорциумов которого являются базидиомицеты. В ряде работ показан высокий потенциал базидиальных грибов как эффективных деструкторов ксенобиотиков, в том числе и пестицидов [Jonas U. и др. 1998, Mougin С. и др. 2002, Mayer A.M. и др. 2002, Kang К.-Н. и др. 2002].
Имеющиеся на сегодняшний день данные говорят о том, что пероксидазы, тирозиназы и лакказы, относящиеся к классу оксидоредуктаз, участвуют в детоксификации многих пестицидов, в том числе и атразина. Огромную роль в процессах окисления играет именно лакказа. Косвенно эту гипотезу подтверждает тот факт, что грибные лакказы в присутствии редокс-медиаторов могут деструктировать хлорфенолы, полициклические углеводороды и некоторые соединения нервно-паралитического действия [Leontievsky А.А. и др. 2001, Bressler D.C. и др. 2000, Johannes С. и др. 1996, Cho S.-J. и др. 2002]. Но механизмы этой деградации до сих пор не изучены.
Представленный выше анализ ситуации свидетельствует об актуальности создания новых биотехнологических методов деструкции пестицидов, в том числе атразина. Лакказа является перспективным детоксифицирующим компонентом таких систем, а эффективное использование фермента в биотехнологических процессах должно базироваться на данных о его структурной организации и механизме действия.
Цель работы и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение деградации гербицида атразина базидиальными грибами и их ферментами.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Провести сравнительное исследование индуцибельных и конститутивных форм грибных лакказ на примере лакказы базидиомицета Coriolus hirsutus;
Изучить деградацию атразина базидиальными грибами в отсутствие и в присутствии индукторов биосинтеза лакказ;
Охарактеризовать лакказу базидиомицета Coriolopsis fulvocinerea, обладающего самым высоким детоксификационным потенциалом в отношении атразина;
Исследовать системы «атразин/лакказа/редокс-медиатор» и установить структуры
продуктов трансформации атразина;
5. Установить механизм окисления атразина лакказой в присутствии редокс-медиатора.
Общие принципы действия атразина на живые организмы и его метаболизм
Атразин относится к системным гербицидам без типичного росторегулирующего действия. Проникая в растение, он влияет на фотосинтез и другие процессы. Листья поврежденных растений изменяют окраску, постепенно увядают и отмирают.
Гербицидное действие большинства сим-триазинов основано прежде всего на торможении реакции Хилла. Они блокируют отток электронов от акцепторной части фотосистемы II, т.е. нарушают нециклический транспорт электронов [Kornerova М. и др. 1998, Soskic М. и др. 1997]. Триазины действуют исключительно на мембранные стадии переноса электронов между двумя фотосистемами при участии пластохинона. Результатом ингибирования является вытеснение электронного акцептора QB молекулой триазина. Ингибиторы фотосистемы II можно разделить на два типа: сериновый и гистидиновый, связывающиеся, соответственно, с серином 264 или гистидином 215 белка D1 фотосистемы П. Триазиновые гербициды относятся к сериновому типу ингибиторов.
В водоемах концентрации атразина в диапазоне 1-Ю мкг/л влияют на фотосинтез как фитопланктонного, так и перифитонного сообщества [Lakshminarayana J.S.S. и др. 1992]. Такие концентрации наблюдаются во многих водах, которые контактируют с обрабатываемыми атразином полями. Более высокие (10-20 мкг/л) концентрации вызывают гибель неустойчивых и сукцессию устойчивых видов планктона. При концентрации более 500 мкг/л полностью ингибируется фотосинтез всех неустойчивых видов. Характерный результат действия атразина на водные растения - уменьшение размеров клеток и снижение биомассы. Очень чувствительны к атразину макрофиты [Hall L.W. и др. 1997].
Зоопланктон. Действие атразина на водные экосистемы часто приводит к торможению роста и размножения многих видов зоопланктона. При этом наблюдается смена доминирующих в сообществе видов. Так, в работе [Graymore М. и др. 2001] описано вытеснение видов Diaphanosoma brachyurum и Tropocyclops prasinus mexicanus коловратками, прежде всего Keratella cochlearis. В качестве главной причины перестройки сообщества авторы указывают вызванные действием гербицида изменения в соотношении источников пищи зоопланктона.
Брюхоногие. Для брюхоногих установлено [Graymore М. и др. 2001, Davies Р.Е. и др. 1994а], что уменьшение их популяций под действием атразина - следствие сокращения кормового ресурса (водорослей).
Ракообразные. В одновидовых тестах обнаружено негативное влияние высоких концентраций пестицида на ракообразных. Например, выживаемость Gamarus fasciatus снижается при концентрации атразина 940 мкг/л, но неизменна при концентрации 490 мкг/л и ниже [Dewey S.L. и др. 1986, Davies Р.Е. и др. 1994b].
Водные насекомые. Атразин в концентрациях порядка 20-100 мкг/л влияет на выживаемость, рост и развитие водных насекомых. В частности, на личинках комаров Chironomus tentans показано, что атразин в концентрации выше 230 мкг/л уменьшает процент окукливаний и увеличивает частоту аномального развития [Dewey S.L. и др. 1986, Graymore М. и др. 2001].
Рыбы. Под действием атразина в концентрациях от 3 мкг/л могут меняться физиология и поведение рыб: например, уменьшается скорость роста или в качестве среды обитания предпочтение отдается темному нижнему слою водоема [Graymore М. и др. 2001]. Изменения в поведении влияют на структуру сообщества. Появляется разобщение в стае, в ряде описанных случаев рыбы стремятся к поверхности воды и др. [Saglio Р. и др. 1998].
Атразин метаболизируется в почках и потом экскретируется жабрами. Благодаря большой поверхности, внешней локализации, участии в дыхании, осморегуляции и основно-кислотном балансе жабры рыб служат эффективным индикатором качества воды. Минимальная концентрация атразина, вызывающая гистологические изменения в жабрах и почках - 5 мкг/л [Graymore М. и др. 2001]. Примером косвенного действия ксенобиотика является снижение биомассы рыб из-за деструкции макрофитов в водах, содержащих 100-500 мкг/л атразина [Graymore М. и др. 2001].
Птицы. Воздействию пестицидов на птиц посвящено немного публикаций. Известны работы по изучению влияния хлорсодержащих органических пестицидов, таких как гексахлорциклогексан, гексахлорбензол, линдан, эндрин, полихлорированные бифенилы и др. [Henny C.J. и др. 2003, Hoshi Н. и др. 1998]. Действие атразина изучалось на куриных эмбрионах [Szabo R. и др. 2004] (гербицид Hungazin РК 50 WP, содержащий 50% атразина и 50% наполнителей) и на птицах на стадии полового созревания [Wilhelms K.W. и др. 2005]. При введении в яйцо препарата Hungazin в высоких концентрациях, отражающих уровни загрязнения при защите растений, наблюдалось увеличение смертности эмбрионов [Szabo R. и др. 2004]. На смертность мужских особей японского перепела атразин не влиял, но при концентрации 1000 мкг/кг понижал аппетит птиц и скорость их роста [Wilhelms K.W. и др. 2005]. Воздействие атразина в этой концентрации влияло на уровень гормонов в крови, увеличивая концентрацию тестостерона и уменьшая - лютеинизирующего гормона. В концентрации выше 1000 мкг/кг атразин может влиять на репродуктивную способность птиц, но эти эффекты непостоянны и слабо выражены [Wilhelms K.W. и др. 2005].
Млекопитающие. Исследования на млекопитающих показали, что атразин и его аналоги вызывают различные нарушения в организме [U.S.ЕРА 2002, Timchalk С. и др. 1990, Buchholz В.А. и др. 1999]. В соответствии с принятой классификацией токсичных для человека соединений [Мартыненко В.И. и др. 1992], атразин относится к умеренно опасным пестицидам - третий класс опасности. Для России предельно допустимая концентрация атразина в почве составляет 10 мкг/кг, в питьевой воде - 2 мкг/л [Ларина Г.Е. 2002]. Уровень атразина, определяемый в питьевой воде, часто превышает максимальный уровень загрязнения - 2 мкг/л для России и 3 мкг/л для США (Агентство по защите окружающей среды США) [U.S.EPA 2002]. Этот уровень (3 мкг/л) вызывает хромосомные нарушения в яичниках хомяка, включая делеции и амплификацию [U.S.EPA 2002]. Было найдено, что несколько триазиновых пестицидов - атразин, пропазин и симазин - являются причиной опухолей молочной железы у женских особей крыс [U.S.EPA 2002]. Пороговый уровень достоверного онкогенного эффекта варьирует от 3 мкг/л (для пропазина) до 100 мкг/л (для симазина).
Неферментативная деструкция триазиновых соединений
В работе [Goodell В. и др. 1997] описано образование высокоаффинного Gt-хелаторного комплекса у гриба бурой гнили Gloeophyllum trabeum. Были получены четыре группы бензольных производных: производные гидроксифенилуксусной кислоты, гидроксибензойной кислоты, гидроксибензола и дигидроксифенилпентан-1,4-диола. Установлено, что оксалат играет важную роль в увеличении доступности железа при освобождении из Fe (гидр)оксидного комплекса [Shimada М. и др. 1997]. При этом образуется комплекс из железа и Gt-хелатора. Железо выделяется из комплекса в восстановленной форме Fe(II) и может реагировать с такими окислителями, как пероксид водорода, образуя гидроксил-радикалы (реакция Фентона), которые участвуют в процессах биодеградации. Подобное одноэлектронное окисление описано и для Мп [Shimada М. и др. 1997]. Trametes versicolor продуцирует соединения массой 1-5 кДа, которые катализируют окислительно-восстановительную реакцию между молекулярным кислородом и донором электронов, высвобождая гидроксил-радикал [TanakaH. и др. 1998]. Системы F(II)/H202 и F(III)/H202 применяются для окисления хлорбензолов, атразина, симазина, алахлора, малатиона и других пестицидов [Gallard Н. и др. 2000, 2001, Huston P.L. и др. 1999]. В работе [Ghauch А. и др. 2000] для разрушения атразина, симазина и пропазина использовался порошок железа.
Ма и соавт. [Ma J. и др. 2000] озонировали атразин в присутствии марганца II и бикарбоната или terZ-бутанола. Радикальная реакция приводила к образованию низкомолекулярного полярного продукта. Leitner и соавт. [Leitner N. и др. 1999] показали эффективность деструкции атразина при сочетании гамма-облучения и пропускаемого через раствор кислорода. В работе [Hequet V. и др. 2001] был осуществлен фотолиз атразина при облучении в видимой и УФ-области в присутствии порфиринового или фталоцианинового комплексов, что позволило получить в качестве продукта циануровую кислоту. Замена этих комплексов на диоксид титана сократила время полужизни атразина при том же продукте деструкции [Hequet V. и др. 2000]. Обрабатывая раствор атразина ультразвуком, среди продуктов получили диоксид углерода, что свидетельствует о полном разрушении триазинового кольца [Petrier С. и др. 1996]. Рибофлавиновая же фотосенсибилизация атразина в качестве главного продукта дала деэтиламиндеизопропиламинатразин, т.е. не произошло даже дегалогенирования [Cui Н. и др. 2002].
В практике очистки сточных вод от атразина используют и сорбционные методы. Так, диатомовая земля, по данным [Agdi К. и др. 2000], позволяет удалять 55% атразина. Campos и соавт. [Campos С. и др. 2000] показали эффективность применения для тех же целей порошка активированного угля.
Неферментативная деградация ксенобиотиков, в частности атразина, является радикальным процессом вне зависимости от происхождения и вида радикала. Радикалы могут генерироваться в результате ферментативных реакций или под воздействием ряда физико-химических факторов: озонирование, УФ и др.
На основании описанных данных можно сделать вывод, что трансформация ксенобиотиков (и триазиновых, в том числе) низшими и высшими грибами осуществляется при помощи неспецифических к данному ксенобиотику ферментативных систем и в ряде случаев в присутствии медиаторов, что обеспечивает продукцию радикалов, которые и взаимодействуют с ксенобиотиком. Таким образом, трансформация может проходить двумя путями - ферментативным и опосредованно ферментативным (или фермент-инициированным образованием радикалов).
Рассмотренные в обзоре данные позволяют сделать вывод, что трансформация атразина и структурно близких триазиновых соединений может осуществляться как химическими и физическими методами, так и ферментативно. Для создания эффективных технологий очистки наибольший интерес представляют микробиологические способы деструкции.
Эффективная утилизация атразина описана для бактерий родов Pseudomonas, Rhodococcus, Rhizobium, Ralstonia, Agrobacterium, Clavibacter, Nocardioides. Трансформация атразина такими базидиомицетами, как Cerrena maxima, Coriolopsis fulvocinerea, Coriolus hirsutus, не охватывает весь спектр возможностей грибной трансформации ксенобиотиков. В последние годы предложены новые подходы (например, сочетание лакказы с медиаторами), существенно повышающие эффективность процессов биодеградации гербицидов.
В перспективе сочетание различных методов биоремедиации позволит повысить ее эффективность и применять ее по отношению к широкому ряду токсикантов. Для детоксикации почв представляется целесообразным использование их естественной микробиоты, но с увеличенным содержанием организмов, способных к деструкции ксенобиотиков [Groom С.А. и др. 2001, Chua Н. и др. 2001, Copley S.D. 2000, OhK.-Н.идр. 1998].
Глубинное культивирование Coriolus hirsutus, выделение и очистка форм фермента
Известно, что при росте базидиальных грибов на природных субстратах продукты деградации выступают в качестве индукторов биосинтеза ферментов, в частности - лакказ, которые, в свою очередь, принимают участие в детоксификации. Следовательно, процесс индукции обуславливает появление новых форм фермента, которые так же, как и конститутивные формы, могут участвовать в реализации физиологических функций фермента in vivo. Имеющиеся на сегодняшний день в литературе сведения о свойствах индуцибельных форм лакказ недостаточны и весьма противоречивы [Klonowska А. и др. 2002, Slomczynski D. и др. 1995, Yaver D.S. и др. 1996, Galhaup С. и др. 2002, Linden М. и др. 1991, Leonowicz А. и др. 1982]. Поэтому сравнение свойств конститутивной и индуцибельной форм является важным как для последующего практического применения данного фермента, так и для выяснения механизмов его биосинтеза и физиологических функций.
Данные проведенного нами предварительного скрининга коллекции базидиомицетов по продукции лигнолитических ферментов показали наличие нескольких штаммов, обладающих лакказной активностью. Из этих штаммов для настоящего исследования был выбран штамм Coriolus hirsutus, уровень биосинтеза лакказы которым значительно превышал аналогичный показатель для других штаммов.
Целью этой серии экспериментов являлось получение гомогенных препаратов индуцибельных форм лакказы гриба C.hirsutus и сравнение их биохимических и физико-химических свойств с конститутивными формами лакказы C.hirsutus и другими грибными лакказами. В качестве индуктора использовали сирингалдазин (димер синапиновой кислоты), который является модельным компонентом лиственного лигнина - природного ростового субстрата базидиальных грибов [Леонтьевский А.А. и др. 1991, Leonowicz А. и др. 1981]. Выбор сирингалдазина в качестве индуктора обусловлен его эффективностью, т.к. ранее была показана индукция сирингалдазином биосинтеза лакказы в 10 раз [Koroljova (Skorobogat ko) О. и др. 1998].
Глубинное культивирование Coriolus hirsutus, выделение и очистка форм фермента Было проведено глубинное культивирование штамма на стандартной среде и в присутствии индуктора - сирингалдазина. Выбор глубинного культивирования был обусловлен возможностью оптимизации состава среды культивирования, а также контроля поступления кислорода, что способствует более быстрому росту культуры и повышенному синтезу биологически активных веществ, в том числе ферментов. Это позволяет значительно увеличить выход целевого продукта, в данном случае лакказы. При изучении кинетики роста базидиомицета С.hirsutus по накоплению биомассы было показано, что исследованный штамм имел следующие фазы роста: 1 - лаг-период; 2 - фаза ускорения роста; 3 - фаза экспоненциального роста; 4 - фаза замедленного роста; 5 - стационарная фаза роста; 6 - фаза отмирания. Данная кинетика роста типична для базидиомицетов. Максимальное содержание внеклеточной лакказы для исследуемого штамма соответствовало концу экспоненциальной или началу квазистационарной фазы роста. Интересно отметить, что при глубинном культивировании на стандартной среде наблюдался один пик активности фермента на 5-7 сутки, а в присутствии сирингалдазина в качестве индуктора - на 3 сутки культивирования. Как было показано в предыдущих исследованиях [Koroljova (Skorobogat ko) О. и др. 1998], сирингалдазин повышает продукцию лакказы в 10 раз, что также было подтверждено. Для выделения конститутивной лакказы культуральную жидкость собирали на 6 сут (максимальная активность фермента), а для выделения индуцибельной лакказы - на 3 сутки после добавления индуктора. Основной трудностью процесса очистки являлось устранение пигментов из культуральной жидкости, количество которых в присутствии индукторов значительно возросло. Для удаления пигментов использовали ультрафильтрацию на волоконных фильтрах, позволяющую удалить примеси с молекулярной массой менее 15 кДа. Активность лакказы полностью сохранялась в процессе ультрафильтрации. Практически все оставшиеся пигменты удалось отделить на первой стадии ионообменной хроматографии вследствие их исключительно прочного связывания с носителем - DEAE- целлюлозой. Разработанная нами методика выделения лакказы из C.hirsutus позволила получить гомогенные, по данным электрофореза и ВЭЖХ, изоформы лакказы, со степенью очистки 300 раз по сравнению с культуральной жидкостью (табл.1).
Характеристика модельных систем методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Кинетические параметры окисления субстратов лакказой были определены спектрофотометрически по накоплению продукта для [Ru(phpy)(phen)2]PF6, Ru(bpy)2Ch и для сирингалдазина. Кинетические параметры окисления ГБТ определялись электрохимически по поглощению кислорода.
При исследовании кинетики окисления [Ru(phpy)(phen)2]PF6, [RiXbpy Cb] сирингалдазина и ГБТ наблюдалась тенденция к выходу на плато (типичная кривая насыщения) зависимости начальных скоростей реакции от концентрации субстрата.
Можно предположить, что комплексы рутения в присутствии лакказы окисляются с образованием фермент-субстратного комплекса, а не просто в результате аутосферного переноса электрона. С учетом этого допущения данные для комплексов рутения также были обработаны, исходя из схемы Михаэлиса-Ментен.
Сформулированные требования к редокс-медиаторам ферментов, в частности лакказ, включают в качестве ключевого параметра способность редокс-медиатора окисляться ферментом и существовать в устойчивой форме достаточный временной промежуток. Таким образом, необходимым (однако не всегда достаточным) условием использования соединения в качестве редокс-медиатора является его способность вступать в реакцию с ферментом, т.е. быть субстратом фермента.
Рассмотренные соединения можно расположить в следующем порядке по убыванию эффективности катализа их трансформации лакказой C.fulvocenerea: [Ru(phpy)(phen)2]PF6, сирингалдазин, [Ru(bpy)2(Cl)2], 1-гидроксибензотриазол. При этом, как видно из табл. 12, кинетические параметры выбранных соединений зависят от потенциала: чем потенциал ниже, тем выше эффективность катализа.
Принимая во внимание сформулированные выше требования к редокс-медиаторам и сравнивая полученные кинетические и электрохимические данные, можно сделать вывод, что рутениевый комплекс К1 обладает наиболее перспективными характеристиками в качестве редокс-медиатора лакказы. В следующей главе выбранные субстраты лакказы (К1, К2, сирингалдазин и ГБТ) рассмотрены в качестве медиаторов окисления атразина лакказой C.fulvocenerea.
Для изучения трансформации атразина системой, содержащей фермент и редокс-медиатор, использовали метод ВЭЖХ, позволяющий исследовать как убыль атразина, так и накопление продуктов. Анализ стандартов атразина и его производных методом ВЭЖХ. ВЭЖХ стандартных растворов показала следующие времена удерживания (мин): 2-гидрокси-деизопропилатразин (ГДИА) - 4,8; деэтил-деизопропилатразин (ДЭ-ДИА) - 5,4; 2-гидрокси-деэтилатразин (ГДЭА) - 9,6; ГБТ - 10,9; 2-гидроксиатразин (ГА) - 13,0; деизопропилатразин (ДИА) - 13,1; деэтилатразин (ДЭА) - 15,3; сирингалдазин - 18,1; атразин - 20,6. К1 и К2 давали минорные пики. Для стандартов атразина, ДИА, ДЭА и ГА были построены калибровочные кривые, характеризовавшиеся линейной зависимостью площади пика от концентрации в области 2-110 цМ, проходящей через начало координат (Рис.20). R для данных стандартных образцов варьировал от 0,99998 до 0,99999. Это позволило в дальнейшем рассчитывать концентрацию компонентов по одной точке (концентрации) стандарта. 1 ВЭЖХ модельных систем «медиатор» и «медиатор/лакказа». В реакции окисления сирингалдазина лакказой образуется один продукт, пик которого выходит сразу за пиком сирингалдазина. В реакции К1/лакказа при различных концентрациях К1 и разном времени реакции образуется несколько продуктов. Реакция К2 с лакказой давала несколько пиков продуктов, которые имели очень маленькую площадь по сравнению со стандартными образцами. При анализе ГБТ обнаруживался один пик, площадь которого уменьшалась при введении лакказы. Отметим, что основные продукты, которые детектируются при выбранных условиях ВЭЖХ, не пересекаются с атразином и его производными. Это позволило достоверно детектировать продукты взаимодействия лакказы с медиаторами и атразином в дальнейших экспериментах. ВЭЖХ модельных смесей «атразин/медиатор», «атразин/лакказа» и «атразин/лакказа/медиатор». Показано, что в контрольных образцах «атразин/лакказа» и «атразин» (водный раствор) в течение всего времени эксперимента (10 суток) не происходило изменений концентрации атразина, т.е. лакказа C.fulvocinerea не вступала в реакцию. При исследовании трансформации атразина в модельных системах, содержащих лакказу, было установлено, что из четырех выбранных соединений (сирингалдазин, ГБТ, К1 и К2) только ГБТ вызывал убыль атразина. Более детальное исследование компонентов системы «атразин/лакказа/ГБТ» показало, что сам ГБТ реагировал непосредственно (без участия лакказы) с атразином и другими хлор-содержащими производными атразина (Рис. 21) и не взаимодействовал с гидрокси-производными атразина. Это позволило предположить, что реакция ГБТ с атразином идет путем замещения атома хлора в положении (2) атразина. Образование продукта ГБТ/Атр происходило как в водном растворе, так и в органическом растворителе - метаноле. Известно, что ГБТ в водных растворах может переходить в ионную форму. Поэтому было сделано предположение, что могут образовываться два продукта, в структуру которых входят и ГБГ и атразин с образованием связи (-N-0-C-) в положении (2) атразина. Предполагаемая схема реакций приведена на Рис. 22.
Похожие диссертации на Деградация гербицида атразина базидиальными грибами и их ферментами
