Введение к работе
Актуальность проблемы. Биологическая фиксация атмосферного азота - глобальный процесс, обеспечивающий возможность существования жизни на Земле. Способность восстанавливать Щ до NH/ выявлена у многих прокариот, но у эукариотичсских организмов она до сих пор не обнаружена. Однако многие растения, грибы и животные могут вступать в симбиоз с азотфиксаторами, что существенно расширяет экологические возможности как микро-, так и макросимбионта.
Наиболее активно изучается процесс симбиотической азотфиксации микробно-растительными сообществами, и, в частности, бобово-ризобиальными симбиозами. Проблема фиксации азота бобово-ризобиальной симбиотической системой включает в себя большое количество тесно связанных между собой вопросов. Одним из важнейших является изучение легоглобина (леггемоглобина) - гемодротеида бобовых растений, участвующего в регуляции кислородного режима в клубеньках бобовых. Он необходим для нормального функционирования бактероидов, в которых содержится нитрогеназа - фермент. катализирующий реакцию восстановления молекулярного азота. Легоглобин способен функционировать только в физиологически активном, восстановленном состоянии. Описано несколько путей восстановления легоглобина, как ферментативных, так и неферментативных, однако многие из них пока недостаточно изучены.
Изучение легоглобина и процесса его восстановления важно как с точки зрения теоретических аспектов (изучение механизмов симбиотической азотфиксации и теории эволюции гемопротеидов), так и чисто практических, каковыми являются поиск путей повышения плодородия почв и методов лечения заболеваний, связанных с нарушениями в функционировании гемоглобина (например, метгемоглобинемии).
Цель и задачи работы. Настоящая работа была направлена на изучение как самого легоглобина, так и процесса его восстановления, а также различных восстановителей, поддерживающих легоглобин в физиологически активном состоянии, из различных видов бобовых растений. В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи:
1. Выяснение наличия в цитозоле клубеньков различных бобовых множественных форм
метлегоглобинредуктаз и разработка метода их получения в препаративных количествах в
гомогенном состоянии.
-
Изучение и сравнение метлегоглобинредуктаз и легоглобина различных видов бобовых.
-
Изучение процесса неферментативного восстановления легоглобина и некоторых
Принятые обозначения: Lb, Lb +, Lb +, Lb02 - легоглобин, восстановленный, окисленный, оксигенированный легоглобин, соответственно; Mb - миоглобин; НЬ - гемоглобин; MLbR -метлегоглобинредуктаза, SDS - додецилсульфат натрия, PMSF - фенилметилсульфонилфторид. ПААГ - полиакриламидный гель, ИЭФ - изоэлектрофокусировка, ИЭТ - изоэлектрическая точка, DCIP - 2,6-дихлорфенолиндофенол, МТТ - тиазолил голубой, GSH, GS-SG -восстановленный и окисленный глутатион, ЭДТА - этилендиамингетрауксусная кислота, ТХУ -трихлоруксусная кислота, SOD - супероксиддисмутаза, Е - стандартный окислительно-восстановительный потенциал, IAA - индолилуксусная кислота, ПК - персональный компьютер.
2 низкомолекулярных восстановителей, а также оценка вклада различных путей восстановления в
процесс поддержания легоглобина в восстановленном состоянии.
Научная новизна и практическая ценность работы. Разработан метод одновременного получения различных форм меглегоглобинредуктаз и компонентов легоглобина из цитозоля клубеньков бобовых растений в электрофоретически гомогенном состоянии.
В клубеньках желтого и узколистного люпинов обнаружены две формы метлегоглобинредуктазы (моно.мерыый флавопротеид и димерный цегемовый железофлавопрогеид), в клубеньках гороха - одна (димерный флавопротеид).
Изучены различные свойства низкомолекулярных восстановителей из клубеньков бобовых растений. Высказано предположение об их возможной роли в азотфиксирующих клубеньках.
Произведен расчет термодинамической возможности поддержания окислительно-восстановительного статуса Lb в цитозоле клубеньков бобовых растений.
Разработана программа расчета концентраций различных форм гемопротеидов для персональных компьютеров «IBM». Разработана конструкция ячейки для биоэлектрохимических исследований с параллельным спектрофотометрическим контролем исследуемого вещества.
Структура и объем диссертационной работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 163 страницах машинописного текста, содержит 41 рисунок и 7 таблиц. Список цитируемой литературы включает 199 наименований, в т.ч. 131 на иностранном языке.
