Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение регуляции пролиферации и дифференцировки клеток является важной фундаментальной задачей биологии развития. В силу консервативности механизмов, регулирующих пролиферацию клеток у эукариот, многие данные о регуляции клеточных делений, полученные для животных, впоследствии проверяются и подтверждаются для растений. У животных лишь ограниченное число клеток взрослого организма способно делиться и обеспечивать формирование тканей и органов, эти клетки называют стволовыми. В отличие от животных, практически все живые клетки растений являются тотипотентными, и при определенных условиях способны дать начало целому организму. При этом активная пролиферация клеток свойственна особому типу клеток растений - клеткам меристем. У растений выделяют «регулярные» меристемы (такие как апикальные меристемы побега и корня) и «нерегулярные» (или дополнительные) меристемы, формирующиеся de novo при определенных условиях. К «нерегулярным» меристемам, можно отнести, например, меристемы специализированных органов, таких как клубеньки, образующиеся на корнях бобовых растений при симбиозе с бактериями ризобиями.
Для обеспечения правильного развития растений необходима тонкая регуляция баланса пролиферирующих клеток в меристемах. Пролиферация клеток растений регулируется различными системами. В первую очередь, непосредственными регуляторами пролиферации клеток являются комплексы циклинов и циклин-зависимых киназ, кроме того, важную роль в регуляции пролиферации клеток играют гормоны, такие как ауксин и цитокинин. В последние годы было также показано, что ключевыми генами, определяющими баланс пролиферирующих клеток в меристеме побега, являются гены, кодирующие транскрипционные факторы. Среди них особое место занимают гены семейства WOX (от WUSCHEL-related homeobox), кодирующие транскрипционные факторы с гомеодоменом. Предполагается, что транскрипционные факторы WOX являются ключевыми регуляторами пролиферации и дифференцировки клеток в так называемых «организующих центрах» апикальных меристем, функция которых заключается в стимулировании пролиферации прилежащих клеток и предотвращении их дифференцировки. Так, в организующем центре меристемы побега экспрессируется ген WUS (WUSCHEL), а в организующем центре меристемы корня (его называют «покоящимся» центром) - его паралог, ген WOX5. Было показано, что активность именно генов WOX(WUS и WOX5) необходима для предотвращения дифференцировки и стимулирования пролиферации клеток меристемы (меристемы побега и корня, соответственно). Также известно, что гены семейства WOX экспрессируются в меристемах специализированных органов (например, при морфогенезе клубеньков бобовых растений при симбиозе с бактериями ризобиями), однако их роль в формировании подобных меристем практически не изучена. Большинство данных о механизмах, за счет которых гены PFOX регулируют пролиферацию клеток, получено для апикальной меристемы побега. В меристеме побега WUS вовлечен как в локальную, так и в системную регуляцию пролиферации клеток. Известно, что в меристеме побега такая регуляция осуществляется через взаимодействие транскрипционного фактора WUS с системой CLAVATA и компонентами каскада сигнальной трансдукции, регулируемой цитокинином. Транскрипционный фактор WUS стимулирует деления клеток, непосредственно регулируя экспрессию генов, кодирующих регуляторы цитокининового сигнального каскада ARR (Arabidopsis Response Regulators) А-типа, обеспечивая локальное усиление действия цитокинина в тканях - гормона,
стимулирующего пролиферацию (Leibfned et. al. 2005). В то же время ген WUS
взаимодействует с системой CLAVATA, включающей гетеродимерный рецептор
CLV1/CLV2, с которым связывается пептидный лиганд CLV3 - член семейства CLE-
пептидов, недавно охарактеризованных регуляторных пептидов, которые
рассматривают как новый класс пептидных гормонов растений. Связывание лиганда
CLE запускает сигнальный каскад, приводящий к подавлению экспрессии WUS, и, как
следствие, к ограничению пролиферации клеток в меристеме. Взаимодействие WUS-
CLAVATA обеспечивает регуляцию тонкого баланса пролиферации и
дифференцировки клеток в меристеме.
Для апикальной меристемы достаточно хорошо изучена роль WUS в регуляции пролиферации клеток. Однако роль паралога гена WUS, гена WOX5, экспрессирующегося в других типах меристем, и механизм его действия практически не исследован. Как показали исследования на модельном объекте, арабидопсисе, продукты генов WUS и WOX5 функционально эквивалентны (Sarkar et al., 2007): оба эти гена экспрессируются в «организующих центрах» меристем и обеспечивают поддержание пула стволовых клеток, стимулируя их пролиферацию и блокируя дифференцировку. На основании сходства выполняемых функций можно предположить схожий механизм действия регуляторов WUS и WOX5. Последние данные свидетельствуют о том, что WOX5 может взаимодействовать с CLAVATA-подобной системой в меристеме корня: CLE-пептид (компонент системы CLAVATA) CLE40 ограничивает область экспрессии WOX5 в меристеме корня таким же образом, как CLV3 ограничивает область экспрессии гена WUS в меристеме побега (Stahl and Simon, 2009). Участие других компонентов системы CLAVATA (гомологов рецепторного комплекса CLV1/CLV2) в ограничении экспрессии WOX5 в меристеме корня к настоящему времени не показано.
Таким образом, к настоящему времени накоплены данные о роли генов WOX в «организующих центрах» апикальных меристем, тогда как их роль при развитии других типов меристем - формирующихся у растений de novo, остается неизученной. Одним из примеров формирования такого типа меристемы является органогенез клубенька, образующегося на корнях бобовых растений при симбиозе с почвенными бактериями ризобиями. Формирование клубеньков у бобовых растений происходит в результате дедифференцировки и реактивации делений клеток корня. Этот процесс представляет собой уникальную модель для изучения механизмов регуляции деления и дифференцировки клеток у растений. Известны данные о том, что в процесс развития клубенька у бобовых растений может быть вовлечен ген WOX5 (Wan et al., 2005), однако функция и механизм действия гена WOX5 в развитии клубенька остаются неизученными. Кроме того, совсем недавно была показано, что компоненты системы CLAVATA вовлечены в авторегуляцию клубенькообразования, с помощью которой растение контролирует численность клубеньков. В частности, одним из компонентов системы авторегуляции клубенькообразования является CLAVATA 1 -подобный ген, функционирующий в побеге у бобовых растений, имеющий большой процент сходства с геном CLAVATA1 у арабидопсиса (Searle et al., 2003). Мутация по этому гену приводит к нарушению системного контроля клубенькообразования, и как следствие - к формированию избыточного количества клубеньков (суперклубенькообразующему фенотипу). Кроме того, совсем недавно у бобовых были выявлены CLE- пептиды, специфичные для клубеньков, которые могут быть вовлечены в авторегуляцию с участием системы CLAVATA (Mortier et al. 2008;
Okamoto et al. 2009). На основании данных, известных для меристемы побега, можно предположить, что мишенями таких пептидных регуляторов могут являться как раз гены семейства WOX. В пользу такого предположения свидетельствуют данные о том, что в меристеме корня CLE-пептид CLE40 ограничивает область экспрессии
WOX5.
Использование модели развития клубенька у бобовых растений позволяет изучить роль гена WOX5 при формировании меристем de novo, и позволяет исследовать взаимосвязь гена WOX5 с компонентами системы CLAVATA (CLV1-подобный рецептор, CLE-пептиды) при развитии клубенька. Изучение особенностей регуляции экспрессии WOX5 при развитии клубенька позволит разрешить вопрос о существовании общих механизмов контроля пролиферации и дифференцировки клеток в апикальных меристемах и при развитии специализированных органов -клубеньков.
Цель и задачи работы. Цель работы - изучение роли меристемспецифичного гена WOX5 при развитии клубенька. В работе были поставлены следующие задачи:
1. Изучение экспрессии гена WOX5 при развитии клубенька
Идентификация гена WOX5 у гороха
Анализ экспрессии гена WOX5 при клубенькообразовании у растений дикого типа
Локальный анализ экспрессии гена WOX5 с использованием генетических конструкций
Изучение клубенькообразования у растений с искусственно подавленной экспрессией гена WOX5 путем РНК-интерференции (WOX5-RNAi)
2. Изучение взаимодействия WOX5 и комплекса CLAVATA при развитии клубенька
2.1. Изучение экспрессии WOX5 при развитии клубеньков у
суперклубенькообразующих мутантов
Количественный анализ экспрессии гена WOX5 у суперклубенькообразующих мутантов гороха.
Сравнительный анализ локализации экспрессии гена WOX5 у люцерны дикого типа и суперклубенькообразующего мутанта sunn-З с нарушением системы CLAVATA
2.2. Анализ влияния CLE-пептидов на клубенькообразование и экспрессию гена
WOX5 у растений дикого типа и суперклубенькообразующих мутантов
Определение последовательности гена, кодирующего специфичный для клубеньков CLE-пептид, у гороха.
Анализ влияния сверхэкспрессии CLE-пептидов на клубенькообразование и экспрессию гена WOX5 у гороха дикого типа и суперклубенькообразующих мутантов по генам PsSYM29, PsSYM28 и PsNOD3.
Анализ влияния сверхэкспрессии CLE-пептида на клубенькообразование и экспрессию гена WOX5 у суперклубенькообразующего мутанта люцерны sunn-3.
Научная новизна диссертационной работы. В ходе выполнения данной работы были идентифицирован ген WOX5 у гороха и впервые показано участие гена WOX5 в клубенькообразовании и изучена локализация гена WOX5 на различных этапах развития клубенька у бобовых растений. Изучена взаимосвязь между геном
W0X5 и компонентами системы CLAVATA (CLV1-подобный рецептор, CLE-пептид) и показана общность механизмов регуляции генов WOX при формировании меристем de novo (клубенькообразование) и в апикальных меристемах растений.
Практическая ценность. Результаты данной работы могут быть использованы в материалах курсов лекций «Симбиогенетика», «Генетика развития растений», читаемых на кафедре генетики и селекции СПбГУ. Полученные в работе генетические конструкции для трансформации растений могут быть использованы на практике широким кругом исследователей при работе с трансгенными растениями.
Апробация работы. По результатам работы были сделаны сообщения на конференциях: 9-ый европейский конгресс по азотфиксации Женева, Швейцария, 6-10 сентября 2010, V Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, 21-28 июня 2009, Москва, школа-конференция для аспирантов AB-RMS («Агробиотехнология в корневых-микробных системах») в рамках программы NOVA University Network в 2007 (Санкт-Петербург, Россия) и 2008 (Тюне, Дания), 8-ой европейский конгресс по азотфиксации Гент, Бельгия, 30 августа- 3 сентября, конференция «Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века». Петрозаводск, XV Конгресс Федерации Европейского сообщества по биологии растений (FESPB), 17-21 июля 2006, Лион, Франция, 10-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - Наука XXI века". 17-21 апреля 2006, Москва.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа включает в себя введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты и их обсуждение, выводы, список литературы (145 источников). Работа изложена на 139 страницах и содержит 43 рисунка и 3 таблицы.
