Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Роль гена SFP1 в контроле эффективности нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Радченко Элина Александровна

Роль гена SFP1 в контроле эффективности нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae
<
Роль гена SFP1 в контроле эффективности нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Роль гена SFP1 в контроле эффективности нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Роль гена SFP1 в контроле эффективности нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Роль гена SFP1 в контроле эффективности нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Роль гена SFP1 в контроле эффективности нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Роль гена SFP1 в контроле эффективности нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Роль гена SFP1 в контроле эффективности нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Роль гена SFP1 в контроле эффективности нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Роль гена SFP1 в контроле эффективности нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Роль гена SFP1 в контроле эффективности нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Роль гена SFP1 в контроле эффективности нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Роль гена SFP1 в контроле эффективности нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Радченко Элина Александровна. Роль гена SFP1 в контроле эффективности нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae: диссертация ... кандидата биологических наук: 03.02.07 / Радченко Элина Александровна;[Место защиты: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский государственный университет"].- Санкт-Петербург, 2015.- 140 с.

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы роль генетических и эпигенетических факторов в контроле точности трансляции у эукариот 7

1.1. Общая характеристика процесса трансляции у эукариот 7

1.2. Принцип поливариантности матричных процессов

1.2.1. Неоднозначность трансляции 12

1.2.2. Типы ошибок при трансляции

1.3. Генотипическая и фенотипическая супрессия 14

1.4. Нонсенс-супрессия и антисупрессия как модели для изучения молекулярных механизмов, контролирующих неоднозначность трансляции.14

1.5. Генетический контроль считывания стоп-кодонов у эукариот

1.5.1. Считывание стоп-кодонов мутантными тРНК и тРНК дикого типа...16

1.5.2. Роль рРНК и рибосомных белков в нонсенс-супрессии 18

1.5.3. Нонсенс-супрессия и факторы элонгации 22

1.5.4. Мутации по факторам терминации и считывание стоп-кодонов 25

1.5.5. Роль системы NMD в контроле нонсенс-супрессии 30

1.5.6. Другие факторы, влияющие на эффективность считывания стоп-кодонов 36

1.6. Эпигенетические факторы, влияющие на эффективность считывания

стоп-кодонов 40

1.6.1. Прионный детерминант [PSI+] 41

1.6.2. Прионный детерминант [PIN+] 44

1.6.3. Прионный детерминант [NSI+] 46

1.6.4. Прионный детерминант [ISP+] 46

1.7. Заключение 49

ГЛАВА 2. Материалы и методы 51

2.1. Штаммы 51

2.2. Плазмиды 52

2.3. Среды и условия культивирования 56

2.4. Генетические методы 57

2.5. Молекулярно-генетические и биохимические методы 57

2.6. Биоинформационные и статистические методы 63

ГЛАВА 3. Результаты 66

3.1. Влияние детерминанта [ISP+] на экспрессию генов SUP35 и SUP45 66

3.1.1. Количество мРНК генов SUP35 и SUP45 в штаммах [ISP+], [isp-] и sfp1 66

3.1.2. Количество белков Sup35 и Sup45 в штаммах [ISP+], [isp-] и sfp1

3.2. Сверхэкспрессия мутантной аллели гена SUP35 приводит к антисупрессии 71

3.3. Влияние сверхэкспрессии гена SFP1 на проявление мутаций sup35 и sup 45

3.3.1. Влияние сверхэкспрессии гена SFP1 на проявление мутаций sup35. 73

3.3.2. Анализ природы антисупрессии, вызванной повышенной экспрессией гена SFP1 77

3.3.3. Влияние сверхэкспрессии гена SFP1 на экспрессию гена SUP35 80

3.3.4. Влияние сверхэкспрессии гена SFP1 на проявление мутаций sup45. 83

3.3.5. Влияние сверхэкспрессии гена SFP1 на экспрессию аллели дикого типа и мутантных аллелей гена SUP45

3.4. Определение последовательности гена SFP1 в штамме 25-25-2В-П3982 и в плазмиде pRS426-SFP1 90

3.5. Анализ продукции белков Sup35 и Sup45 в штамме, несущем делецию гена SFP1 или нормальную аллель этого гена 93

ГЛАВА 4. Обсуждение 96

Выводы 105

Список литературы

Неоднозначность трансляции

Считывание стоп-кодона, возникшего в результате мутации, происходит в результате распознавания его молекулой тРНК. Так, мутации, приводящие к заменам нуклеотидов в молекуле тРНК, в первую очередь в ее антикодоне, могут приводить к прочитыванию стоп-кодонов как значащих. Такие мутации впервые были описаны у Escherichia coli (Capecchi and Gussin, 1965; Goodman et al., 1968). Было обнаружено, что нонсенс-кодон UAG в структурном гене белка оболочки РНК-содержащего фага R17 супрессируется сериновой тРНКSer в результате мутации в ее антикодоне (Capecchi and Gussin, 1965). Впоследствии супрессорные мутации такого типа были найдены и изучены и у дрожжей S. cerevisiae, где они идентифицированы в генах, кодирующих тирозиновые, сериновые и лейциновые тРНК (Murgola, 1985; Eggertsson and Sll, 1988; Hatfield and Oroszlan, 1990).

Известны случаи, когда изменения кодоновой специфичности тРНК, приводящие к супрессии, были вызваны заменой не а антикодоне, а в других участках молекулы тРНК. Так, была обнаружена супрессия кодона UGA, которая проявлялась вследствие замены основания G на А в D-стебле триптофановой тРНК у E. coli при инфекции фагом Q (Hirsh, 1971). Такая G24A тРНКTrp получила название супрессорная тРНК Хирша (Schmeing et al., 2011). Супрессия стоп-кодона молекулой тРНКTrp приводила к синтезу удлиненного белка оболочки, необходимого для образования инфекционных частиц фага.

Важно отметить, что осмысливание стоп-кодонов может быть осуществлено не только за счет мутантных тРНК, но и за счет тРНК дикого типа, или латентных супрессорных тРНК, антикодоны которых взаимодействуют со стоп-кодонами, нарушая канонические правила спаривания нуклеотидов. Существование естественных нонсенс-супрессорных тРНК обуславливает возможность считывания стоп-кодонов как значащих во многих случаях, не связанных с мутационными изменениями в тРНК (см. Beier and Grimm, 2001).

Первая тРНК эукариот, супрессирующая амбер-мутации, была обнаружена у табака и пшеницы, а также у дрозофилы (Bienz and Kubli, 1981; Beier et al., 1984a). К супрессии стоп-кодона UAG способна тирозиновая тРНК с антикодоном GA, которая содержится в клетках табака и пшеницы. Однако большинство молекул тРНКTyr из зародышей пшеницы и семян люпиновых представлено изоакцепторной фракцией тРНК с антикодоном QA, в первом положении которого находится гипермодифицированный нуклеотид кьозин, который в результате реакции трансгликозилирования вставляется в тРНК и заменяет глутамин. Важно отметить, что тРНКTyr с антикодоном QA не способна к супрессии стоп-кодона UAG (Bienz and Kubli, 1981; Beier et al., 1984; Junker et al., 1997). Псевдоуридин во втором положении антикодона — уникальная особенность всех эукариотических цитоплазматических тирозиновых тРНК. При этом, замена псеводуридина на уридин приводит к неспособности супрессировать UAG (Zerfass and Beier, 1992a).

При амплификации тРНК для глутамина с антикодоном CUG, UUG или UmUG (Um - 2 -О-метилуридин) может проявляться UAG- и/или UАА супрессорный эффект (Pure et al., 1985; Lin et al., 1986; Weiss and Friedberg, 1986; Kuchino et al., 1987; Edelman and Culbertson, 1991; Grimm et al., 1998). Стоп-кодон UAG может также считываться лейциновой тРНК с антикодонами CAA и CAG (Valle et al., 1987).

Известны также эндогенные супрессоры и для опал-кодона UGA: триптофановая тРНКTrp с антикодоном CmCA (Zerfass and Beier, 1992b), цистеиновая тРНКCys с антикодоном GCA (Urban and Beier, 1995) и аргининовая тРНКArg с антикодоном U CG (U - 2-тиоуридин) (Hani and Feldmann, 1998; Baum and Beier, 1998). Интересно отметить, что хлоропластная тРНКTrp супрессирует стоп-кодон UGA более эффективно, чем цитоплазматическая. Такой необычный факт объясняется тем, что у хлоропластной и цитоплазматической тРНК есть нуклеотидные различия в позициях 24 и 37 D-петли (Zerfass and Beier, 1992).

Таким образом, считывание всех трех стоп-кодонов достигается разнообразием молекул супрессорных тРНК. При этом во многих случаях они являются естественными клеточными тРНК, необходимыми в норме для считывания значащих кодонов.

Супрессорные тРНК транслируют нонсенс-кодоны, конкурируя с белковыми факторами терминации трансляции (Weiss et al., 1984; Ito et al., 1996; Drugeon et al., 1997; Le Goff et al., 1997; Song et al., 2000). Роли факторов терминации трансляции в контроле считывания стоп-кодонов посвящен один из следующих разделов обзора.

Генетический контроль считывания стоп-кодонов у эукариот

Ряд свойств, такие как нехромосомный характер наследования, доминантное проявление, излечивание на среде, содержащей гидрохлорид гуанидина (GuHCl) и спонтанное возникновение с частотой 10-4 на клетку на генерацию, а также способность к передаче при цитодукции позволили предположить, что [ISP+] тоже является прионом. Изначально рассматривалось предположение, что этот детерминант является разновидностью детерминанта [PSI+] (Волков и др., 2000). Однако [ISP+] способен поддерживаться в клетках, несущих делецию прионного (N-) домена белка Sup35. Кроме того, на поддержание [ISP+] не влияет шаперон Hsp104, обеспечивающий наследование [PSI+] (Volkov et al., 2002).

В присутствии [ISP+] супрессия всех трех стоп-кодонов практически отсутствует, а у штамма [isp-] эффективность супрессии увеличивается в несколько десятков раз. Из этого следует, что [ISP+] представляет собой высокоэффективный детерминант, нейтрализующий последствия нарушения терминации трансляции, обусловленные некоторыми мутациями sup35.

Для исследования детерминанта [ISP+] и поиска структурного гена был проведен скрининг инсерционной библиотеки генов. В результате этого поиска выявлены гены UPF1, UPF2 и SFP1 (Рогоза и др., 2009). Гены UPF1 и UPF2 не являются структурными генами детерминанта [ISP+], поскольку их делеция хоть и приводит к потере детерминанта [ISP+], но эта элиминация является обратимой.

Третий выявленный при скрининге ген кодирует белок Sfp1, обогащенный аспарагином и глутамином. Во всех скринингах, проведенных к настоящему времени in silico, белок Sfp1 попадает в перечень потенциальных прионов (Michelitsch and Weissman, 2000; Harrison and Gerstein, 2003; Alberti et al., 2009). Рогоза с соавторами (Rogoza et al., 2010) показали, что инактивация гена SFP1 приводит к необратимой потере детерминанта [ISP+] и проявлению стабильного супрессорного фенотипа, обусловленного мутациями sup35, а сверхэкспрессия этого гена в штаммах [isp-] приводит к изменению фенотипа с супрессорного на несупрессорный с частотой, близкой к 100%. Гипотеза, согласно которой [ISP+] является прионной формой Sfp1p, подтверждена с помощью цитологических и биохимических исследований, а также с помощью флуоресцентной микроскопии.

Белок Sfp1 является транскрипционным фактором и контролирует экспрессию большого количества генов, продукты которых вовлечены в биогенез рибосом, прохождение стадий клеточного цикла, контроль размера клеток, выживание клеток в различных стрессовых условиях (Xu and Norris, 1998; Jorgensen et al., 2002; Fingerman et al., 2003; Jorgensen et al., 2004; Cipollina et al., 2008а; 2008b). Экспрессия SFP1 увеличивается при повреждении ДНК, а мутации по гену SFP1 делают штаммы более чувствительными к ионизирующей радиации, чем штаммы, несущие SFP1 дикого типа (Xu and Norris, 1998). Показано также, что делеция SFP1 приводит к нарушениям клеточного цикла: клетки не способны переходить из фазы G2 в M. Это позволило предположить, что SFP1 работает как репрессор при переходе от фазы G2 в М (Xu and Norris, 1998). Делеция этого гена приводит к заметному снижению скорости роста и размера клеток (Cipollina et al., 2008a). Важно отметить, что в число генов, контролируемых SFP1, входят гены SUP35 и SUP45 (Fingerman et al., 2003).

Известно, что мутации в гене SFP1 приводят не только к дефектам процесса транскрипции, но могут нарушать и процесс трансляции. Мутанты по гену SFP1 проявляют чувствительность к таким антибиотикам, влияющим на процесс трансляции, как паромомицин, циклогексимид и гигромицин, по сравнению с клетками, содержащими ген SFP1 дикого типа (Fingerman et al., 2003).

Интересно отметить, что в ходе исследования связи между детерминантом [ISP+] и геном SFP1 показано, что сверхэкспрессия SFP1 приводит не только к индукции [ISP+], но и к антисупрессорному фенотипу, который исчезает после потери мультикопийной плазмиды (в случае индукции [ISP+] антисупрессорный фенотип сохраняется после потери плазмиды). Восстановление супрессорного фенотипа наблюдается примерно у четверти клонов (Rogoza et al., 2008). Для объяснения этого явления можно предложить две гипотезы. Во-первых, нельзя исключить, что при сверхэкспрессии SFP1, наряду с наследуемыми прионными агрегатами белка Sfp1, образуется ненаследуемая амилоидная форма белка, подобно тому, как это происходит при сверхэкспрессии гена SUP35 (явление мультикопийной супрессии) (Salnikova et al., 2005; Kushnirov et al., 2007). Во-вторых, увеличение количества белка Sfp1 в клетке может влиять на считывание стоп-кодонов за счет какого-то другого механизма, не связанного с возникновением амилоидной формы Sfp1р.

Важнейшей особенностью [ISP+] является то, что штаммы, несущие этот детерминант, по многим признакам, таким как эффективность супрессии, скорость роста, чувствительность к антибиотикам, отличаются от штаммов, у которых ген SFP1 делетирован (Rogoza et al., 2010). Из этого следует, что прионизация приводит не к инактивации белка Sfp1, а к изменению его свойств. Поскольку Sfp1p — это транскрипционный фактор, возможно, что [ISP+] может служить моделью для изучения эпигенетического контроля регуляции экспрессии генов.

Очевидно, таким образом, что ген SFP1 является неизвестным ранее компонентом системы, контролирующей считывание стоп-кодонов у дрожжей. Особый интерес вызывает тот факт, что белок Sfp1 способен переходить в прионную конформацию. Это открывает перспективы для дальнейшего выяснения роли прионных детерминантов в контроле клеточных функций.

Молекулярно-генетические и биохимические методы

Поскольку основную роль в обеспечении терминации трансляции у дрожжей обеспечивают белки Sup35 и Sup45, интересно было проанализировать влияние сверхэкспрессии SFP1 на проявление мутаций в гене SUP45, кодирующем второй фактор терминации трансляции, Sup45 (eRF1), а также на уровень экспрессии этого гена.

Для этого анализа был использован штамм 1А-Д1628, несущий нонсенс-мутации аde1-14 и trp1-289. Ген SUP45 у этого штамма инактивирован вставкой гена HIS3, а компенсация эффекта дизрупции обеспечивается центромерной плазмидой pRS316, несущей аллель SUP45 дикого типа. Ген SUP35 у этого штамма представлен аллелью дикого типа, что мы подтвердили с помощью секвенирования. Этот штамм трансформировали серией плазмид pRS315, несущих мутантные аллели sup45. Среди этих аллелей было пять аллелей с нонсенс-мутациями (sup45-101, -102, -104, -105, -107) и две аллели с миссенс-мутациями (sup45-103 и -116). Локализация и характеристика мутаций приведены в таблице 3 (см. главу «Материалы и методы») и на рисунке

Локализация мутаций в гене SUP45, использованных в работе. Символами «N», «M» и «С» обозначены участки гена, кодирующие соответствующие домены белка Sup45. Трансформантов отбирали на среде SC, не содержащей лейцин. Далее компенсирующую плазмиду pRS316-SUP45 элиминировали на среде 5FOA-SC-Leu, после чего подтверждали потерю плазмиды с помощью отпечатков на среду, не содержащую урацил. Последующий анализ фенотипа отобранных клонов показал, что все мутации sup45, проклонированные в составе плазмиды pRS315, проявляют супрессорный эффект по отношению к нонсенс-мутациям аde1-14 и trp1-289 (рисунок 22). При этом эффективность супрессии одних и тех же нонсенс-мутаций у трансформантов, несущих разные мутации sup45, различна, что говорит об отличиях в аллельной специфичности мутаций sup45. Например, в штамме с мутацией sup45-103 с одинаковой эффективностью супрессируются нонсенс-мутации аde1-14 и trp1-289, в то время как в штамме с мутацией sup45-116 мутация аde1-14 супрессируется более эффективно, чем мутация trp1-289.

Рисунок 22. В присутствии плазмид, несущих мутантные аллели гена SUP45, наблюдается подавление проявления мутаций ade1-14 и trp1-289. Контрольный штамм, несущий плазмиду с геном SUP45 дикого типа, обозначен как «д.т.»; штаммы, несущие плазмиды с мутантными аллелями sup45-101, sup45-102, sup45-103, sup45-104, sup45-105, sup45-107, sup45-116 обозначены в соответствии с номерами аллелей.

После проверки фенотипа трансформантов их использовали для следующего раунда трансформации, в котором в качестве векторов использовали мультикопийные плазмиды pRS426-SFP1 и pRS426 (контроль). Селекцию трансформантов проводили на среде SC-Ura. Для дальнейшего фенотипического анализа отбирали не менее 40 трансформантов каждого штамма.

Анализ фенотипа трансформантов показал, что повышенная экспрессия гена SFP1 по-разному влияет на проявление мутаций sup45. В случае штаммов, несущих нонсенс-мутации sup45, отмечалось ослабление эффективности нонсенс-супрессии практически во всех комбинациях мутаций sup45 и супрессируемых мутаций. В случае штаммов, несущих миссенс-мутации sup45, наблюдался разный эффект по отношению к мутациям ade1-14 и trp1-289. Если эффективность супрессии мутации trp1-289 снижалась, то эффективность супрессии мутации ade1-14 усиливалась. На рисунке 23 представлен рост типичных трансформантов, полученных в каждой комбинации штаммов-реципиентов и плазмид, несущих разные аллели SUP45.

Следует отметить, что штаммы, несущие плазмиду pRS426-SFP1, практически во всех случаях демонстрировали более слабый рост на полной среде по сравнению с контролем. Таким образом, как и в случае мутантов sup35, регистрируемый на селективных средах фенотип является отражением двух эффектов: снижения жизнеспособности и изменения эффективности нонсенс-супрессии. Рисунок 23. Сверхэкспрессия SFP1 приводит к разным фенотипическим эффектам на фоне различных аллелей SUP45. Представлены результаты фенотипического анализа штаммов, несущих: (А) SUP45 дикого типа; (Б) нонсенс-мутантные аллели sup45; (В) миссенс-мутантные аллели sup45.

Как и в случае мутаций sup35 (см. раздел 3.3.2. главы «Результаты»), необходимо было выяснить, обусловлено ли изменение фенотипа клонов, трансформированных плазмидой, содержащей SFP1, эффектом сверхэкспрессии этого гена, или оно является следствием прионизации Sfp1. Для того, чтобы ответить на этот вопрос, мы элиминировали плазмиду pRS426-SFP1, пассируя клетки на полной среде YEPD.

Влияние сверхэкспрессии гена SFP1 на проявление мутаций sup35 и sup

При этом, как показано ранее, суммарное количество белка Sfp1, распределенного между растворимой и осадочной фракциями в штамме [ISP+], в клетках которого SFP1 экспрессируется под контролем собственного промотора, не изменено по сравнению со штаммом [isp-] (Rogoza et al., 2010).

В связи с этим у нас возник вопрос, как влияет повышенная экспрессия гена SFP1 на эффективность нонсенс-супрессии в штаммах, не содержащих прион [ISP+]. Для оценки последствий сверхэкспрессии SFP1 мы взяли два штамма, несущих различные нонсенс-супрессорные мутации в генах SUP35 или SUP45.

Анализ эффективности нонсенс-супрессии, обусловленной мутациями sup35, на фоне повышенной экспрессии гена SFP1 показал, что во всех комбинациях супрессорных и супрессируемых мутаций наблюдается снижение супрессорного эффекта (см. рисунок 15), однако в подавляющем большинстве клонов эффективность супрессии восстанавливалась после элиминации мультикопийной плазмиды. Следовательно, все перечисленные выше эффекты являются собственными эффектами сверхэкспрессии SFP1, не связанными с образованием прионного детерминанта. Таким образом, повышенная продукция мутантного белка Sfp1 обладает таким же фенотипическим эффектом, как и его прионизация. К обсуждению этого факта мы вернемся ниже.

Вместе с тем, некоторые клоны, несущие мутацию sup35-10, сохраняли несупрессорный фенотип и после элиминации плазмиды, однако восстановление супрессии происходило после пассирования таких клонов на среде с GuHCl. Это говорит о том, что повышенная экспрессия SFP1 привела к появлению в некоторых клетках детерминанта, схожего по своим проявлениям, в том числе по влиянию на размер клеток, с [ISP+]. Важно отметить, что у этих клонов не обнаружено значащих замен в нуклеотидной последовательности гена SUP45. Из этого следует, что возникновение и поддержание [ISP+] возможно не только в штаммах, несущих специфические криптические мутации sup45, как это было показано ранее (Volkov et al., 2002; Аксенова и др., 2006), но и на фоне аллели SUP45 дикого типа. Вероятно, частота такого события значительно ниже частоты возникновения [ISP+] в штаммах, несущих специфические комбинации мутаций в генах SUP35 и SUP45, однако этот вопрос требует специального изучения.

Как уже упоминалось, в штамме [ISP+] имеет место усиление экспрессии мутантной аллели гена SUP35. Мы показали также, что к усилению экспрессии гена SUP35 приводит сверхэкспрессия SFP1 в штамме [isp-]. Что касается делеции гена SFP1, то, если получить ее в штамме [ISP+], наблюдается необратимая элиминация этого приона, что послужило одним из первых доказательств того, что [ISP+] является продуктом прионного превращения белка Sfp1 (Rogoza et al., 2010). В настоящей работе показано, что делеция SFP1 в штамме [isp-] приводит к появлению нонсенс-супрессии, что позволяет предположить, что у таких штаммов снижена эффективность терминации трансляции. Действительно, этот фенотипический эффект сопровождается снижением экспрессии генов SUP35 и SUP45 и уменьшением количества кодируемых этими генами белков.

Таким образом, изучение последствий сверхэкспрессии и делеции гена SFP1 позволяет сделать вывод, что SFP1 является позитивным регулятором экспрессии гена SUP35. Вместе с тем, механизмы этой регуляции не вполне понятны.

Интересно отметить, что в промоторе гена SUP35 есть два потенциальных сайта связывания Sfp1p, однако согласно базе oPOSSUM3.0 (http://opossum.cisreg.ca/oPOSSUM3/) (Kwon et al., 2012), их сходство с каноническим сайтом связывания Sfp1p составляет менее 85%. Таким образом, регуляторный эффект SFP1 по отношению к SUP35, по всей видимости, опосредован какими-то дополнительными белками – транскрипционными факторами, функция которых зависит от уровня экспрессии SFP1. Что касается функциональной связи между генами SFP1 и SUP45, то она тоже, несомненно, существует, однако механизм этой связи, по-видимому, еще более сложен, чем в случае гена SUP35. Об этом говорят следующие факты: сверхэкспрессия SFP1 в штаммах, несущих нонсенс-мутации в гене SUP45, приводит к снижению эффективности супрессии; в случае миссенс-мутаций этот эффект менее однозначен. Анализ количества белка Sup45 в штаммах, несущих аллель дикого типа SUP45 и одну из использованных в работе миссенс-мутаций, показал, что сверхэкспрессия SFP1 не влияет на количество Sup45. В штамме с нонсенс-мутацией сверхэкспрессия SFP1 приводит к увеличению количества фрагмента белка Sup45, образующегося при терминации трансляции на стоп-кодоне, возникшем вследствие мутации. Количество полноразмерного Sup45p в этом штамме такое же, как в контроле (см. рисунок 25). Увеличение количества фрагмента Sup45p, синтезируемого под контролем мутантной аллели, говорит о повышении эффективности терминации трансляции при сверхэкспрессии SFP1. Об этом же свидетельствует снижение эффективности супрессии, зарегистрированное у этого мутанта. Оно обусловлено тем, что образующийся в результате преждевременной терминации фрагмент белка Sup45 не может обеспечить нормальную терминацию, поскольку у него отсутствуют 155 С-концевых аминокислотных остатков и, соответственно, сайт связывания со вторым фактором терминации – Sup35p (eRF3) (Eurwilaichitr et al., 1999). Поскольку количество полноразмерного белка Sup45 в этом штамме не увеличивается, мы предположили, а затем и показали, что наблюдаемые эффекты обусловлены повышением уровня Sup35p в этих штаммах (см. рисунок 26). В то же время в случае штаммов, несущих миссенс-мутантные аллели SUP45, повышенная продукция белка Sup35p не приводит к снижению эффективности супрессии, то есть к увеличению эффективности терминации трансляции. Можно предположить, что мутантный белок Sup45 в этом случае характеризуется сниженным сродством к стоп-кодону, поэтому увеличение количества Sup35p не приводит к повышению эффективности терминации.

Интересно, что данные транскриптомного анализа (Jorgensen et al., 2002), касающиеся изменения количества мРНК SUP45 при сверхэкспрессии SFP1, неоднозначны, а именно показывают снижение, увеличение и последующее снижение уровня мРНК этого гена в зависимости от длительности эксперимента. В наших экспериментах значимых различий в уровне Sup45p дикого типа при нормальном и увеличенном уровне экспрессии SFP1 не обнаружено. Таким образом, можно предположить, что Sfp1p не осуществляет непосредственную регуляцию экспрессии SUP45 или же вклад такой регуляции невысок.

Наши эксперименты по оценке влияния делеции SFP1 на количество мРНК, транскрибируемой с генов SUP35 и SUP45, и белков, соответствующих этим генам, показали, что делеция SFP1 существенно снижает уровень экспрессии обоих генов. Таким образом, по сумме полученных данных можно утверждать, что SFP1 является позитивным регулятором экспрессии генов SUP35 и SUP45, хотя механизм регуляции носит опосредованный характер, особенно по отношению к гену SUP45.

Похожие диссертации на Роль гена SFP1 в контроле эффективности нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae