Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Изучение роли протеинкиназы Pho85p в регуляции функций митохондрий у дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris Физикова Анастасия Юрьевна

Изучение роли протеинкиназы Pho85p в регуляции функций митохондрий у дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris
<
Изучение роли протеинкиназы Pho85p в регуляции функций митохондрий у дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris Изучение роли протеинкиназы Pho85p в регуляции функций митохондрий у дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris Изучение роли протеинкиназы Pho85p в регуляции функций митохондрий у дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris Изучение роли протеинкиназы Pho85p в регуляции функций митохондрий у дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris Изучение роли протеинкиназы Pho85p в регуляции функций митохондрий у дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris
>

Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Физикова Анастасия Юрьевна. Изучение роли протеинкиназы Pho85p в регуляции функций митохондрий у дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.02.07 / Физикова Анастасия Юрьевна; [Место защиты: С.-Петерб. гос. ун-т].- Санкт-Петербург, 2010.- 183 с.: ил. РГБ ОД, 61 10-3/562

Введение к работе

Актуальность темы. В основе адаптации микроорганизмов к условиям среды лежат изменения уровня экспрессии генов, которые влияют как на метаболизм, так и на структурную организацию клетки. Химический состав цитоплазмы оказывает существенное влияние на функцию эндосимбионтов. Митохондрии, в свою очередь, определяют пластичность метаболизма эукариотической клетки и обеспечивают адаптацию к воздействиям физических или химических факторов за счет регуляции синтеза АТФ, накопления активных форм кислорода и апоптоза. Изучение генетических механизмов, регулирующих функционирование митохондрий и стабильность митохондриальной ДНК (мтДНК), является актуальным направлением фундаментальных исследований.

Изучение дрожжей-аскомицетов позволяет исследовать механизмы регуляции функций митохондрий в зависимости от метаболического состояния эукариотической клетки. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris отличаются способом утилизации углерода: S. cerevisiae являются факультативными анаэробами, а метилотрофные дрожжи P. pastoris -облигатными аэробами.

Центральную роль в процессе передачи сигнала об изменениях окружающей среды играет фосфорилирование белков. Циклин-зависимые протеинкиназы (CDK), в том числе Pho85p, выступают важными регуляторами как клеточного цикла, так и транскрипции, обеспечивая прохождение клетки через фазу Gi/S, контроль полярности клеток, экспрессию генов метаболизма фосфата и передачу сигналов об изменениях окружающей среды (Carroll а. О'Shea, 2002).

Для большинства облигатных аэробов необходимым условием выживания является наличие функционально активных митохондрий. У человека делеции, дупликации или точковые мутации мтДНК могут стать причиной наследственных и спорадических заболеваний. В клетках дрожжей S. cerevisiae структура митохондриальных нуклеоидов подвергается ремоделированию с помощью метаболически регулируемых бифункциональных белков (Hsp60p, Kgd2p, Ilv5p). В настоящее время механизмы поддержания стабильности мтДНК, а также клеточные процессы, опосредованные ядерно-митохондриальными генетическими взаимодействиями, исследованы недостаточно.

Целью исследования являлось изучение сигнальной системы, обеспечивающей адаптацию митохондрий к изменениям концентрации фосфата у дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris. В ходе работы решали следующие задачи: (1) сравнительная характеристика фенотипов мутантов pho85 дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris; (2) определение частоты возникновения спонтанных мутаций мтДНК на фоне pho85 и динамики накопления дыхательно-некомпетентных (Gly~l[pef]) клонов у штаммов pho85; (3) изучение влияния дизрупции гена РН085 на поляризацию, транспорт митохондрий, а также на

4
стабильность нуклеоидов; (4) поиск супрессорных мутаций и

мультикопииных супрессоров дыхательной некомпетентности, возникающей на фоне мутаций pho85.

Научная новизна исследования. Впервые продемонстрирована роль компонентов .Р/ГО-регулона в контроле стабильности мтДНК дрожжей S. cerevisiae. Показано, что дыхательная некомпетентность, возникающая на фоне дизрупции гена РН085, обусловлена нарушением распределения нуклеоидов между материнской и дочерней клетками, и селективным преимуществом клеток [rhoO] на среде с глюкозой и высокой концентрацией фосфата. Выявлено, что дизрупция гена РН085 приводит к нарушению структуры цитоскелета в клетках дрожжей S. cerevisiae, вызывая качественные и количественные изменения в составе фракции термостабильных белков цитоскелета. Показано, что у дрожжей S. cerevisiae дополнительные мутации в генах РН04, РН081, РН084 и РН087, возникающие на фоне дизрупции pho85, нормализуют транспорт фосфата в клетку и восстанавливают дыхательную компетентность. Отсутствие протеинкиназы Pho85p у дрожжей S. cerevisiae приводит к снижению рН матрикса митохондрий, что свидетельствует об изменении мембранного потенциала митохондрий. Выявлено, что сверхпродукция белка внутренней мембраны митохондрий Diclp, обеспечивающего выведение фосфата из матрикса митохондрий, приводит к стабилизации мтДНК у штаммов pho85 дрожжей S. cerevisiae. Показано, что ген ILV5, кодирующий белок компактизации мтДНК, является мультикопийным супрессором дыхательной некомпетентности мутантов РН085. В ходе выполнения диссертационной работы были получены штаммы P. pastoris с делецией гена РН085 и проведена фенотипическая характеристика полученных мутантов. Делеция гена РН085 у P. pastoris приводит к конститутивному синтезу кислой фосфатазы (КФ), чувствительности к ионам кальция, повышенному уровню гликогена, но, в отличие от S. cerevisiae, не влияет на частоту возникновения термочувствительных мутаций и на стабильность мтДНК.

Практическая ценность. Чувствительность штаммов с делецией pho85 к повышенным концентрациям кальция позволяет использовать ген РН085 в качестве нового селективного маркера при создании штаммов-продуцентов гетерологичных белков дрожжей P. pastoris.

Штаммы и плазмиды, полученные в данной работе, используются при выполнении исследовательских работ студентами и аспирантами биолого-почвенного факультета.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на международных конференциях «Yeast Genetics and Molecular Biology Meeting» (Гётебург, Швеция 2003; Братислава, Словакия 2005; Торонто, Канада 2008; Манчестер, Великобритания 2009); международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва, Пущино, 2006); III и V съездах Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2004 и 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 4 - в

5 изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем работы. Работа изложена на 183 страницах и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список литературы (374 наименований). Работа содержит 9 таблиц и 46 рисунков.

Похожие диссертации на Изучение роли протеинкиназы Pho85p в регуляции функций митохондрий у дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris