Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Литературный обзор
1.1 Общая характеристика причин и распространенность различных форм мужского бесплодия 17
1.2 Роль генетических факторов в развитии мужского бесплодия ... 22
1.3 Эколого-токсикологические аспекты бесплодия и нарушений сперматогенеза у мужчин 27
1.4 Гены ферментов биотрансформации ксенобиотиков как возможная генетическая основа предрасположенности к мужскому бесплодию 41
Глава II. Материалы и методы исследования
П.1 Характеристика материала исследования 50
И.2 Диагностика мужского идиопатического бесплодия 50
II.3 Анкетирование обследуемых групп мужчин 51
П.4 Характеристика молекулярно-генетических методов
исследования 52
II.5 Характеристика генетико-статистических методов
исследования 56
Результаты собственных исследований
Глава III. Клиническая характеристика пациентов и анализ возможных факторов риска идиопатического мужского бесплодия
III. 1 Клиническая характеристика больных идиопатическим бесплодием 60
Ш.2 Анализ возможных факторов риска идиопатического мужского бесплодия 63
Ш.З Анализ взаимосвязи средовых факторов риска с показателями сперматогенеза у мужчин 66
Глава IV. Исследование взаимосвязей полиморфных генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков с развитием идиопатического мужского бесплодия
IV. 1 Характеристика распределения генотипов ФБК и их соответствие равновесию Харди-Вайнберга у здоровых и больных ИМБ мужчин 70
IV.2 Анализ ассоциаций полиморфизма генов ФБК с предрасположенностью к идиопатическому бесплодию у мужчин з
IV.3 Роль взаимодействия генов ФБК со средовыми факторами в реализации предрасположенности к идиопатическому бесплодию и вариабельности показателей сперматограммы у мужчин 76
Глава V. Роль взаимодействий генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в детерминации идиопатического мужского бесплодия
V. 1 Анализ ассоциации парных межгенных сочетаний генотипов ФБК с развитием идиопатического мужского бесплодия 83
V.2 Моделирование межгенных взаимодействий в системе детоксикации при идиопатическом мужском бесплодии 88
V.3 Анализ величин неравновесия по сцеплению и гаметических корреляций между полиморфными вариантами генов ФБК при идиопатическом мужском бесплодии 91
V.4 Прогнозирование риска возникновения идиопатического мужского бесплодия на основе анализа данных генотипирования полиморфизмов генов ФБК и средовых факторов риска 97
Обсуждение результатов 101
Выводы 12i
Практические рекомендации ш
Список литературы
- Роль генетических факторов в развитии мужского бесплодия
- Диагностика мужского идиопатического бесплодия
- Анализ возможных факторов риска идиопатического мужского бесплодия
- Роль взаимодействия генов ФБК со средовыми факторами в реализации предрасположенности к идиопатическому бесплодию и вариабельности показателей сперматограммы у мужчин
Введение к работе
Актуальность проблемы
По данным ВОЗ за последние 50 лет на планете создалась сложная демографическая ситуация, обусловленная резким увеличением численности населения за счет лиц пожилого возраста, прогрессирующим снижением уровня рождаемости и ростом частоты бесплодных браков. Бесплодием называют неспособность супружеских пар к зачатию после одного года незащищенного секса. В странах Западной Европы бесплодие в браке регистрируется примерно у 15% супружеских пар [Thonneau P. and Spira А., 1991; Irvine D.S., 1998], при этом мужской фактор в таких браках выявляется более чем в половине случаев [Irvine D.S., 1998]. В шщрологической практике в отдельных случаях удается идентифицировать потенциальные факторы риска нарушения репродуктивных функций у мужчин, однако более чем в половине случаев причины возникновения мужского бесплодия остаются неизвестными, что послужило основанием для выделения отдельной формы - идиопатического мужского бесплодия (ИМБ).
Демографические показатели России и многих стран мира свидетельствуют о существенном увеличении за последние десятилетия частоты инфертильных состояний мужчин, достигающей 30-50% мужчин, состоящих в бесплодном браке. К настоящему времени проведено несколько ретроспективных исследований, свидетельствующих о существенном снижении репродуктивной функции у мужчин, которое проявляется в снижении концентрации сперматозоидов, снижении объема семейной жидкости, снижении подвижности сперматозоидов [Carlsen Е. et al., 1992; Auger J., et al., 1995].
Наиболее вероятными причинами негативных тенденций в состоянии репродуктивной функции мужчин может быть существенное ухудшение экологической обстановки в мире, связанное с накоплением в высоких концентрациях в окружающей среде (воздух, вода, почва, пищевые продукты) разнообразных токсичных химических веществ - продуктов современной техногенной цивилизации [L6pez-Teij6n М.. et al., 2008; Phillips К.Р. and Tanphaichitr N., 2008]. В частности, установлено негативное влияние на сперматогенез продуктов промышленной и сельскохозяйственной индустрии (инсектициды, пестициды, фунгициды, фенолы, растворители, ДДТ, диоксины, полихлориро-ванные бифенилы) [Negro-Vilar А., 1993; Spira A. and Multigner L., 1998; Oliva A. et al., 2001], химически загрязненного воздуха в экологически неблагополучных промышленных районах [Selevan S.G. et al., 2000], курения и, в частности, входящих в его состав ПАУ [Stillman R.J. et al., 1986; Monoski M. et al., 2002; Pasqualotto F.F. et al., 2006], хронического употребления алкоголя [Muthusami KR, Chinnaswamy P., 2005]. He следует также забывать и о токсических элементах пищевых продуктов как искусственного (пищевые добавки, красители, консерванты, нитраты и пестициды), так и естественного происхождения (температурная обработка мяса), которые могут оказывать негативное воздействие на сперматогенез. Таким образом, ведущая роль экотоксикантов среди всех известных факторов среды в этиологии бесплодия у мужчин является вполне закономерной.
Несмотря на возрастающий в андрологии интерес исследователей к токсикологическим проблемам мужского бесплодия, по-прежнему остаются невыясненными вопросы индивидуальной чувствительности организма мужчин к токсическим веществам, вызывающим нарушения сперматогенеза, и ответственным за развитие инфертилыюсти. Хорошо известно, что в зависимости от генотипических особенностей системы ферментов биотрансформации ксенобиотиков (ФБК) различные люди могут сохранять устойчивость или, наоборот, обнаруживать повышенную чувствительность к повреждающим агентам внешней среды химической природы (Баранов B.C. с соавт., 2000]. Сегодня уже
известно большое число генов и генных семейств, контролирующих синтез ферментов, отвечающих за детоксикацию ксенобиотиков, поступающих в организм извне, а также эндогенных токсичных метаболитов [Nebert P.W. ct al., 1996; Nebert D.W., 1997]. Кодируемые данными' генами ферменты детоксикации определяют индивидуальные реакции организма на разнообразные токсические вещества экзо - и эндогенного происхождения, взаимодействия их с рецепторами и ферментными системами клеток. Гены ФБК, как и все гены человека, характеризуются значительным полиморфизмом первичной нуклео-тидной последовательности ДНК, который собственно и определяет межиндивидуаль-ные фенотипические различия в активности энзимов по обезвреживанию химических1 соединений в популяциях [Nebert D.W., 1997; Баранов B.C. с соавт., 2000]. В этой связи изучение индивидуальных особенностей чувствительности организма к действию эко-токсикантов с учетом полиморфных вариантов генов ФБК в настоящее время становится одним из наиболее важных направлений в понимании токсикогенетических молекулярных механизмов развития нарушений репродуктивной функции у мужчин.
Из медицинских публикаций известно относительно небольшое число исследований [Fritsche Е. et al, 1998; Chen SS, et al, 2002; Aydemir B. et al., 2007; Wu Q.F. et al, 2007; Lu N, et al., 2008; Aydos S.E. et al., 2009], посвященных оценке вовлеченности полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков (ФБК) в формирование предрасположенности к ИМБ. Комплексной оценки влияния различных классов генов ФБК на риск развития ИМБ до настоящего времени не проводилось. Таким образом, следует признать, что именно токсикогенетические аспекты мужского бесплодия в настоящее время являются малоисследованной проблемой в ацдрологии и репродуктоло-гии, что обосновывает актуальность выполнения настоящего исследования.
Цель исследования
Провести комплексный анализ вовлеченности полиморфных вариантов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в формировании предрасположенности к идиопатическому мужскому бесплодию.
Задачи исследования
-
Провести комплексную оценку средовых факторов риска идиопатического мужского бесплодия и исследовать их связь с показателями сперматогенеза у мужчин.
-
Провести анализ ассоциаций аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов ФБК I462V и Т6235С гена CYP1A1, V432L гена CYP1B1, -1259G/C и -1053С/Т гена CYP2EJ, Y113Н и H139R гена ЕРНХ1, 481GT и 590G/A гена NAT2, S311С гена PON2, I105V гена GSTP1, del/+ гена GSTMI, del/+ гена GSTT1 и 3435GT гена MDR1 с предрасположенностью к мужскому бесплодию.
-
Изучить вклад средовых факторов прооксидантного и антиоксидантного действия на реализацию наследственной предрасположенности к ИМБ в зависимости от но-сительства генотипов ФБК, а также оценить совместное влияние генов ФБК и токсиген-ных средовых факторов на показатели сперматогенеза, обуславливающие фертильную функцию у мужчин.
-
Исследовать и смоделировать взаимодействия между различными классами генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков при мужском идиопатическом бесплодии и дать оценку их комплексного влияния на риск возникновения заболевания.
-
Провести анализ гаплотипов, величин неравновесия по сцеплению и гаметиче-ских корреляций между полиморфными вариантами генов ферментов биотрансформации у здоровых мужчин и больных идиопатическим мужским бесплодием.
6) Разработать регрессионные статистические модели индивидуального прогнозирования риска развития идиоматического бесплодия у мужчин на основе исследованных молекулярно-гепетических маркеров и средовых факторов риска.
Научная новизна исследования
В рамках настоящего исследования был впервые осуществлен комплексный моле-кулярно-генетический анализ вовлеченности полиморфных вариантов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в формирование предрасположенности к идиопати-ческому мужскому бесплодию. В ходе выполнения работы было установлено 3 новых гена (GST/'l, GSTPJ и ЛИ72), полиморфные варианты которых ассоциированы с предрасположенностью к ИМБ, а также гены (CYP1A1, ЕРНХ1, GSTP1, PON2, NAT2 и MDRI), оказывающие негативное влияние на основные параметры сперматогенеза у инфергильных мужчин в условиях действия на организм токсигеггных факторов различной природы. Полученные новые данные о взаимодействиях генотип - среда позволили предложить вероятные молекулярные механизмы, посредством которых гены ФБК во-влечены в патогенез бесплодия у мужчин. Впервые с помощью методов компьютерного моделирования было установлено, что генетическую основу ИМБ составляет особый характер взаимодействия между различными классами генов ФБК, а их патологические эффекты на уровне фенотипа зависят от влияния средовых факторов прооксидантного и антиоксидаїгтного действия.
Научно-практическая значимость исследования
В результате исследования на основе тестирования полиморфных генов ФБК и значимых средовых факторов риска были разработаны статистические модели вероятностного прогнозирования риска развития идиопатического мужского бесплодия и нарушений сперматогенеза. Практическое использование моделей дает возможность врачам-генетикам и авдрологам своевременно формировать группу повышенного риска ИМБ, оптимизировать и индивидуализировать мероприятия по превентивной коррекции нарушений репродуктивной функции, что может способствовать снижению риска формирования стойких инфергильных состояний у мужчин. Кроме того, в рамках медико-генетического консультирования для своевременного выявления мужчин, предрасположенных к ИМБ, генетическое тестирование полиморфных вариантов генов ФБК позволит не только установить потенциальные молекулярные механизмы развития болезни, но и идентифицировать спектр экотоксикантов, потенциально опасных в отношении влияния на мужскую репродуктивную систему. Результаты исследования открывают перспективы для более детального изучения токсико-генетических механизмов мужского бесплодия системно-биологическим подходом путем совместной оценки сотен тысяч ДНК-маркеров, экспрессионного профиля генов ФБК на полногепомном уровне, транс-криптомного и метаболомного анализов при различных условиях действия на организм экотоксикантов внешней среды, имеющих этиологическое значение для формирования мужского бесплодия. Реализация такого подхода открывает широкие возможности для практического применения элементов индивидуализированной генотип-специфической терапии и профилактики инфертильных состояний у мужчин посредством контроля над потенциально регулируемыми средовыми факторами риска токсигенной природы. Результаты, полученные в ходе исследования, не только формируют новые представления о роли генов ФБК в формировании предрасположенности к самому распространенному инфертильному состоянию у мужчин - идиопатическому бесплодию, но и создают теоретическую и концептуальную основу для их внедрения в образовательный процесс. В частности, результаты исследования могут быть использованы при чтении специальных курсов по медицинской и клинической генетике, урологии, андрологии, акушерства и
гинекологии, эндокринологии, патофизиологии в вузах медицинского профиля и на курсах повышения квалификации медицинских работников.
Положения, выносимые на защиту
-
Полиморфные гены различных классов ферментов биотрансформации ксенобиотиков представляют собой важную генетическую составляющую предрасположенности к идиопатическому мужскому бесплодию и оказывают существенное влияние на основные показатели сперматогенеза у инфертильных мужчин,
-
Отклонения частот генотипов ФБК при идиопатическом мужском бесплодии характеризуются накоплением среди больных функционально активных аллелей генов ферментов 1 -й фазы в сочетании с функционально неполноценными атлельными вариантами генов ферментов 2-й и 3-й фаз биотрансформации ксенобиотиков, тем самым формируя генетическую основу для нарушения баланса между процессами токсифика-ции и детоксикации и способствуя усилению образования высокотоксичных метаболитов ксенобиотиков, способных повреждать органы и ткани мужской репродуктивной системы и вызывать нарушения фертильности.
-
Патологические эффекты генотипов ФБК в отношении риска развития ИМБ зависят от прооксидантного и антиоксидантного влияния средовых факторов. В условиях прооксидантного действия среды (токсические компоненты табачного дыма) генотипы ФБК, по-видимому, потенцируют её повреждающие влияния на мужские репродуктивные органы посредством усиления токсичности ксенобиотиков, их накопления в терминальных тканях и нарушения сперматогенеза, тем самым увеличивая риск развития бесплодия, тогда как в условиях антиоксидантного действия среды (природные антиокси-данты растительной пищи) генотипы ФБК не проявляют своего патологического влияния в отношении риска развития болезни.
-
При идиопатическом мужском бесплодии между генами ферментов биотрансформации ксенобиотиков существуют сложные и иерархические взаимодействия высокого порядка, характеризующиеся не только синергизмом или антагонизмом фенотипи-ческих эффектов отдельных генов ФБК в отношении риска развития болезни, но и специфическими эволюционно сложившимися гаметическими корреляциями между аллеломорфами генов, патогенетически значимых для ИМБ, что может свидетельствовать об определяющей роли молекулярной коэволюции ФБК в сохранении в генофонде популяций генотипов, обладающих различным адаптивным потенциалом.
Апробация работы и публикации
Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Российской научной конференции с международным участием «Медико-биологические проблемы мультифакториальной патологии» (Курск, 2006), на 72 научной конференции КГМУ и сессии Центрально-Черноземного научного центра РАМН «Университетская наука: взгляд в будущее» (Курск, 2007), на I Всероссийской конференции молодых ученых (Воронеж; 2007), на Международной дистанционной научной конференции «Инновации в медицине» (Курск, 2008), на Всероссийской конференции с международным участием «Охрана репродуктивного здоровья - будущее России», организованной медицинским факультетом БелГУ (Белгород, 2010), на V Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2010). По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации результатов диссертационных исследований по медицинским наукам.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав собственных результатов, обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложений. Работа изложена на 170 страницах машинописного текста, иллюстрирована 22 таблицами и 5 рисунками и содержит 9 приложений. Список литературы включает 375 источников: 14 отечественных и 361 зарубежный.
Роль генетических факторов в развитии мужского бесплодия
Сложившаяся во многих странах мира негативная тенденция к ухудшению генеративной функции мужчин требует всестороннего изучения и выявления ведущих факторов риска инфертильных состояний, что будет способствовать разработке и повсеместному внедрению социально-экономических и медицинских мероприятий, направленных на восстановление и сохранение репродуктивного здоровья мужского населения. Полиэтиологичность или многопричинность мужского бесплодия, сложность развития болезни, тесная функциональная интеграция мужских гонад со всеми системами и органами целостного организма, создают значительные затруднения в разработке адекватных методов лечения и профилактики нарушений сперматогенеза и инфертильных состояний.
В связи с огромным разнообразием факторов, ответственных за развитие бесплодия и нарушения сперматогенеза у мужчин, необходимо детальное рассмотрение причин путем разделения на отдельные группы. По мнению Тер-Аванесова Г.В., представляется целесообразным разделение причин, способствующих нарушению сперматогенеза у мужчин, на основные, наиболее часто встречающиеся, и дополнительные, имеющие как самостоятельное значение, так и играющие этиологическую роль только в сочетании с основными факторами [Тер-Аванесов Г.В., 2000]. К основным причинам мужского бесплодия следует отнести заболевания, сопровождающиеся поражением мужских половых органов (МПО), а именно: варикоцеле, врожденные аномалии развития МПО (крипторхизм, монорхизм, гипоспадия, эписпадия), некоторые хромосомные и генные болезни, инфекционно-воспалительные заболевания МПО, идиопатическую патозооспермию, обструктивную азооспермию, некроспермию, изолированные нарушения продукции семенной жидкости, сексуальные и эякуляторные нарушения, иммунологическое нарушения, а также некоторые системные и инфекционные заболевания (туберкулез, эпидемический паротит, осложненный орхитом, хронические воспалительные заболевания дыхательных путей, цирроз печени, хроническая почечная недостаточность, сахарный диабет и другие) [Тер-Аванесов Г.В., 2000]. Кроме того, к основным причинам мужского бесплодия следует отнести хирургические вмешательства по поводу паховой грыжи, стриктуры мочеиспускательного канала, операции на мочевом пузыре, симпатэктомии, также некоторые виды консервативной терапии: лучевая, гормоно- и химиотерапия, применение транквилизаторов и антигипертензивных средств, сульфаниламидов, производных нитрофурана, наркотических анальгетиков. Описаны также эндокринные формы бесплодия, обусловленные гипогонадизмом, гиперпролактинемией и тестостерон-дефицитными состояниями. Спектр дополнительных причин мужского бесплодия также достаточно разнообразен. К ним следует отнести: привычные интоксикации (курение и злоупотребление алкоголем), профессиональные вредности (контакт с органическими и неорганическими химическими веществами, воздействие ионизирующей радиации), влияние теплового фактора (работа в условиях высоких и низких температур, длительные лихорадочные состояние с температурой более 38С, травматические повреждения органов мошонки, психосексуальные расстройства, влияние алиментарного фактора (избыточное или недостаточное питание, частичное или полное голодание, неполноценное питание).
По данным Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН (рисунок 1) в качестве основных причин мужского бесплодия выступают инфекции МПО (22,1%), варикоцеле (14,9%), а также идиопатическая патозооспермия, характеризующаяся олиго-, астено- или тератозооспермией (22,8%). Причем в 52,8% случаев мужского бесплодия причины остаются
Важную роль в развитии инфертильных состояний у мужчин могут играть нервно-психические факторы и хронический стресс [Negro-Vilar A. et al, 1993]. Экспериментальные данные, полученные на животных и людях, свидетельствуют о том, что острый и хронический стресс способен снижать количество сперматозоидов и угнетать их подвижность [McGrady A. et al, 1984; Moghisi K.S. and Wallach E.E., 1983]. Кроме того, известно, что нарушения эректильной и эякуляторной функции, патозооспермия, олигозооспермия по данным также могут быть вызваны влиянием психогенетических факторов [Palti, Z. et al, 1969]. В качестве посредников влияния психогенных факторов на указанные нарушения выступают кортикотропный релизинг-гормон, адренокортикотропный гормон и кортизол, а также некоторые нейротрансмиттеры, такие как вазопрессин, окситоцин, бета-эндорфин, ангиотензин II, эпинефрин, норэпинефрин и серотонин. Во многих случаях выработка или активация этих гормональных систем представляет собой ответную реакцию организма на стрессовое воздействие и носит неспецифический характер [Negro-Vilar, A., Johnston С, et al 1987; Plotsky I. et al, 1989; Axelrod J. and Reisine Т., 1984]. Хронические стрессовые стимуляции вызывают изменения в уровне гормонов, тем самым, вызывая отклонения в деятельности жизненно важных органов, в том числе и репродуктивной системы [Negro-Vilar, A. et al, 1993]. Исследования показывают, что повышение уровня и активности КРГ ведет к снижению выделения гонадотропных гормонов посредством подавления выработки лютеинизирующего релизинг-гормона и, следовательно, к депрессии функции гонад [Williams, С, et al. 1988; Dubey, А.К. and Plant, T.M., 1985].
В последнее время выделяют социально-экономические факторы риска развития бесплодия. Помимо влияния пестицидов, применения антибиотиков, инфекционных заболеваний (эпидемический паротит), к факторам риска развития олигоспермии отнесены заболевания желудочно-кишечного тракта, низкое количество употребляемых фруктов и овощей [Wong, W.Y. et al, 2003].
Среди причин бесплодия выделяются причины, связанные генетическими нарушениями, подразделяющиеся на хромосомные аномалии половых хромосом и аутосом (числовые и структурные) и генные нарушения. Структурные и числовые хромосомные отклонения обнаруживают у 4% пациентов с азоо- или олигозооспермией [Tuerlings et al., 1998; Chandley, 1979; Quack et al., 1988]. Хромосомные абберации у инфертильных мужчин обычно встречаются в 6% случаев [Johnson, 1998]. В 4.2% случаев хромосомные отклонения затрагивают половые хромосомы, а в 1.5% - аутосомы [Johnson, 1998]. В целом, согласно зарубежным данным, аномалии кариотипа обнаруживают приблизительно в 7-13% пациентов с идиопатическим бесплодием [Van Assche et al, 1996; Pauer et al, 1997; Huang et al, 1999]. Следует рассмотреть основные хромосомные синдромы, основными проявлениями которых является развитие мужского бесплодия.
Синдром Клайнфельтера [кариотипы 47XXY; 48, XXXY; 46XY/47XXY]-самая часто встречающаяся трисомия по X хромосоме (частота 1/500 живорожденных мальчиков [Rao и Rao, 1977]), которая является причиной 14% всех случаев азооспермии. Одним из основных клинических проявлений синдрома Клайнфельтера является первичный гипогонадизм [Klinefelter, et al, 1942] в семинефральных трубочках обнаруживается фиброз или гиалиноз с единично встречающимися сперматогониями [Bandmann and Perwein, 1984]. Мужчины с кариотипом XYY- выявляются с частотой 1/1000 живорожденных, что проявляется синдромом Sertoli-cell-only, который характеризуется нарушением созревания спермиев, хотя многие из этих мужчин фертильны [Griffin and Wilson, 1992]. Приблизительно 2% мужчин среди пациентов андрологических клиник имеют генотип 46,ХХ [Neischlag, et al, 1997]. Несмотря на нормальный женский кариотип, такие индивидуумы имеют полностью сформированный мужской фенотип вследствие наличия SRY-гена, необходимого для тестикулярного аппарата. У таких пациентов уменьшены размеры яичек, отсутствуют герминативные клетки и не обнаруживаются сперматозоиды в эякуляте [Cooper and Sandlow, 1996]. У пациентов с кариотипом 45,X0/46/XY выявляются гонадные дисгенезии смешанного типа, в ткани яичек значительно снижено количество герминативных клеток, что существенно снижает мужскую фертильность [Wegner et al, 1994].
Диагностика мужского идиопатического бесплодия
Анкетирование обследуемых групп мужчин Все обследуемые были персонально протестированы с помощью специально разработанных на кафедре биологии, медицинской генетики и экологии Курского государственного медицинского университета анкет, включающих сбор сведений об образе жизни, профессиональной деятельности, вредных привычках и особенностях питания (более 40 показателей) с целью выявления возможных факторов риска возникновения мужского бесплодия. Для изучения взаимодействий генотип-среда (влияние генотипов ФБК на риск развития ИМБ и показатели сперматогенеза в зависимости от различных условий внешней среды) были выбраны средовые факторы, воздействие которых на организм (в том числе и на репродуктивные органы мужчин) характеризуется токсическим и/или прооксидантным повреждением биоструктур [Куценко С.А., 2004; Strickland Р.Т and Groopman J.D., 1995], а именно: курение, злоупотребление алкоголем, регулярное употребление жареного и копченого мяса. Последние факторы рассматривались в связи с тем, что в мясной пище, прошедшей интенсивную температурную обработку (жарение, запекание, горячее копчение) в результате пиролиза органических веществ образуются в высоких концентрациях химические вещества, такие как ПАУ (2-200 мкг/кг мяса) и гетероциклические соединения [Fazio Т., Howard J.W., 1983; Phillips К.Р., Tanphaichitr N., 2008], высокотоксичные для различных тканей и органов, в томчисле и для мужской репродуктивной системы. Для оценки антиоксидантного влияния средовых факторов в зависимости от носительства генотипов ФБК использовались данные о характере потребления пищи растительного происхождения (сырые овощи и фрукты, зелень), которая, как известно, является основным источником природных антиоксидантов, поступающих в организм человека с пищей [Monteleone С.А., Sherman A.R., 1997].
С этой целью обследуемые мужчины подразделялись на 2 группы: 1-я - лица, регулярно (ежедневно) употребляющие пищу растительного происхождения; 2-я - лица, не употребляющие растительного пищу или употребляющие ее эпизодически (не чаще 1 раза в 2 дня). Данные по указанным средовым факторам выкопировывались из анкет здоровых и больных ИМБ мужчин и кодировались в электронной базе данных в виде бинарных значений (да, нет). Наследственный анамнез исследовался с помощью клинико-генеалогического метода, включавшего подробный сбор семейных данных о наличии среди родственников различных заболеваний. П.4 Характеристика молекулярно-генетических методов исследования У всех обследуемых проводился забор венозной крови из кубитальной вены в количестве 5 мл в пластиковые пробирки с 0,5М раствором 0,5 М ЭДТА (рН=7,8). После этого кровь замораживали и хранили при -20С. Выделение геномной ДНК осуществляли из размороженной крови стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции с последующей преципитацией ДНК 96% этанолом [Маниатис Т. с соавт., 1984]. Для лабораторных исследований использовались реактивы главным образом импортного производства высокой степени очистки (Ultra pure и Biotechnology grade). В рамках настоящего исследования было прогенотипировано 14 полиморфных вариантов 10 генов ферментов биотансформации ксенобиотиков: CYP1A1 (I462V, Т6235С), CYP1B1 (V432L), CYP2E1 (-1259G/C, -1053С/Т), PON2 (S3ПС), ЕРНХ1 (Y113H, H139R), NAT2 (481C/T, 590G/A), GSTM1 (+/del), GSTT1 (+/del), GSTPl (I105V) и MDRl (3435C/T). Генотипирование полиморфизмов генов ФБК проводили методами ПЦР-ПДРФ и мультиплексной ПЦР (GSTM1 +/del и GSTT1 +/del) согласно протоколам, описанным в литературе. Амплификацию фрагментов ДНК проводили в 12 мкл реакционной смеси, содержащей 0,5 мкл образца геномной ДНК. Смесь для амплификации включала: 67 мМ Трис-HCl рН=8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мкМ ЭДТА, 2,0-7,0 мМ MgCl2, 1 мМ (3-меркаптоэтанола, 1 мМ каждого dNTPs (dATP, dCTP, dTTP и dGTP), 15 нМ каждого из праймеров и 1U Taq-полимеразы (НПО "ДНК-Литех", Москва). Для предотвращения испарения амплификационной смеси и образования конденсата на реакционную смесь наслаивали 30 мкл минерального масла. Амплификацию фрагментов ДНК проводили на многоканальном термоциклере "Терцик" (НПО "ДНК-Технология", Москва). С целью оптимизации ПЦР для каждой пары праймеров был рассчитан оптимальный температурно-временной режим отжига и подобрана соответствующая концентрация MgCb. Последовательности праймеров и условия ПЦР для каждого исследуемого полиморфизма гена ФБК приведены в таблице 1. Обнаружение ДНК-маркеров проводилось путем обработки продуктов ПЦР специфическими эндонуклеазами согласно протоколам, описанным производителем ферментов - ОАО "Сибэнзим". После инкубации рестрикционной смеси проводили фракционирование фрагментов ДНК с помощью электрофореза в агарозных гелях различной концентрации 0,8-3,5%, приготовленных на основе ТВЕ буфера (0,089М Трис-HCl, 2мМ ЭДТА, 0,089М борная кислота). После электрофореза окрашенные этидиумбромидом гели документировали на трансиллюминаторе в проходящем УФ-свете с помощью системы GDS-8000 ("UVP", США) и программного аналитического пакета Lab Works v4.5 (США). На рисунке 2 представлены образцы электрофоретического разделения фрагментов ДНК при генотипировании отдельных полиморфизмов генов ФБК.
Анализ возможных факторов риска идиопатического мужского бесплодия
Достаточно много межгенных взаимодействий формировалось за счет полиморфных генов: 3435С/Т MDR1 (9 взаимодействий), 481 С/Т NAT2 (8 взаимодействий) и 590G/A NAT2 (7 взаимодействий). Остальные гены ФБК образовали единичные межгенные взаимодействия. Как видно из представленных в таблице 15 данных, одни сочетания генотипов увеличивали риск (0R 1) развития ИМБ, другие - обладали протективными свойствами в отношении риска (0R 1) возникновения болезни. В ходе анализа табличных данных удалось выявить закономерности в накоплении среди мужчин больных ИМБ определенных парных сочетаний генотипов ФБК. Так, у больных ИМБ отмечалось накопление сочетаний вариантных генотипов ферментов (CYPJA1, CYP2E1, CYP1B1, ЕРНХ1), представляющих первую фазу биотрансформации, когда ксенобиотик внешней среды под действием указанных ферментов активируется в промежуточную водорастворимую высокотоксичную форму (феномен токсификации). Кроме того, у больных ИМБ имело место накопление сочетаний вариантных генотипов ферментов (NAT2, GSTM1, MDR1), представляющих вторую и третью фазы биотрансформации ксенобиотиков, в результате снижается обезвреживание и выведение активированных на 1-й фазе реактивных высоко токсичных метаболитов. В целом представленные данные наглядно показывают, что у больных ИМБ имеет место большое число сочетаний генотипов ФБК, которые на фенотипическом уровне могут быть причиной нарушений баланса процессов токсификации/детоксикации, в результате чего накапливающиеся промежуточные метаболиты ксенобиотиков могут вызывать токсические повреждения различных клеточных структур, подавляя сперматогенез и формируя основу для развития бесплодия.
Моделирование межгенных взаимодействий в системе детоксикации при идиопатическом мужском бесплодии Исследование межгенных взаимодействий представляется наиболее важным и ответственным этапом в изучении генетических основ мультифакториальных заболеваний. В рамках настоящего исследования для моделирования взаимодействия генов был использован один из наиболее популярных в генетической эпидемиологии подходов - Multifactor Dimensionality Reduction (MDR) [Moore J.H. et al., 2002; Ritchie M.D. et al., 2003; Hahn L.W. et al., 2003]. Метод позволяет на небольших выборках проводить одновременный анализ множества полиморфных генов, выбирая из них такие комбинации, которые имеют наибольшую патогенетическую значимость для развития болезни. Для оценки межгенных взаимодействий с помощью метода MDR нами использовался алгоритм всестороннего поиска (Exhaustive search algorithm), который оценивал все возможные комбинации ДНК-маркеров в отношении риска развития ИМБ. Результат моделирования межгенных взаимодействий ФБК при ИМБ представлен в таблице 16
Как видно из таблицы 16 , среди всех n-локусных моделей наиболее значимой оказалась трехлокусная модель взаимодействия полиморфных генов GSTP1 I105V х MDR1 34350Т х NAT2 4810Т с воспроизводимость -100% и ошибкой предсказания модели - 41% (Монте-Карло р=0,01). На рисунке 3 показано распределение частот трехлокусных сочетаний генотипов полиморфизмов GSTP1 I105V, MDR1 343 5С Т и NAT2 481 ОТ, ассоциированных с повышенным и пониженным риском ИМБ у мужчин. Как видно из представленных на рисунке 3 данных, характер распределения генотипов в ячейках повышенного и пониженного риска отличается при различных межлокусных сочетаниях генотипов, что может свидетельствовать об эпистатических взаимодействиях указанных генов -ситуации, при которой активность одного гена находится под влиянием вариаций других генов. Феноменом эпистаза можно также объяснить и отсутствие ассоциаций генов MDR1 34350Т и NAT2 48ЮТ с ИМБ, когда их вклад в развитие болезни оценивался изолированно на первом этапе работы. Использование алгоритма Forced search позволило выявить
Рисунок 3 Распределение частот трехлокусных сочетаний генотипов полиморфизмов, ассоциированных с повышенным и пониженным риском ИМБ у мужчин (программа MDR vl.l.0)
Темно-серые ячейки - генотипы повышенного риска, светло-серые ячейки - генотипы пониженного риска, белые ячейки - отсутствуют сочетания генотипов (левые столбики в ячейках - больные ИМБ, правые - здоровые мужчины). несколько иной характер межгенных взаимодействий генов ФБК. Наилучшей моделью, которая характеризует взаимодействие генов ФБК при ИМБ, была
Анализ неравновесия по сцеплению и гаметических корреляций между генетическими маркерами или неслучайное сочетание аллелей разных локусов в гаметах представляет собой один из ответственных этапов генетико-эпидемиологических исследований. Важным достоинством данного анализа является то, что в случае выявления высокой частоты определенных аллельных комбинаций между различными локусами можно говорить о селективном преимуществе данных аллельных вариантов генов, которое поддерживается естественным отбором и, по-видимому, связано с функциональной сопряженностью генетических продуктов данных генов, контролирующих общие метаболические процессы [Фогель Ф, 1989].
Сначала были рассчитаны величины неравновесия по сцеплению (LD) между полиморфными вариантами I462V и Т6235С гена CYPJA1, -1259G/C и -1053С/Т гена CYP2E1, Y113H и H139R гена ЕРНХ1, 481С/Т и 590G/A гена NAT2 в каждой из исследуемых групп. Рассчитанные нестандартизированные коэффициенты гаметического неравновесия по сцеплению ( ) между полиморфизмами были следующими: между I462V и Т6235С гена CYP1A1 ZM),040 (р 0,0001) у здоровых мужчин, М),038 (р 0,0001) у больных ИМБ; между -1259G/C и -1053С/Т гена CYP2E1 D=l,0 (р 0,0001) у здоровых и у больных ИМБ мужчин; между Y113Н и H139R гена ЕРНХ1 Z 0,009 (р=0,48) у здоровых мужчин, М),020 (р=0,15) у больных ИМБ; между 481 С/Т и 590G/A гена NAT2 Z =—0,101 (р 0,0001) у здоровых мужчин, =-0,105 (р 0,0001) у больных ИМБ. Таким образом, за исключением полиморфизмов Y113H и H139R гена ЕРНХ1 между парами ДНК-маркеров были выявлены статистически значимые отклонения от независимого наследования. Причем
Роль взаимодействия генов ФБК со средовыми факторами в реализации предрасположенности к идиопатическому бесплодию и вариабельности показателей сперматограммы у мужчин
Основной функцией фермента GSTP1 является конъюгация восстановленного глутатиона с реактивными эпоксидными метаболитами ПАУ и гетероциклическими аминами, образующимися в результате активации системой цитохромов Р-450. Субстратами GSTP1 являются: бензо[а]пирен диол эпоксид, акролеин, хлорамбуцил и кротонилоксиметил-2-циклогексенон [Hayes J.D. et al, 2005]. Установлено, что аллельные варианты полиморфизма I105V влияют не только на ферментативную активность и субстратную специфичность GSTP1 посредством изменения участка связывания с электрофильными субстратами в полипептидной цепи фермента. Так известно, что аллель дикого типа Не 105 более активен в отношении метаболизма 3,4-дихлоро-1-нитробензина, тогда как вариантный аллель Vail05 в 7 раз более активен в метаболизме ПАУ [Ali-Osman F., 1997; Welfare М.,1999]. В целом функциональные исследования показывают, что аллель Уа1105связан с пониженной стабильностью к температуре и активностью фермента в метаболизме различных классов ксенобиотиков [Zimniak Р, et al, 1994; Johansson AS, et al, 1998]. Кроме того, вызывает интерес факт того, что аллель Vail05 также ассоциирован с повышенным риском развития рака простаты, яичек и мочевого пузыря [Harries LW, et al, 1997]. Таким образом, носительство вариантного аллеля Vail05 гена GSTP1 может рассматриваться в качестве ДНК-маркера не только идиопатического бесплодия у мужчин, но и разнообразных онкологических заболеваний органов мужской репродуктивной системы, в тканях которой фермент экспрессируется на достаточно высоком уровне (приложение 7). По-видимому, недостаточная активность фермента GSTP1, связанная с наличием аллеля Vail 05, способствует накоплению реактивных форм ксенобиотиков (в частности, полициклические углеводороды и гетероциклические амины), активированных системой цитохромов-Р450 на первой фазе биотрансформации. В результате создаются условия для возникновения окислительного стресса и повреждения не только сперматозоидов, но и клеток, участвующих в их созревании и дифференцировки. Наше предположение согласуется с литературными данными [Hemachanda Т. and Shaha С, 2003] а также с результатами, полученными недавно в голландской популяции инфертильных мужчин [Raijmakers М.Т.М, et al, 2009]. Авторы исследования показали, что экспрессия GSTP1 в семенной жидкости играет важную роль в защите сперматозоидов от окислительного повреждения реактивными формами кислорода, а глутатион — кофактор глутатион трансфераз регулирует подвижность и морфологию сперматозоидов и может играть роль в развитии бесплодия у мужчин.
Нами также было установлено, что гомозиготный делеционный генотип del/del гена GSTT1 ассоциировался с пониженным риском развития ИМБ. Среди больных ИМБ был только один носитель данного генотипа, тогда как в контрольной группе обнаружено 29 носителей генотипа del/del. Как известно, фермент GSTT1 вовлечен в конъюгацию глутатиона с высоко реактивными компонентами табачного дыма и промышленными загрязнителями атмосферы, такими как моногалометаны (галометан, дихлорметан, метилбромид, метиленхлорид) и этиленоксиды [Hayes JD et al, 2005]. Специфичными субстратами GSTT1 являются 1,3-бис(2-хлороэтил)-1-нитрозомочевина, бутадиен эпоксид, 1,2-эпокси-3-(р-нитрофенокси)пропан и этилен оксид [Hayes JD et al, 2005]. Протяженная делеция в кодирующей части гена GSTT1 (т.н. делеционный полиморфизм) сопровождается блокированием синтеза фермента [Welfare М. et al, 1999]. В этой связи делеционный полиморфизм гена GSTT1 был подробно исследован как генетический маркер предрасположенности к различным формам рака [Coughlin SS, Hall IJ., 2002; Chan-Yeung M. et al, 2004; Hung R.J. et al, 2004]. Кроме того, делеционный полиморфизм гена GSTT1 исследовался в отношении риска развития бесплодия и нарушений сперматогенеза у мужчин. Так, была установлена связь нулевого генотипа гена GSTT1 с идиопатической азооспермией и олигоспермией у инфертильных мужчин китайской национальности [Wu QF, et al, 2007], тогда взаимосвязи полиморфизма с предрасположенностью к ИМБ обнаружено не было. Позже в той же китайской популяции была установлена связь делеционного генотипа гена GSTT1 с риском развития бесплодия у мужчин, страдающих варикоцеле [Wu Q, et al, 2009]. В нашем исследовании, делеционный генотип, наоборот, ассоциировался с пониженным риском развития ИМБ, что, в целом, не согласуется с многочисленными исследованиями, демонстрирующими негативное влияние данного генотипа на развитие различных патологических состояний. Хотя подавляющее большинство исследований обнаружило негативное влияние делеционного генотипа гена GSTT1 на риск развития различных заболеваний (согласно базе данных The Genetic Association Database, http://geneticassociationdb.nih.gov), нами были найдены работы, в которых были опубликованы данные о протективном эффекте делеционного генотипа гена GSTT1 в отношении риска развития некоторых болезней. Так, протективный эффект делеционного генотипа гена GSTT1 был обнаружен в отношении риска развития рака желудка [Ruzzo A, et al, 2007], почек [Buzio L, et al, 2003], предстательной железы [Komiya Y, et al, 2005], а также облитерирующего атеросклероза нижних конечностей у курильщиков [Li R, et al, 2001]. Эти результаты показывают, что экспрессионный генотип может выступать в качестве фактора риска развития различных заболеваний, вероятно, как генетический модификатор токсического воздействий каких-либо ксенобиотиков на организм. В частности известно, что фермент GSTT1 способен конъюгировать с природными и синтетическими галоалканами и некоторыми ПАУ с образованием высокотоксичных GSH-конъюгатов [Thier R, et al, 1996; Wheeler JB, et al, 2001a и b; Середенин С.Б., 2004]. В этой связи заслушивает внимания результаты, полученные в корейской популяции, свидетельствующие о том, что у курильщиков носителей функционирующего генотипа (+) гена GSTT1, в сравнении с делеционным генотипом гена, имеет место почти 1,5-кратное увеличение в моче уровня 1-гидроксипирена
