Содержание к диссертации
Стр.
Список сокращении, встречающихся в диссертации 4
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
1.1. Липопротеиды высокой плотности и атеро
склероз . 12
I.I.I. Основные классы липопротеидов. Клас
сификация, белково-липидный состав,
метаболизм 12
1.1.2« Акцепция холестерина с мембран кле
ток сосудов липопротеидами высокой
плотности 20
I.I.3. Дисальфалшгапротеидемии 23
1.2. Физико-химические характеристики липопротеи
дов высокой плотности; связь с белково-ли-
пидным составом 26
Общие черты молекулярной организаии липопротеидов высокой плотности . . 26
Методы магнитной радиоспектроскопии и флуоресцентной спектроскопии в исследованиях структурных характеристик липопротеидов высокой плотности . . 31
Термоиндуцированные перестройки в молекулярной организации липопротеидов 38
Физико-химические характеристики ли-попротеидных частиц при дислипопро-теидемиях 42
1.3. Постановка задач исследования 46
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И ІШОЩІ ШСВДОВАНШ 50
2.1. Объекты исследования 50
Стр.
Выделение лшіопротеидов и их характеристика 51
Спиновые метки. Получение спин-меченых препаратов лшіопротеидов 54
Регистрация спектров ЭПР и анализ их параметров 57
Оценка способности липопротеидных частиц связывать спин-меченые липиды 60
Математическая обработка результатов исследования . . 62
2.7. Использованные реактивы 62
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 63
Спектры ЭПР спин-меченых лшіопротеидов высокой плотности 63
Структурные характеристики липопротеидов высокой плотности при дисальфалипопротеи-демиях и ИБС 77
Термоиндуцированные изменения параметров вращательной диффузии спиновых меток в ли-попротеидах высокой плотности 88
Связывание спиновых меток лшгопротвидами высокой плотности при дисальфалипопротеи-демиях и ИБС . НО
Электрические свойства поверхности липопротеидов высокой плотности 120
Спектры ЭПР спин-меченого холестерина в липопротеидах высокой плотности при гипо-альфалипопротеидемии 129
Физико-химические характеристики подфрак-ций ЛПВП2Й ( d =1,070-1,100 г/мл) и JUMIg
( d=I,I25-I,200 г/мл) . 133
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 144
ВЫВОДУ 149
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 151
Список сокращений, встречащихся в диссертации:
ЛПОНП - липопротеиды очень низкой плотности,
ЛШП - липопротеиды низкой плотности,
ЛПВП - липопротеиды высокой плотности,
ЛБПП - липопротеиды промежуточной плотности,
ХМ - хиломикроны,
ЛХАТ - лецитин-холестерин-^ацилтрансфераза,
ИБО - ишемическая болезнь сердца,
ЭДТА - натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты,
ЭПР - электронный парамагнитный резонанс,
ЯМР - ядерный магнитный резонанс,
СТВ - сверхтонкое взаимодействие.
Введение к работе
Одной из актуальных проблем современной молекулярной кардиологии является выяснение механизмов патогенеза атеросклероза. Особое место в этой проблеме занимает исследование взаимосвязи между физико-химическими свойствами липопротеидов плазмы крови и их функционированием. Система липопротеидов является основной транспортной формой липидов в организме человека, Липопротеидные комплексы плазмы делят на хиломикроны, липопротеиды очень низкой плотности (ЛПОШ), низкой плотности (ЛПШ) и высокой плотности (ЛПВП), различающиеся химическим составом, размерами частиц, элек-трофоретической подвижностью. ЛПВП принято рассматривать как совокупность двух основных подклассов - ЛПВПо и ЛПВПо. Согласно современным представлениям /21,22,125,149,158,188,192,193,229,241/, ЛПОШ и ЛПНП доставляют липиды к периферическим тканям, в частности, к гладкомышечным клеткам сосудистой стенки. ЛПВП способны выполнять противоположную функцию - акцептировать холестерин с клеточных мембран и переносить его в печень для дальнейшего катаболизма. Накопление холестерина в сосудистой стенке является одним из основных звеньев в развитии ее атеросклеротического поражения /20,22,113,132,224/. Клиническим проявлением атеросклероза венечных артерий сердца является ишемическая болезнь сердца (ИБС). В связи с этим принципиальное значение имеет исследование физико-химических характеристик ЛПВП, изменения которых, очевидно, отражаются на холестерин-акцепторных и холестерин-транспортных свойствах этих частиц.
Данные эпидемиологических и клинических обследований /24,32, 77,101,175,176,224,228/ свидетельствуют о том, что понижение в
плазме крови уровня холестерина ЛПВП - гипоальфалипощютеидемия -увеличивает вероятность развития ИБС и других заболеваний, связанных с атеросклерозом. Повышенный уровень холестерина ЛПВП в плазме - гиперальфалипопротеидемия, наоборот, является антириск-фактором этих заболеваний. Обнаружено /8-10,41,42,46,95,152/, что дисальфалипопротеидемии и ИБС сопровождается характерными изменениями в составе липопротеидов. Представляло интерес выяснить, сопряжено ли это с изменениями в молекулярной упаковке и физико-химических характеристиках поверхности частиц ЛПВП.
В настоящее время постоянно возрастает число публикаций, посвященных исследованию структурных характеристик липопротеидов плазмы крови с использованием таких современных методов, как малоугловое рассеяние рентгеновских лучей /166,236/, микрокалориметрия /146,200,236/, флуоресцентная спектроскопия /13,136,222/, спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и электронного пара-магнитного резонанса (ЭПР) /75,123/. Большая часть этих работ выполнена на препаратах, выделенных из плазмы крови лвдей с нормальными характеристиками. Авторы исследований, в которых использовались препараты, выделенные из плазмы крови животных с экспериментальным атеросклерозом /146,200,236/ или лвдей с некоторыми типами дислипопротеидемий /194/, ограничивались изучением ЛПНП и Ш0НП.
В данной работе исследованы физико-химические характеристики двух основных подклассов липопротеидов высокой плотности, выделенных из плазмы крови мужчин без признаков ИБС с повышенным, нормальным и сниженным уровнем холестерина ЛПВП. Ш исследовали также характеристики ЛПВП2 и ЛЛЕН^і выделенных из плазмы крови больных ИБС с документированным ангиографически атеросклерозом венечных артерий, с ?ем, чтобы сравнить их с характеристиками
аналогичных фракций лиц без признаков ИБС с гипоальфалипопротеи-демией. Для решения поставленных задач использован один из наиболее адекватных биофизических методов - метод ЭПР-спектроскопии спиновых меток. За последние два десятилетия этот современный радиоспектроскопический метод стал одним из наиболее перспективных для исследования модельных и биологических мембран. Имеющиеся литературные данные /3,13,19,240/ позволяют предполагать, что поверхностный белково-липидный монослой липопротеидных частиц близок по своему строению к обычным бислойным биологическим мембранам.
Данная работа явилась продолжением исследований, начатых 8 лет назад во Всесоюзном кардиологическом центре АШ СССР по изучению лшюпротеидов плазмы крови в норме и при патологии методом ЭПР-спектроскопии спиновых меток.
Актуальность проблемы. Диссертационная работа посвящена одной из актуальных проблем современной биохимии и молекулярной биофизики - выяснению связи между структурой и функциями физиологически важных белок-%липидных комплексов. Такими комплексами, в частности, являются лшюпротеиды высокой плотности плазмы крови человека. Имеются данные о том, что при ИБС снижается холестерин-акцепторная способность этих липопротеидов /I/, что, вероятно, ведет к развитию заболевания. В связи с этим для понимания механизмов атерогенеза крайне необходимо выяснить, изменяются ли физико-химические характеристжи ЛПВП при ИБС и гипоальфалипопротеиде-мии - факторе риска ИБС, а также при гиперальфалипопротеидемии -антириск-факторе заболевания.
Если изменения в белково-липидном составе липопротеидов, сопровождающие дисальфалипопротеидемии, интенсивно изучаются /9,10, 41,42,45,46/, то физико-химические свойства ЛПВПз и -^% при
дисальфалипопротеидемиях практически не исследованы. Не выяснено, изменены ли в этих условиях молекулярная упаковка липидов и электрические свойства поверхности ЛПВІІ2 и ЛПВП3; отсутствуют данные об изменении при гипоальфалипопротеидемии размеров областей, в которых липиды липопротеидных частиц находятся в жидкокристаллическом состоянии. Между тем именно изменения физико-химических характеристик ЛПВП могут повлиять на взаимодействие этих частиц с клетками сосудистой стенки и ферментами плазмы крови, на способность липопротендов снимать излишки холестерина с мембран клеток.
Поскольку состав и концентрация в плазме крови ЛПВПо и ЛПВПо по-разному меняются при дисальфалипопротеидемиях /9,10,59/, то в качестве основного объекта исследования в работе использованы препараты этих подклассов. Однако, известно /59/, что ЛПВП2 и ЛПВПз частично перекрываются по плотности и размерам липопротендов, причем степень перекрывания различна в норме и при дисальфалипопротеидемиях. В связи с этим представлялось целесообразным выяснить, сохраняются ли основные закономерности, полученные для ЛЇЇШІ2 и ЛПВПз, при использовании в качестве объекта исследования подфракций ЛПШ26 и ЛПВП3, практически не перекрывающихся по диапазону плотности /59/.
Цель и задачи работы. Цель исследования заключалась в том, чтобы выяснить, изменены ли при дисальфалипопротеидемиях и ИБО физико-химические характеристики подклассов липопротендов высокой плотности плазмы крови человека. Для этого потребовалось провести сравнительное ЭПР-спектроскопическое исследование подклассов ЛПВП, выделенных из плазмы крови лиц без признаков ИБО в норме, с гипо-и гиперальфалипопротеидемией, а также больных ИБО.
Конкретные задачи работы заключались в следующем:
Исследовать характеристики молекулярной упаковки полярных липидов в ЛПВП2 и ЛПВП3.
Изучить термоиндуцировашше изменения физического состояния липидных областей поверхностного монослоя ЛПВІІ2 и ЛПВПд.
Провести количественную оценку способности ШВП2 И ЛПШд связывать соединения из классов жирных кислот и стероидов.
Исследовать электрические свойства поверхности частиц ЛПВП2 и ЛПВПд.
Изучить солюбилизацию спин-меченого производного холестерина частицами ЛПВП2 и ШВПд.
Сопоставить физико-химические характеристики ЛІШП2 ж ^Щ$ с результатами исследования фракций ЛШШ2о- и ЛПВП^.
Научная новизна работы. Впервые показано, что при гипо- и гиперальфалипопротеидемиях происходят изменения физико-химических характеристик подклассов липопротеидов высокой плотности плазмы крови человека. Установлено, что эти изменения у лиц без признаков ИБС с гипоальфалипопротеидемией носят такой же характер, как у больных ИБС с коронарным атеросклерозом. Показано, что значения критических температур, при которых происходят термоиндуцирован-ные структурные перестройки в поверхностном монослое ЛПШ2 И ЛПВПд, различны в норме и при гипоальфалипопротеидемии и ИБС. Произведем на количественная оценка способности сорбировать спин-меченые жирную кислоту и стероид для частиц ЛПВП2 и ЛПВП3, выделенных из плазмы крови лиц без признаков ИБС в норме, с гипо- и гиперальфа-липопротеидемией, а также больных ИБС. Получены численные значения параметров, характеризующих электрические свойства поверхности частиц ДПВП2 и ЛПВПд лиц без признаков ИБС с нормальным уровнем холестерина ЛПВП и больных ИБС с гипоальфалипопротеидемией. Обна-
ружены различия в физико-химических характеристиках основных подклассов ЛТШП и неодинаковые изменения их при дисальфалипо-протеидемиях и ИБО.
Практическое значение работы. Из результатов работы следует, что нарушение "антиатерогенной" функции ЛПВП при гипоальфалипо-протеидемии и ИБО может происходить не только за счет уменьшения концентрации частиц в плазме, но и за счет изменения их физико-химических свойств, способных повлиять на холестерин-акцепторную и холестерин-транспортную функции подклассов ЛТШП. Полученные данные могут служить основой для выявления "атерогенных" изменений в липопротеидных частицах при отсутствии гиперлипидемии. Результаты диссертации могут учитываться при разработке подходов к направленной коррекции нарушений в системе липопротеидов плазмы крови и стимуляции антиатерогенних механизмов. Полученные результаты могут найти практическое применение в лабораториях медико-биологического профиля, где исследуются проблемы, связанные с направленным транспортом липидов в организме в норме и при патологии, в том числе атеросклерозе.
Апробация работы. Апробация диссертации состоялась на межлабораторном семинаре НИИ экспериментальной кардиологии ВКНЦ АМН СССР 25 декабря 1984 г.
Основные результаты работы докладывались на III Всесоюзном симпозиуме "Структура, биосинтез и превращения липидов в организме животного и человека" (г. Ленинград, 1978), У Международном симпозиуме по атеросклерозу (Хьюстон, СШ/L, 1979), У Совещании по конформационным изменениям биополимеров в растворах (г. Телави, 1980), II Всесоюзном симпозиуме "Магнитный резонанс в биологии и медицине" (Звенигород, 1981), I советско-американском симпозиуме
-li-
no лшіопротеидам высокой плотности (г. Ленинград, 1981), Всесоюзной конференции по нитроксильным радикалам (г. Черноголовка, 1982), I Всесоюзном биофизическом съезде (г. Москва, 1982), 16 конференции Федерации европейских биохимических обществ (г. Москва, 1984).
