Введение к работе
Актуальность темы.
Атеросклероз и ишемическая болезнь сердца - одни из наиболее частых причин смертности в развитых странах, причём основные осложнения этих заболеваний вызваны повреждением стенки сосудов. В настоящий момент не вызывает сомнений тот факт, что модифицированные липопротеиды низкой плотности (ЛНП), значительно отличающиеся от нативных частиц по физико-химическим свойствам, играют важную роль в атерогенном повреждении сосудов. Несмотря на то, что агенты, способные принимать участие в модификации ЛНП, достаточно разнообразны, наибольшую роль в этом процессе, как полагают, играют низкомолекулярные природные дикарбонилы [Меньщикова и соавт., 2008].
В процессе окислительного стресса низкомолекулярные карбонилы могут накапливаться в качестве вторичных продуктов свободнорадикального окисления липидов, при этом образуется малоновый диальдегид (МДА) и др. альдегиды [Панкин и соавт., 2000-2004]. В последние годы в качестве возможных модификаторов ЛНП рассматриваются также альдегиды, образующиеся при карбонильном стрессе в реакциях автоокисления глюкозы, сопровождающих развитие сахарного диабета, причём основными карбонильными продуктами являются глиоксаль, метилглиоксаль и др. [Меньщикова и соавт., 2008]. Структуры альдегидов, генерируемых в процессе свободнорадикального окисления липидов и в процессе автоокисления глюкозы и триозофосфатов, весьма схожи, более того, метилглиоксаль и МДА являются структурными изомерами.
Известно, что больные сахарным диабетом имеют повышенную склонность к развитию атеросклероза, причём при этом заболевании выявлена прямая корреляция между уровнем гипергликемии и выраженностью сосудистых поражений [Bucala, 1997]. При этом соединения, способные связывать накапливающиеся в кровотоке дикарбонилы, могут рассматриваться как наиболее перспективные лекарственные препараты для лечения сахарного диабета. Таким образом, исследование, посвященное изучению молекулярных механизмов атерогенной модификации ЛНП под действием различных природных альдегидов, представляется весьма актуальным. Настоящее исследование посвящено изучению сравнительного биологического действия природных альдегидов различного происхождения и его возможных патогенетических последствий.
Цель исследования
Целью настоящего исследования является выяснение особенностей механизмов атерогенной модификации ЛНП под действием низкомолекулярных природных альдегидов, образующихся при свободнорадикальном окислении липидов (на примере МДА) и автоокислении глюкозы и триозофосфатов (на примере метилглиоксаля), а также определение патогенетического значения карбонильной модификации ЛНП.
Задачи исследования:
1. Провести сравнительное исследование роли первичных
(липогидропероксиды) и вторичных (низкомолекулярные дикарбонилы) продуктов
свободнорадикального окисления липидов в увеличении атерогенности ЛНП (усилении захвата частиц ЛНП моноцитами-макрофагами стенки сосуда).
Сравнить изменение физико-химических свойств ЛНП (по изменению суммарного поверхностного заряда частиц, накоплению флуорофоров в ЛНП и окисляемости ЛНП) при модификации ЛНП под действием МДА и метилглиоксаля.
Изучить особенности агрегации ЛНП после их модификации природными низкомолекулярными альдегидами различного происхождения.
С использованием различных методов (спектрофотометрия, хемилюминесценция, ЭПР-спектроскопия) исследовать возможность образования активных форм кислорода и органических свободнорадикальных интермедиатов в ходе реакции Мэйларда (реакции аминогруппы апобелка с альдегидной группой).
С помощью иммуноферментного анализа (моноклональные антитела к МДА-модифицированным и метилглиоксаль-модифицированным ЛНП) исследовать антигенные свойства эпитопов, образующихся в апопротеине В-100 при его взаимодействии с природными низкомолекулярными альдегидами различного происхождения.
Научная новизна
Впервые показано, что усиленный захват ЛНП культивируемыми макрофагами
человека происходит при альдегид-зависимой модификации апопротеина В-100, но
не при накоплении ацилгидропероксидов в наружном фосфолипидном слое частиц.
При сравнительном исследовании физико-химических свойств ЛНП установлено,
что МДА в большей степени влияет на изменение структуры апопротеина В-100 и
поверхностного заряда частицы, тогда как модификация метилглиоксалем
провоцирует интенсификацию свободнорадикального окисления липидной
компоненты ЛНП и значительное усиление агрегации частиц. Впервые с помощью
различных методов (хемилюминесценция, спектрометрия) обнаружено
генерирование активных форм кислорода при реакциях аминогруппы апобелка с
метилглиоксалем. На основании качественного анализа образующихся
свободнорадикальных интермедиатов, регистрируемых методом ЭПР, предложен
механизм автокаталитического усиления окислительного стресса в процессе
метилглиоксаль-зависимой модификации ЛНП. С использованием
иммуноферментного анализа выявлены принципиальные различия в антигенной структуре образующихся эпитопов в апопротеине В-100 при модификации ЛНП в присутствии МДА и метилглиоксаля. Установлено, что атерогенные (обогащенные холестерином) ЛНП являются одновременно и наиболее окисленными.
Практическая значимость
Полученные результаты уточняют молекулярные механизмы взаимодействия лизиновых остатков белков с МДА и метилглиоксалем и позволяют связать выявленные различия в молекулярных механизмах со степенью атерогенности ЛНП. Кроме того, полученные результаты свидетельствуют о важной роли карбонильной модификации ЛНП в атерогенезе, и позволяют рассматривать уровень карбонил-модифицированных ЛНП в качестве независимого фактора риска развития атеросклероза. Выявленные в работе различия в антигенной
специфичности различных моноклональных антител к модифицированным ЛНП могут служить основой для разработки подходов к селективной экспресс-диагностике атеросклероза и сахарного диабета.
Апробация работы
Результаты диссертационной работы были представлены на нескольких научных конференциях: IV - VII Международные крымские конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии» (Судак, Украина, 2008-2011), IV Конгресс биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), 12-я Международная Пущинская школа-конференция «Биология - наука XXI века» (Пущино, Россия, 2008), Научно-практический симпозиум с международным участием «Свободнорадикальная медицина и Антиоксидантная терапия» (Волгоград, Россия, 2008), Всероссийская конференция молодых учёных «Окисление, Окислительный стресс, антиоксиданты» (Москва, Россия, 2008), 6-th National Scientific Practical Conference with International Participation "Reactive oxygen species, nitric oxide, antioxidants and human health" (Smolensk, Russia, 2009), Российский национальный конгресс кардиологов (Москва, 2009), VIII Международная конференция «Биоантиоксидант» (Москва, Россия, 2010), а также на межлабораторном семинаре НИИ экспериментальной кардиологии ФГБУ РКНПК Минздравсоцразвития РФ 19 января 2012 г.
Публикации
По результатам работы опубликовано 6 статей и 18 тезисов, ещё 2 статьи находятся в печати.
Структура работы
Диссертация имеет стандартную структуру и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и их обсуждение, выводы, заключение и список литературы, содержащий 158 ссылок. Работа содержит 25 рисунков и 2 таблицы
