Введение к работе
Актуальность проблемы. Адаптация животного организма к аллоксановому экспериментальному диабету представляет сложный многоэтапный процесс, главным звеном которого является трансформация клеточного метаболизма. Индукция ферментов глиоксилатного цикла и цикла трикарбоновых кислот в тканях животных обеспечивает изменение основных путей метаболизма, обусловленных ресинтезом гликогена в печени крыс при патологиях, связанных с условиями пищевой депривации и экспериментального диабета [Епринцев А.Т. и др. 2007, Popov V.N. et al., 1998]. Ранее была установлена индукция маркерных ферментов глиоксилатного цикла в гепатоцитах крыс при аллоксановом диабете [Popov V.N. et al., 1996]. Кроме того, что глюконеогенез выступает как важнейший процесс при адаптивной реакции организма к экстремальным условиям, важную роль играет энергетический обмен, связанный, главным образом, с функционированием цикла Кребса. Следовательно, адаптация клеточного метаболизма обеспечивается соотношением интенсивности катаболизма и анаболизма глюкозы в клетках печени и других органов животного организма. Несмотря на значительное количество исследований об интенсивности ферментативной активности, обуславливающей скорость энергетического и синтетического процессов, остаются невыясненными многие факторы регуляции, такие как концентрация метаболитов, воздействие гормонов и другие [Попов В.Н. и др., 2005].
В литературе широко представлены работы об особенностях клинико-биохимических показателей при сахарном диабете. Данные морфологических исследований немногочисленны и зачастую разноплановы. В последнее время большое внимание исследователей направлено на изучение состояния нейроэндокринных центров и выяснение их участия в регуляции функций панкреатических островков [Жураковская О.Я., 2013, Revsin Y. et al., 2008].
Особый интерес вызывает молекулярный уровень регуляции ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла, связанный с экспрессионной регуляцией ферментов. Ранее было показано наличие двух изоформ аконитатгидратазы, малатдегидрогеназы. Однако исследований по генетической детерминации изоферментного полиморфизма этих и других ферментных систем в животных организмах в условиях экспериментального диабета нами не обнаружено. В связи с этим необходимо проведение анализа функционирования интенсивности экспрессии генов энзимов, участвующих с помощью изоферментов в обеспечении протекания как
энергетического обмена, так и процессов, обуславливающих синтетическую функцию метаболизма.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось комплексное
исследование физиолого-биохимических особенностей адаптации крыс при
аллоксановом диабете, включающее изучение экспрессионной регуляции ферментов
сукцинатдегидрогеназы, малатдегидрогеназы и аконитатгидратазы, обеспечивающих
трансформацию метаболических процессов, и выяснение изменений
гистологического характера во внутренних органах крыс в условиях аллоксанового диабета.
В связи с данной целью были поставлены следующие задачи:
-
Индуцировать с помощью аллоксана экспериментальный диабет у крыс и провести изучение физиолого-биохимических критериев, подтверждающих возникновение данной патологии у экспериментальных животных.
-
Осуществить гистологические исследования печени крыс в норме и при аллоксановом диабете.
-
Исследовать гистологические изменения клеток поджелудочной железы крыс в условиях экспериментального диабета.
-
Выяснить изменение активности ключевых ферментов глиоксилатного цикла и цикла Кребса в печени, поджелудочной железе и почках крыс, подвергшихся воздействию экспериментального диабета.
-
Установить субклеточную локализацию сукцинатдегидрогеназы, малатдегидрогеназы и аконитатгидратазы, активность которых меняется в тканях разных органов крыс при аллоксановом диабете.
-
Определить уровень экспрессии генов малатдегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы и аконитатгидратазы в печени крыс в норме и при аллоксановом диабете.
-
Исследовать роль метилирования в регуляции биосинтеза ферментов ЦТК и ГЦ в норме и при аллоксановом диабете.
-
Разработать гипотетическую схему адаптации крыс к экспериментальному диабету на морфо-физиологическом, биохимическом и экспрессионном уровнях.
Научная новизна. Полученные результаты позволяют расширить и углубить имеющиеся представления о способах адаптации животных на физиологическом, биохимическом и экспрессионном уровнях. Установлено, что при экспериментальном диабете, моделируемом с помощью экзогенного аллоксана, в печени и поджелудочной железе крыс наблюдаются изменения морфологических признаков, связанных со значительными отклонениями от контрольных образцов по составу, физическим индексам и размерам.
При экспериментальном диабете наблюдается активация исследуемых ферментов цикла трикарбоновых кислот и глиоксилатного пути в печени, почках и поджелудочной железе крыс, обусловленная увеличением митохондриальных форм малатдегидрогеназы и аконитатгидратазы, что, вероятно, связано с более высокой скоростью работы ЦТК. Показано, что индукция ферментов обусловлена синтезом de novo, так как наблюдается повышение интенсивности транскрипции их генов при адаптации к аллоксановому диабету.
Практическая значимость. Научные положения диссертационной работы позволяют разработать комплексный механизм адаптации животных к аллоксановому диабету на физиолого-биохимическом уровне. Результаты анализа экспрессионной регуляции сукцинатдегидрогеназы, малатдегидрогеназы и аконитатгидратазы в печени, поджелудочной железе и почках крыс могут служить основой для разработки тестов для идентификации патологических отклонений в организме при экспериментальном диабете.
Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по биохимии, физиологии человека и животных, спецкурсах по энзимологии, адаптационным механизмам животных. Кроме того, они используются при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.
Положения, выносимые на защиту.
1. Экспериментальный диабет индуцировал в паренхиме печени животных
признаки токсического гепатита в виде нарушения балочной структуры долек,
некроза гепатоцитов жировой и белковой дистрофии. Цитотоксическое действие
аллоксана и инсулиновая недостаточность приводили к патоморфологическим
изменениям в островковой части поджелудочной железы, носящим выраженный
деструктивный характер. При этом токсическому воздействию в наибольшей
степени подвергались Р-клетки и компоненты микроциркуляторного русла.
-
Аллоксановый диабет индуцирует активность ферментов, осуществляющих функционирование цикла Кребса в печени, почках и поджелудочной железе. Увеличение активности СДГ (маркерного фермента ЦТК) и митохондриальных изоформ МДГ и АГ свидетельствует об интенсификации катаболических процессов, повышающих энергетический потенциал клетки, что необходимо для осуществления адаптивной реакции.
-
Увеличение активности сукцинатдегидрогеназы, аконитатгидратазы и малатдегидрогеназы в условиях аллоксанового диабета осуществляется по механизму синтеза de novo. На это указывают результаты исследования уровней экспрессии генов sdha, mdhjntx и асо.
-
В печени, почках и поджелудочной железе крыс в условиях аллоксанового диабета резко повышается активность цитоплазматических форм АГ и МДГ, а также маркерных ферментов глиоксилатного цикла ИЦЛ и МС. При этом выявлено увеличение уровня транскрипции генов исследуемых ферментов, что свидетельствует об интенсификации их экспрессии в исследованных внутренних органах опытных животных.
-
Предлагается гипотетическая схема действия аллоксанового диабета на функционирование ключевых ферментов ЦТК и ГЦ во внутренних органах крыс. Увеличение количества глюкозы активирует с помощью глюкозо-сигнальных соединений фактор транскрипции ChREBP (углевод-реагирующий элемент связывающий белок), обуславливающий контроль процессов экспрессии исследуемых генов метаболитами глюкозы.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на международной юбилейной научно-практической конференции ВЭПИ-ВГЛТА (Воронеж, 2012); Всероссийской научно-практической конференции «Системная организация физиологических функций», посвященной 90-летию со дня основания кафедры физиологии человека и животных Воронежского государственного университета (Воронеж, 2012); Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2011); IV Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2011» (Воронеж, 2011); межрегиональных конференциях, посвященных памяти А.А. Землянухина "Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов" (Воронеж, 2011, 2012, 2013).
Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 12 публикациях - 9 статьях и 3 тезисах.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (199 источник). Иллюстрационный материал включает 6 таблиц и 28 рисунков.
