Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Токсикология фосфорорганических соединений и система гемостаза млекопитающих (Обзор литературы) 11
1.1. Фосфорорганические соединения (ФОС) и механизм их токсического действия 11
1.2 Структурно-функциональные аспекты гемостаза 22
Структура и функции тромбоцитов 22
Структура и функции эритроцитов 26
Гуморальный (плазменный) гемостаз 29
1.3 Гемостаз и возможные механизмы развития патогенеза при интоксикации ФОС 36
1.4 Обзор литературы: Резюме 41
Глава 2. Материалы и методы исследования 43
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение 57
3.1 - Динамика относительного изменения массы животных
после острого отравления 57
3.2 - Биохимические показатели в динамике после острого отравления крыс зоманом и RVX 58
3.3 - Исследование эстеразной активности крови 66
3.4 - Изменение параметров агрегации тромбоцитов
после острого отравления ФОВ 71
3.5 Исследование функционального статуса эритроцитов при интоксикации ФОВ 76
3.6 - Изменение показателей гуморального гемостаза после острого отравления зоманом и RVX 80
3.7 - Исследование активности ADAMTS13 в культуре эндотелиальных клеток 92
3.8 - Исследование сывороток крови крыс после отравления зоманом и RVX методом масс-спектрометрии с ионизацией лазерной десорбцией в присутствии матрицы (MALDI) 94
Заключение
Выводы
Список публикаций
Список литературы
- Фосфорорганические соединения (ФОС) и механизм их токсического действия
- Гемостаз и возможные механизмы развития патогенеза при интоксикации ФОС
- Биохимические показатели в динамике после острого отравления крыс зоманом и RVX
- Исследование функционального статуса эритроцитов при интоксикации ФОВ
Введение к работе
Актуальность проблемы
Заболевания, этиологически связанные с воздействием химических факторов, приобрели широкое распространение вследствие интенсивного развития химической промышленности, загрязнения производственной и окружающей среды. Фосфорорганические соединения (ФОС) - особая составляющая этих факторов, они широко используются в сельском хозяйстве и промышленности в качестве пестицидов, пластификаторов, компонентов в синтезе лекарственных веществ, полимерных материалов. Популярность и широта их использования обусловлена высокой эффективностью и быстрой деградацией в окружающей среде [Costa, 1997]. Примерно 80 различных ФОС используются в качестве инсектицидов, другие ФОС нашли свое применение в фармакологии [Pope et al., 2005], а также в военной токсикологии [Lotti, 2000, 2001] - это так называемые фосфорорганические отравляющие вещества (ФОВ).
В соответствии с Федеральной целевой программой «Уничтожение запасов химического оружия в Российской Федерации», одной из задач является обеспечение безопасности этого процесса для персонала объектов по хранению и уничтожению химического оружия, а также граждан, проживающих и работающих в зоне защитных мероприятий. В случае острого отравления антидоты позволяют сохранить жизнь людей, однако это не решает проблему медицинской реабилитации пострадавших, поскольку велика вероятность развития отдаленных последствий интоксикации. О развитии отставленной патологии можно судить по данным лабораторной и клинической диагностики, однако имеющиеся средства диагностики рассчитаны главным образом на оценку степени токсического поражения в ранние сроки интоксикации, тогда как оценка риска развития того или иного заболевания на более поздних сроках остается актуальной задачей. Неясен патогенез развития отдаленных последствий, отсутствует единая система физиолого-биохимических, цитологических и иммунологических маркеров для своевременной диагностики.
Наблюдения за пострадавшими в результате острого и хронического воздействия ФОВ выявили среди основных отставленных симптомов вегетативные изменения сердечнососудистой системы и «микроорганические расстройства» ЦНС неясной этиологии [Мусийчук, Янно, 1988]. Были основания предполагать, что сосудистая патология играет значимую роль в формировании отставленных последствий острого отравления [De Groot et al., 1993]. Результаты экспериментальных исследований при подостром и хроническом действии различных ФОС свидетельствовали о ведущей роли несинаптических механизмов в возникновении оставленных функциональных эффектов [Гончаров и др., 2001, 2002; Goncharov et al., 2003, 2004; Mindukshev et al., 2005]. Эти эффекты проявлялись при восстановлении активности и даже при отсутствии ингибирования холинэстераз, имели характер микроангиопатий в компенсаторной фазе, были связаны с нарушением эндотелий-зависимой релаксации сосудов, нарушением нервно-мышечной проводимости, изменением кинетических параметров агрегации тромбоцитов. Эксперименты показали, что тромбоцитарное звено гемостаза может служить индикатором состояния сосудистого русла при интоксикации ФОС. Другой группой ученых были получены морфологические доказательства поражения эндотелия на разных сроках после острого отравления [Прозоровский, Чепур, 2001; Чепур и др., 2006].
Однако проблема разработки и обоснования комплекса физиолого-биохимических методов диагности далека от решения. Методы морфологии не являются распространенным средством клинической диагностики. Используемые в настоящее время биомаркеры интоксикации ФОС (ацетилхолинэстераза, бутирилхолинэстераза) специфичны лишь в ранние сроки интоксикации. Более или менее полный анализ клеточного и плазменного гемостаза на дальних сроках после острого отравления не проводился, а имеющиеся данные о состоянии плазменного гемостаза на ранних сроках весьма скупы и недостаточны для оценки роли гемостаза в развитии патологии. Так, нарушения в системе гемостаза были отмечены у людей и в экспериментах на животных в течение первых суток после острого отравления ФОС-пестицидами [Namba et al., 1971; Gupta et al., 1982; Ziemen, 1984], зарином [Von Kaulla, Holmes, 1961] и зоманом [Lee, Clement, 1990].
В настоящее время исследования многих биохимиков, работающих в области токсикологии, сосредоточены главным образом на поиске продуктов деструкции ФОС или их аддуктов с белками, сохраняющихся в организме в течение более или менее длительного периода, с целью доказательства факта интоксикации [Worek et al., 2005; Radilov et al., 2009]. Гораздо меньше внимания уделяется переоценке распространенных и внедрению новых биохимических и функциональных методов клинической диагностики, которые могли бы пролить свет на механизмы патогенеза, помочь в создании своеобразного «спектра» физиолого-биохимических показателей, каждый из которых сам по себе не способен дать ответ на вопрос о тяжести поражения, критических сроках интоксикации и направленности патогенеза, но их совокупность, наряду с осмысленной интерпретацией, может обладать таким свойством.
Цель и задачи
Цель настоящей работы — исследовать состояние системы гемостаза, активность основных эстераз крови и ряд биохимических показателей на разных сроках после острого отравления фосфорорганическими отравляющими веществами (ФОВ) на примере зомана и вещества типа VX (RVX), определить критические сроки в развитии интоксикации и диагностическую значимость применяемых методов.
Для достижения данной цели были поставлены и решены следующие задачи:
Исследовать активность эстераз и другие биохимические показатели крови крыс в динамике при острой интоксикации зоманом и RVX.
Определить кинетические параметры агрегации тромбоцитов в динамике при острой интоксикации крыс зоманом и RVX.
Исследовать гемолитическую устойчивость эритроцитов при острой интоксикации крыс зоманом и RVX.
Исследовать состояние плазменного гемостаза крыс в динамике при острой интоксикации зоманом и RVX.
Определить критические сроки в развитии последствий острой интоксикации с точки зрения состояния системы гемостаза.
Положения диссертации, выносимые на защиту
Активность холинэстераз, аминотрансфераз и гамма-глутамилтрансферазы в крови крыс — биохимические маркеры острого отравления ФОВ исключительно на ранних сроках интоксикации.
Кинетические параметры агрегации тромбоцитов — неспецифические характеристики острого отравления ФОВ на всех исследованных сроках интоксикации.
Определение гемолитической устойчивости эритроцитов - новый функциональный тест для оценки характера патогенеза на средних и поздних сроках острой интоксикации ФОВ.
Определение динамики показателей плазменного гемостаза необходимо для выявления критических сроков и механизма развития последствий при острой интоксикации ФОВ.
Научная новизна
С использованием высокотоксичных ФОВ - зомана и RVX - впервые проведено комплексное изучение гуморального и клеточного звеньев гемостаза в динамике в ходе продолжительного эксперимента. При этом проведен анализ биохимической активности холинэстераз эритроцитов и плазмы с точки зрения надежности этих показателей для оценки степени и тяжести поражения на разных сроках интоксикации. Предложено теоретическое объяснение и экспериментальное обоснование динамики ряда биохимических показателей в крови животных при остром воздействии ФОВ. Методология малоуглового светорассеяния впервые использована для комплексного исследования кинетических параметров агрегации тромбоцитов и гемолитической устойчивости эритроцитов, что позволило по-новому охарактеризовать степень интоксикации ФОВ, понять особенности патогенеза и характер токсикодинамики, выявить критические периоды патогенеза. Также впервые в токсикологических исследованиях показана динамика активности металлопротеиназы ADAMTS-13 при интоксикации ФОВ, наряду с активностью ее субстрата -протромбогенного фактора Виллебранда. С целью поиска новых маркеров интоксикации впервые проведен анализ низкомолекулярных пептидов плазмы, в результате чего был выявлен ряд пептидов — продуктов ограниченного протеолиза фибринопептида А, образующихся в результате активности экзопептидаз. Полученные данные проанализированы с точки зрения состояния системы гемостаза и сосудистого русла, что позволило по-новому оценить ту роль, которую играют эндотелиальные клетки сосудов в выживаемости организма и развитии последствий интоксикации.
Теоретическое и практическое значение работы
Проведенные исследования расширяют представления о механизмах токсикодинамики при острой интоксикации ФОВ, позволяют лучше понять взаимосвязь специфических и неспецифических проявлений интоксикации. Особое значение имеет тот факт, что в работе не просто получены новые данные для токсического вещества фосфорорганической природы, но по сути проведен сравнительный анализ двух наиболее токсичных отравляющих веществ, являющихся компонентами химического оружия. Поэтому данные, полученные в настоящей работе, помогут в определении новых критериев диагностики отравлений ФОВ, в понимании механизмов патогенеза отдаленных последствий интоксикации, формулировке новых принципов терапии на разных сроках интоксикации ФОВ.
Исследованные вещества фосфорорганической природы обладают различными токсикокинетическими характеристиками, а потому имеют различный спектр молекулярных и клеточных мишеней. Данный факт имеет большое значение для других, «гражданских» областей человеческой деятельности, поскольку аналогичные проблемы, связанные с диагностикой и терапией отравлений фосфорорганическими соединениями, существуют в сельском хозяйстве и промышленном производстве ФОС.
Использование новой методологии малоуглового светорассеяния для изучения морфофункциональных характеристик клеток крови свидетельствует о ее высокой эффективности для определения характера интоксикации, что является несомненным вкладом в методическое обеспечение физиолого-биохимических и токсиколого-фармакологических исследований. Данные о динамике активности металлопротеиназы ADAMTS-13, полученные в экспериментах in vivo и in vitro с использованием культуры эндотелиальных клеток, имеют важное теоретическое значение и заставляют интенсифицировать исследования функциональной роли эндотелия для понимания механизмов токсикокинетики, токсикодинамики и фармакологической коррекции. Полученные в работе практические результаты и теоретические обобщения могут быть использованы в лекционных курсах по биохимии, физиологии и токсикологии.
Апробация работы
Результаты исследований представлены: на международном семинаре «Предупреждение и устранение последствий химически опасных чрезвычайных ситуаций, обусловленных терроризмом и промышленными авариями» (Санкт-Петербург, 2007), на 3-м съезде токсикологов России (Москва, 2008), на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная регуляция» (Пущино, 2009), на Токсикологическом Обществе США (Солт-Лейк-Сити, 2010), на Питтсбургской конференции (Орландо, 2010).
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 12 таблиц и 72 рисунка. Состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, 8 экспериментальных разделов, обсуждения, заключения и выводов. Библиография включает 39 отечественных и 255 зарубежных источников.
Фосфорорганические соединения (ФОС) и механизм их токсического действия
Степень интоксикации может не коррелировать со степенью ингибирования АХЭ. Так, при одинаковой степени ингибирования АХЭ у крыс паратион для них более токсичен по сравнению с хлорпирифосом [Pope, 1999]. Имеются также примеры, когда наличие токсических признаков не сопровождается ингибированием холинэстераз. Например, у рабочих, занятых в производстве хлорофоса, было отмечено снижение памяти, способности обучения, бдительности и моторной реакции, хотя уровень активности АХЭ в крови был такой же, как в группе контроля [Srivastava, 2000]. Хроническое низкоуровневое воздействие ФОС индуцирует нейропсихические расстройства без ингибирования эстеразной активности [Ray, Richards, 2001]. Активность холинэстераз плазмы крови высоко вариабельна, зависит от воздействия различных экзогенных факторов и изменяется при патологии, не имеющей отношения к ФОС-интоксикации [Costa, 1996].
АХЭ является одной из нескольких сотен сериновых гидролаз. Каждая сериновая гидролаза имеет свою специфическую функцию и каждое ФОС имеет уникальный ингибиторный профиль. Выявлено около 50 мишеней из числа сериновых гидролаз, но только некоторые из них изучены более полно. Бутирилхолинэстераза (БХЭ, КФ 3.1.1.8), известная еще как псевдохолинэстераза, обнаружена в плазме крови, в печени, сердце, эндотелии сосудов, нервной системе [Barbosa et al., 2001]. Была показана роль АХЭ и БХЭ в качестве стимулятора пролиферации в процессах развития. БХЭ играет ключевую роль в нейрогенезе [Mack, Robitzki, 2000]. Во взрослом организме при их отравлении малыми дозами ФОС или карбаматов БХЭ, предположительно, выполняет защитную функцию, связывая часть попавшего в организм токсиканта, тем самым, снижая его острую токсичность [Barbosa et al., 2001; Padilla et al., 1994]. БХЭ участвует в процессах метаболизма широкого спектра эндогенных и экзогенных субстратов и биотрансформации ксенобиотиков, переводя, например, неактивные предшественники лекарственных препаратов в активную форму в процессе их метаболической активации [Tunek et al., 1991]. Так как активность АХЭ и БХЭ ингибируется при воздействии ФОС, измерение этих активностей широко используется как индикатор токсического действия ФОС. Различные ФОС ингибируют активность АХЭ эритроцитов и БХЭ плазмы в разной степени. Например, кислородсодержащие аналоги малатиона, хлоропирифоса или дихлофоса сильнее ингибируют БХЭ плазмы, чем АХЭ эритроцитов. Кроме того, стоит учитывать большой разброс активности эстераз (особенно БХЭ) среди разных индивидов. Как было показано в нескольких экспериментальных моделях на животных, активность АХЭ из эритроцитов лучше коррелирует с активностью АХЭ из мозга, чем активность БХЭ из плазмы [Padilla et ah, 1994]. Наконец, следует отметить особенности старения БХЭ, ингибированной различными ФОС: в экспериментах in vitro было показано, что БХЭ вообще не подвержена старению в случае взаимодействия с VX или RVX, стареет по «классическому» варианту (разрыв связи О-С) при взаимодействии с зарином, зоманом и рядом других ФОС, а также может стареть «нетрадиционным» способом при взаимодействии с малатионом - путем разрыва связей P-S (основной вариант), S-C и О-С (второстепенные варианты) [Li et al., 2007].
Помимо холинэргического кризиса, некоторые ФОС способны вызывать иной тип нейротоксичности — центрально-периферическую дистальную сенсорномоторную аксонопатию, известную как отставленный нейротоксический эффект (ОНЭ) [Lotti, 1992] или ФОС-индуцированная отставленная полинейропатия (ОПН) [Ray, 1998]. Симптомы ОНЭ или ОПН проявляются через 1-4 недели после единичной дозы ФОС, после того как холинэргические симптомы уже прошли, и включают в себя спазматические мышечные боли в ногах, прогрессирующую слабость в ногах вслед за истощением и ослаблением дистальных лимбических мышц. Полагают, что ингибирование т.н. нейротоксичной эстеразы (НТЭ) связано с развитием отставленной нейротоксичности в нервной системе [Johnson, 1969, 1977]. ОПН обусловливают соединения, которые ингибируют НТЭ на 70-80% и вызывают «старение» фермента. НТЭ активность обнаружена не только в нервной системе, но также в лимфоцитах и тромбоцитах [Bertoncin, 1985; Maroni, 1986]. К настоящему моменту накоплено недостаточное количество данных, позволяющих судить о прямой корреляции между нарушением функционирования НТЭ в клетках крови и развитием отставленной нейротоксичности, обусловленной ингибированием истиной нейрональной НТЭ, хотя есть работы, выявляющие эту закономерность [Maroni et al., 2000]. Лимфоцитарную НТЭ некоторые исследователи считали биомаркером, проводя измерения ее активности при мониторинге ФОС-индуцированной ОПН [Lotti, 1987]. Генетическая или химическая редукция активности НТЭ может быть причиной гиперактивности животных [Winrow, 2003]. Использование в специальных исследованиях линии нейробластомных клеток позволило выявить различия между нейропатическими ФОС (ингибирование НТЭ и развитие ФОС-индуцированной ОПН) и острыми нейротоксическими ФОС (вызывающими главным образом ингибирование АХЭ): способность ингибировать АХЭ была 100-кратно выше способности ингибировать НТЭ у высокотоксичных ФОС, не вызывающих нейропатию [Ehrich, Correll, 1997]. Цепь событий, следующая за инактивацией НТЭ с помощью ФОС и приводящая к сенсомоторной полинейропатии, до сих пор не ясна. Согласно представлениям M.Johnson [1969а, 1969b, 1974, 1980, 1982] механизм неиротоксического действия ФОС включает в себя 3 этапа: I этап - инициация: фосфорилирование эстеразного центра НТЭ и старение фосфорилированного фермента. В основе процесса "старения" лежит гидролиз одной из эфирных (R-0-P), амидньтх (R-N-P) или тиоэфирных (R-S-P) связей остатка, соединенного с ферментом. Предполагается, что эта заряженная группа запускает цепь превращений, приводящих к дегенерации аксонов. II этап - латентный период: последовательные изменения на молекулярном и клеточном уровнях, которые протекают в течение одной-двух недель. Каскад этих изменений, предшествующих клиническим проявлениям, до сих пор остается неизученным. III этап - период клинических проявлений: развитие отдаленных вялых парезов и параличей, сменяющихся спастическими по мере поражения мотонейронов спинного мозга. Несмотря на значительное количество статей, посвященных роли НТЭ в патогенезе ОПН, гипотеза, связывающая отдаленную нейротоксичность ФОС исключительно с фосфорилированием НТЭ, содержит противоречия. Высказанное сомнение подкрепляют следующие факты: отсутствие специфического субстрата в организме. В настоящее время описано около 20 возможных субстратов данной ферментативной реакции; активность НТЭ в центральной нервной системе составляет лишь около 10% общей ФОС-гидролитической активности [Chemnitius, Zech, 1983]; отсутствие связи между степенью ингибирования НТЭ и глубиной морфологических изменений в нервных структурах; видовая и возрастная специфичность развития отдаленных нейропатий. Многочисленные работы о НТЭ и ее ингибиторах не обеспечили за последнее десятилетие решения проблемы отдаленных органофосфатных нейропатий. Изучение свойств этого фермента и его физиологического значения не позволило создать эффективные средства профилактики нейропатий ни в России, ни за рубежом. Профилактическое экранирование холинэстеразы обратимыми ингибиторами фермента также не привело к существенным результатам, тогда как применение карбаматов на фоне манифестации холинопозитивного синдрома, несмотря на все теоретические доводы об НТЭ, только усилило проявление холинопозитивного синдрома [Чепур и др., 1999].
Гемостаз и возможные механизмы развития патогенеза при интоксикации ФОС
Данных о динамике показателей разных звеньев системы гемостаза при острой или хронической интоксикации ФОС или ФОВ немного, и они достаточно противоречивы. Так, было показано, что у людей при острой интоксикации ФОС нарушается клеточный и гуморальный гемостаз: наблюдается тромбоцитопения, клетки становятся ригидными (уменьшается способность тромбоцитов к модификации формы), уменьшается уровень фибриногена, плазминогена и антитромбина III, повышается вероятность кровотечений [Ziemen, 1984]. Увеличение времени свертывания крови было отмечено при интоксикации мышей пестицидами - фосфорорганическим соединением Nuvacron и карбаматным инсектицидом Furadan [Gupta et al., 1982]. При этом было также отмечено снижение уровня гемоглобина и гематокрита, количества эритроцитов, тромбоцитов, но повышение количества лейкоцитов, главным образом за счет нейтрофилов и базофилов, тогда как уровень лимфоцитов был снижен. Кроме того, была снижена активность костного мозга и отмечена гиперплазия селезенки. Описаны и более продолжительные изменения в системе гемостаза при отравлении ФОС [Namba et al., 1971]. Единственное упоминание о влиянии зарина на гемостаз относится к 1961 г. [Von Kaulia, Holmes, 1961]. Влияние высоких доз зомана на гемостаз кроликов описано в 1990 г. [Lee, Clement, 1990]. Продолжительность эксперимента была 48 часов. Показано повышение фибриногена, снижение АЧТВ и ПВ через 24 и 48 часов после отравления. Надежных данных по изменению параметров агрегации тромбоцитов не было получено, несмотря на предпринятые попытки исследовать все звенья гемостаза. Отмечая изменения в параметрах системы гуморального гемостаза, картине крови и биохимических параметров, авторы не придали этим особого значения, полагая, что они не играют роли в развитии отдаленных последствий [Lee, Clement, 1990]. Впрочем, такая цель, похоже, и не ставилась.
Тем не менее, функциональные изменения на уровне микроциркуляторного русла могут оказаться наиболее значимыми факторами в этиологии отдаленных последствий интоксикации ФОС, а слабовыраженные нарушения в системе гемостаза могут быть обусловлены компенсаторными механизмами. В связи с этим представляют интерес возможные механизмы компенсации и декомпенсации различных звеньев гемостаза. Проявлению клинически выраженных агрегационных и коагуляционных синдромов препятствуют эффекторы, обеспечивающие отрицательную обратную связь. Массированной агрегации тромбоцитов в наибольшей степени могут препятствовать простациклин и оксид азота, генерируемые главным образом клетками эндотелия [Cines et al., 1998; Michiels, 2003]. Какие стимулы могут вызвать повышение синтеза и секреции PGb и N0? Одним из наиболее вероятных агентов с необычайно широким спектром действия — в зависимости от концентрации, скорости образования и наличия сопутствующих факторов - является тромбин. Несмотря на то что тромбин представляет собой фермент класса сериновых протеаз, т.е. является потенциальной мишенью для ФОС, к моменту локального образования тромбина и экспозиции активного центра с его сериновым сайтом ФОС, скорее всего, уже вступают во взаимодействие с более доступными перманентно экспрессированными мишенями. Многообразные эффекты тромбина на процессы жизнедеятельности клеток реализуются главным образом через его взаимодействие с протеазным рецептором PAR-1, классическим «семистолбовым» трансмембранным рецептором, сопряженным с G-белком, присутствие которого показано в тромбоцитах, нервной ткани, фибробластах и эндотелиальных клетках. Активированный тромбином PAR-1 индуцирует быстрые и существенные изменения морфологии и физиологии клеток, связанные с передачей сигнала актиновому цитоскелету. Так, тромбоциты при активации PAR-1 образуют выросты (филоподии) [Hartwig et al., 1995], эндотелиальные клетки сокращаются [Essler et al., 1998], также сокращаются нейрональные аксоны и конусы роста, а тела астроцитов уплощаются в результате уборки выростов [Gurwitz, Cunningham, 1988; Suidan et al., 1992; Suidan et al., 1997]. Кроме того, действие тромбина сопряжено, в зависимости от концентрации и ряда других условий, с усилением синтеза и секреции эндотелием как протромбогенных, так и антитромбогенных агентов: PGIi, NO, протеина С, гепаран сульфата, фактора активации тромбоцитов (ФАТ), фактора Виллебранда, тканевого фактора (тромбопластина), t-PA и PAI-1 (ингибитора активатора плазминогена), а также экспрессии /?-селектина на поверхности наружной эндотелиальной мембраны, приводящее к потенциированию адгезии нейтрофилов и увеличению проницаемости эндотелия [Козинец, Макарова, 1998; Weksler et al., 1978; Levin et al., 1984; Owen, Esmon, 1986; Shimada, Ozawa, 1985; Van Hinsbergh et al., 1987]. Небольшие количества тромбина, выявляющиеся на сосудистой поверхности, могут быть генерированы локально с участием экспрессированного эндотелием тромбопластина. В свою очередь, первичными стимуляторами (в отличие от вторичного стимулятора - тромбина) синтеза тромбопластина являются форболовые эфиры (активация ПКС), гипоксия, эндотоксины, интерлейкин-1, лектины, кальциевый ионофор А23187, липопротеины низкой плотности, иммунные комплексы и компоненты комплемента [Козинец, Макарова, 1998; Lyberg, 1984; Galdal, 1984]. Аналогично тромбину и другим факторам свертывания крови, компоненты комплемента в большинстве своем являются сериновыми протеазами, но, образовавшись локально и действуя немедленно, они также не могут служить главной мишенью для ФОС. Если при действии ФОС образуются иммунные комплексы, то тромбоциты могут быть их переносчиками по кровеносному руслу. Помимо ведущей роли в системе гемостаза, тромбоциты играют немаловажную роль в иммунных реакциях, являясь своеобразным посредником между этими двумя физиологическими системами. Во-первых, на внешней мембране тромбоцитов экспрессированы рецепторы для активированных компонентов комплемента (Clq, С2, С4) и для иммунных комплексов (Fc-рецепторьт). Кроме того, тромбоциты могут быть активированы мембрано-атакующим комплексом комплемента С5Ь-9 без участия специфических рецепторов. С другой стороны, тромбоциты обладают механизмами самозащиты против комплемента, наиболее интересным из которых является способность тромбоцитов освобождаться от комплексов С5Ь-9 вместе с частью собственных мембранных везикул [Spycher, Nydegger, 1995]. С тромбоцитами связывается до 50% Clq, взаимодействующего с клетками периферической крови. Ассоциированный с иммунными комплексами (например, IgG-альбумин) Clq практически полностью связывается с тромбоцитами, причем Clq облегчает взаимодействие иммунных комплексов с Fc-рецепторами тромбоцитов [Peerschke, Ghebrehiwet, 1992]. Иммунные комплексы (ИК) и агрегированные IgG (agg-IgG), связываясь с Fc-raMMa-RII рецепторами (FcRlI), индуцируют экспрессию интегриновых рецепторов, агрегацию тромбоцитов и секрецию гранул, содержащих биогенные амины и адениновые нуклеотиды [Peerschke, Ghebrehiwet, 1998]. Кроме того, иммунные комплексы активируют систему комплемента и взаимодействуют с компонентом комплемента Clq, который в концентрациях 50-100 мкг/мл способствует проявлению агрегационного действия РІК и agg-IgG в субагрегационных дозах 20-400 мкг/мл. Показано, что вспомогательное действие Clq осуществляется его коллагеноподобным доменом через соответствующие рецепторы тромбоцитов (cClqR) при их кооперативном взаимодействии с тромбоцитарными рецепторами иммунных комплексов (FcyRII) [Peerschke, Ghebrehiwet, 1997]. Таким образом, взаимодействие ИК и Clq с тромбоцитами играет важную роль в гемостазе и может обусловить тромбогенные последствия иммунных повреждений. Кроме того, Clq-рецепторы постоянно присутствуют даже на неповрежденных эндотелиальных клетках [Zhang et al., 1986]. Образование Clq происходит по классическому пути именно в случае образования иммунных комплексов. За счет связи с Clq-рецептором усиливается адгезия тромбоцитов к эндотелию капилляров, где происходит локальное взаимодействие антигена с иммунокомпетентными клетками и повышается вероятность локальной активации тромбоцитов различными молекулярными агентами.
Биохимические показатели в динамике после острого отравления крыс зоманом и RVX
В таблицах 3.2.1 - 3.2.2 приведены результаты количественного определения субстратов и активности ферментов в сыворотке крови контрольных и опытных животных. Через 3 и 24 часа после острого отравления зоманом снижена концентрация триглицеридов в сыворотке крови, что отражает снижение потребления животными корма в течение первых суток (таблица 3.2.1). На дальних точках уровень триглицеридов приближается к контрольным значениям. Через 1 сутки после отравления в сыворотке крови повышается концентрация общего холестерина. Уровень альбумина не подвергается выраженным изменениям, однако его доля в составе общего белка несколько увеличивается через 3 часа после отравления. В течение первых суток наблюдается снижение концентрации креатинина. Постепенное повышение этого показателя достигает статистической значимости через 4 и 6 недель после отравления (рисунок 3.2.1). Изменения концентрации мочевины в сыворотке крови носят фазовый характер - повышение через 3 часа и снижение среднего значения через 1 сутки. К шестой неделе наблюдается устойчивое повышение этого показателя (рисунок 3.2.2). Также в течение первых суток повышается активность аминотрансфераз в сыворотке крови. Максимальные значения активности АЛТ наблюдается через 3 часа и сутки, при этом у отдельных особей активность фермента увеличивается по сравнению с контролем в 2 раза (рисунок 3.2.3). Активность ACT достигает максимальных значений через 1 сутки. Данные ферменты обладают органоспецифичностью, а именно: максимальная активность АЛТ наблюдается в печени, в то время как активность ACT -— главным образом в сердце [Уайт и др., 1981; Хашен, Шейх, 1981]. Так как оба эти фермента присутствуют и в печени и в сердце, в клинической практике используют коэффициент де Ритиса, который представляет собой отношение активностей ACT и АЛТ. При повышении этого коэффициента принято говорить об инфаркте миокарда или ином процессе, связанным с разрушением кардиомиоцитов; уменьшение коэффициента в большей степени характерно для заболеваний печени. В наших экспериментах не удалось выявить статистически значимых изменений коэффициента де Ритиса, хотя после отравления зоманом через 3 часа и 1 неделю можно отметить незначительную тенденцию к снижению этого показателя, а через сутки повышение среднего значения коэффициента де Ритиса на 25% относительно контроля и на 40% относительно 3-часовой точки (рис. 3.2.4). Имеются убедительные свидетельства того что значительное повышение уровня ACT при нормальном уровне АЛТ (т.е. повышение коэффициента де Ритиса) связано не с поражением сердечной мышцы, а с поражением гемоксигеназы-1 гепатоцитов, гемолитической анемией, поражением почек и эндотелия сосудов [Yachie et al., 1999]. Более того, с поражением эндотелия сопряжено повышение уровня тромбомодулина и другие нарушения гуморального и клеточного гемостаза [Seigneur et al., 1993; Wada et al., 1993; Yachie et al., 1999]. Повышение активности ГГТ (КФ 2.3.2.2) наблюдается на всех сроках после острого отравления зоманом, но наиболее выраженный характер эти изменения носят в первые сутки - уже через 3 часа активность ГГТ повышается на 25-30% (а у отдельных животных активность фермента повышается вдвое). В более поздние сроки активность фермента несколько снижается, претерпевая фазовые изменения, но остается при этом выше уровня контроля (рисунок 3.2.5).
После острого отравления RVX уровень общего холестерина не претерпевает значительных изменений. Через 1 сутки наблюдается снижение концентрации триглицеридов в сыворотке крови. На сроках 1 сутки и 6 недель можно отметить незначительное снижение доли альбумина в составе общего белка. Через 3 часа после отравления RVX наблюдается снижение концентрации креатинина в сыворотке крови на 30%, затем происходит восстановление показателя до уровня контроля и повышение в среднем на 20% через 4 недели после отравления (рисунок.3.2.7). Отметим, что различия между этими точками статистически значимы. Наиболее заметный подъем концентрации мочевины в сыворотке крови наблюдается через 2 и 4 недели (рис. 3.2.8). В первые сутки отмечен умеренный подъем активности АЛТ и значительное повышение активности ACT в эти же сроки (рисунки 3.2.9, 3.2.10). При оценке коэффициента де Ритиса можно отметить заметное его повышение на сроке 1 сутки (рис. 3.2.11). После острого отравления RVX наблюдается повышение ГГТ (КФ 2.3.2.2), а на сроке 4 недели этот показатель статистически значимо повышается в среднем на 30% (таблица 3.2.2, рисунок 3.2.12). Известно, что ГГТ экспресируется не только гепатоцитами, но и эндотелиальными клетками, играя важнейшую роль, особенно в мозге, в переносе аминокислот из кровеносного русла [Осадчая, 1999; Orlowski et al., 1974; Spater et al., 1982]. Повышение уровня ГГТ ассоциируется с патологией сердечно-сосудистой системы, риском геморрагического и ишемического инсульта [Ruttmann et al., 2005].
Мочевина - конечный продукт метаболизма белков в организме. Она удаляется из организма посредством клубочковой фильтрации. При патологии сдвиги в концентрации мочевины в крови зависят от соотношения процессов ее образования и выведения. При интоксикации зоманом наблюдается незначительное повышение уровня мочевины на 15-25% через 3 часа, которое возвращается к норме через сутки (хотя у отдельных животных концентрация мочевины остается повышенной в 2,5 раза), затем более значительное повышение на 30-40% через 6 недель, что может быть связано с повышением интенсивности белкового обмена (повышение веса тела животных опытной группы по сравнению с контролем — еще одно основание для такого вывода). При интоксикации RVX уровень мочевины повышается сначала на 15-25% через 2 недели и на 40-60% через 4 недели. Однако это не связано с повышением веса животных. Креатинин - конечный продукт распада креатина, который играет важную роль в энергетическом обмене скелетных мышц и других тканей. Креатин синтезируется в основном в печени, откуда он с током крови поступает в мышечную ткань, где превращается в креатинфосфат. Креатинфосфат относится к макроэргическим соединениям и участвует в переносе энергии в клетке между митохондриями и миофибриллами. Около 2% креатина превращается в креатинин в течение 24 часов. Образование креатинина зависит от массы мышц и в меньшей степени от массы тела. Концентрация креатинина в крови мало зависит от питания. Повышение уровня креатинина и мочевины в крови обычно связывают с почечной недостаточностью [Маршалл, 2000].
Исследование функционального статуса эритроцитов при интоксикации ФОВ
В ранние сроки интоксикации зоманом и RVX активность эритроцитарной АХЭ была значительно снижена (до 10% от контрольного уровня), но ко второй неделе эксперимента практически полностью восстанавливалась. При этом зоман вызывал более выраженное и длительное ингибирование фермента. БХЭ сыворотки крыс при интоксикации зоманом также ингибируется (до 50%), восстановление активности фермента наблюдали лишь через 2 недели после отравления. Однако RVX не оказывал выраженного влияния на активность БХЭ. Исследование активности КЭ в сыворотке крови экспериментальных животных не выявили значительных отклонений от контроля.
Изучение кинетических параметров агрегации тромбоцитов выявило снижение чувствительности кровяных пластинок к индуктору агрегации АДФ через сутки и повышение чувствительности через 2 недели после отравления зоманом. При этом Umax повышается в течение первых суток после воздействия. При интоксикации RVX в ранние сроки наблюдается аналогичная картина — снижение чувствительности тромбоцитов к АДФ при повышении максимальной скорости агрегации. Такие же изменения кинетических параметров агрегации наблюдаются через 4 недели после воздействия.
При оценке функционального статуса эритроцитов через 2 недели после отравления зоманом было выявлено выраженное уменьшение времени достижения максимальной скорости гемолиза, что свидетельствует об увеличении пула «постаревших» или «пострадавших» клеток, вероятность гибели которых по некротическому пути возрастает. Восстановление Tgem к 4-недельному сроку с одновременным снижением полноты гемолиза (до 89%) свидетельствует о значительном обновлении популяции эритроцитов. Интоксикация RVX в меньшей степени отражается на исследованных показателях функционального статуса эритроцитов - максимальная скорость гемолиза и время достижения максимальной скорости гемолиза в течение эксперимента практически не менялись, хотя можно отметить тенденцию к снижению Tgem через 2 недели. Снижение полноты гемолиза на 4 неделе эксперимента также свидетельствует об обновлении популяции эритроцитов.
Подсчет форменных элементов крови после отравления зоманом выявил значительное снижение числа лейкоцитов через 3 часа и сутки, а также снижение числа эритроцитов через 2 и 4 недели, что согласуется с повышением гемолитической активности эритроцитов в эти сроки. Число эритроцитов крови крыс после воздействия RVX подвергается незначительным колебаниям, с тенденцией к снижению на 2 неделе эксперимента, что, в совокупности с изменением Tgem, свидетельствует о возможности развития внутрисосудитстого гемолиза в этот период. Число лейкоцитов значительно снижается на ранних сроках интоксикации и через 6 недель после воздействия RVX.
Скрининговые тесты состояния гуморального гемостаза выявляют схожие результаты воздействия зомана и RVX в ранние сроки: увеличение ПВ (торможение внешнего пути свертывания крови) через 3 часа, значительное повышение количества фибриногена через 1 сутки. При интоксикации зоманом отмечено удлинение АЧТВ через 1 неделю, а через 2 недели после отравления RVX наблюдается активация внутреннего пути свертывания (уменьшение ПВ). Увеличение ПВ можно было бы связать с ингибированием сериновой эстеразы - фактора VII, но гораздо более вероятным представляется выброс TFPI из активированных эндотелиальных клеток и тромбоцитов. При действии следов тромбина TFPI выделяется из специфических гранул хранения и связывается с фактором Vila и его комплексом с ТФ, ограничивая тем самым активацию коагуляционного каскада [Зубаиров, 2000; Lwaleed, Bass, 2006].
Исследование антикоагулянтной активности плазмы крови выявило повышение активности антитромбина в ранние сроки интоксикации, причем после отравления RVX эти изменения были более продолжительными и выраженными.
Ристомицин-кофакторная активность фактора Виллебранда, известного как маркер дисфункции эндотелия, повышалась через 3 часа и 2 недели после острого отравления зоманом, при этом вторая волна была более выражена, чем первая. Изменение активности VWF при интоксикации RVX носило иной характер - максимальная активность фактора наблюдалась через 1 неделю после воздействия, в остальные сроки показатель был близок к контрольным значениям или значительно ниже - особенно через сутки. При этом на всех сроках отмечалась значительная вариабельность показателя.
Динамика активности ADAMTS-13 имеет значительное сходство при интоксикации зоманом и RVX - резкое повышение активности наблюдается через 3 часа после отравления. В дальнейшем наблюдалось возвращение показателя к контрольным значениям с незначительным повышением через 1 неделю после отравления зоманом и снижением через 2 недели после отравления RVX. Повышение активности ADAMTS13 при действии перекиси в экспериментах in vitro — не только еще одно свидетельство активации эндотелия, но и вероятный индикатор ишемии-реперфузии как одной из главных причин генерации перекиси в условиях in vivo.
Исследование пептидного состава сыворотки крови крыс при интоксикации ФОВ методом масс-спектрометрии выявило нарушение деградации фибринопептида А. Появление пептида GTTSEFIDEGAGIR с массой 1452 в сыворотке крови в ранние сроки может быть связано с ингибированием зоманом и RVX аминопептидазы N, а максимальная интенсивность пика этого маркерного пептида, выявленная через 1 сутки после воздействия ФОВ, соответствует максимальной концентрации фибриногена в плазме.
Исследование динамики ряда биохимических и гематологических показателей, наряду с показателями клеточного и плазменного гемостаза позволяет сформулировать следующую картину происходящих в организме животных изменений в динамике при острой интоксикации зоманом и RVX (табл. 4.1).
Через 3 часа после острого отравления ингибирование эритроцитарной АХЭ и сывороточной БХЭ вызывают повышение уровня ацетилхолина в кровеносном русле (на фоне выраженных холинергических симптомов). Действие АХ на эндотелий сопряжено со стимуляцией М-рецепторов, мобилизацией внутриклеточного кальция, генерацией окиси азота. Чрезмерная активация обусловливает повреждение эндотелия, нарушение микроциркуляции, ишемию. Возможными маркерами этого воздействия являются повышение активности АЛТ, ACT, ГГТ, фактора Виллебранда (для зомана) и менее выраженные признаки этого процесса при отравлении RVX. Клеточное звено гемостаза быстрее реагирует на активацию: при отравлении зоманом уже через 3 часа достоверно повышается Umax и АПТ. С другой стороны, активируются факторы, препятствующие свертыванию крови: значительно повышается активность ADAMTS13 и есть признаки активации AT при интоксикации RVX. При интоксикации зоманом на этом сроке активность AT еще не повысилась, возможно отчасти с этим связан более выраженный прокоагуляционный эффект зомана на данном этапе.
