Введение к работе
Актуальность проблемы . Олигонуклеотидные производные, способные связываться с определенными "мишенями" нуклеиновых кислот и влиять на их функции, становятся эффективным орудием молекулярных биологов. Они рассматриваются как перспективные лекарственные препараты (противораковые и противовирусные), действующие на уровне функционирования генома.
Возможность атаковать ДНК мишень может стать ключевым моментом метода повреждения "нежелательных" генов, таких, как онкогены, и инактивации интегрированных вирусных геномов. Возможность влиять на определенные гены дает принципиально новые возможности, в руки исследователей, изучающих функционирование генома или занимающихся направленным мутагенезом.
Исследование организации определенных последовательностей ДНК я составе хроматина и её изменения в процессе функционирования клетки представляет существенный интерес для понимания процессов регуляции экспрессии генов. Специфическая химическая модификация хроматина реакционоспособными производными олигонуклеотидов, комплементарными изучаемым последовательностям ДНК, могла бы позволить изучать изменения конформации ДНК и белкового окружения определенных её зон на разных стадиях клеточного цикла.
. Цель работы. Целью настоящей работы было исследование доступности выбранных мишеней ДНК- повторяющихся последовательностей, которые в большом количестве присутствуют в геноме эукариот, для комплементарно адресованной модификации, в зависимости от структурно-функционального состояния хроматина, а также исследование возможности применения этого подхода для изучения белкового окружения определенных последовательностей ДНК в составе интактных ядер и хроматина и исследование зависимости этого окружения от структурно-функциональных характеристик хроматина.
Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей диссертационной работе впервые изучена комплементарно-адресованная модификация ДНК и белков в составе хроматина производными олиго-нуклеотіїїїов. Обнаружено, что наличие целостной ядерной мембраны не прнпятг.твуе? прошжн^вению производных олигонуклеотидов в ядро и гл'дифик'-пии .чдерннх биополимеров. Показано, что взаимодействие ре-акшганоспособннх производных олигонуклеотидов с ДНК хроматина су-с:йстийнн'.> .чнкнсит l»t наличия высших уровней организации хроматина: доступность гюли-dA трактов ДНК в составе "растворимого" хроматина
на порядок ниже, чем в составе суспензионного хроматина и интакт-ных ядер. Показано влияние белкового состава дезоксирибонуклео-протеидных комплексов на доступность поли-dA трактов для направленной химической модификации алкилиругаими производными олигонук-леотидов. Обнаружена специфическая модификация белков хроматина при обработке ядер производными олигонуклеотидов, причем наборы белков, модифицирующихся в составе ядер из интактной и регенерирующей печени крыс, а также белков интерфазных ядер и метафазных хромосом клеток Hela существенно различаются. Проведен сравнительный анализ эффективности алкилирующих и фстоактивных реагентов для модификации хроматина.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ. Материалы диссертации были доложены на Всесоюзных совещаниях "Геном человека", 1990, 1991, 15 Международном конгрессе биохимии (Израиль, 1991), Международном симпозиуме "Синтетические олигонуклеотиды: проблемы и перспективы практического применения" (Москва, 1991).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 120 страницах, включающих 14 рисунков, 3 таблицы и список литературы. Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и ебсувде-ние, выводы.
