Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6
ВВЕДЕНИЕ 7
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
ГЛАВА I. Множественная лекарственная устойчивость. 10
1.1 Неклеточные механизмы устойчивости 10
1. 2 Клеточные механизмы устойчивости 10
Лекарственная устойчивость, обусловленная инактивацией препарата в клетке 11
Устойчивость, связанная с изменением мишеней лекарственных препаратов 13
Роль ключевых генов, контролирующих апоптоз, в развитии лекарственной устойчивости 14
Ген р53 14
Антионкоген PTEN и лекарственная устойчивость опухолевых клеток 15
Влияние онкогена Вс1-2 и других генов семейства Вс1-2 на лекарственную
устойчивость опухолевых клеток 16
1.2.3.4 Система CD95-L/CD95 (FasL/Fas ) и лекарственная устойчивость 16
1.2.4 Транспортные белки во множественной лекарственной устойчивости 17
1.2.4.1 Стуктура П-гликопротеина 17
1.2.4.2.Конформационные изменения структуры Пгп 21
Ген mdrl, кодирующий П-гликопротеин, генетические механизмы Пгп-МЛУ 23
Субстратная специфичность Пгп 24
Экспрессия Пгп в нормальных тканях и клетках 26
Роль МЛУ, опосредованной Пгп (Пгп-МЛУ), в злокачественных
новообразованиях 27
1.2.4.7 MRP, белок, ассоциированный с множественной лекарственной
устойчивостью 28
1.3. Ингибиторы транспортных белков МЛУ 31
1.3.1 Ингибиторы П-гликопротеина 32
1.3.1.1 Ингибиторы 1 поколения 32
Ингибиторы 2 поколения 33
Ингибиторы 3 поколения 34
1.3. 2 Ингибиторы MRP 35
Резюме: 36
ГЛАВА П. Регуляция множественной лекарственной устойчивости 37
2.1 Роль сигнальных систем клетки в МЛУ 37
Влияние цитокинов на МЛУ 37
Роль фосфолипазы С и протеинкиназы С в регуляции МЛУ 39
Роль МАПК каскада в МЛУ 41
Факторы транскрипции, регулирующие МЛУ 42
2.2 Активные формы кислорода и МЛУ 47
Резюме: 49
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 51
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 51
1. Объект исследования 51
Культуры клеток 51
Получение резистентного штамма клеток РЗ 8 8ВР 51
1.2.1. Определение экспрессии П-гликопротеина 52
1.3 Получение резистентного штамма клеток НЕр-2 53
2. Определение чувствительности опухолевых клеток к различным агентам по
критериям выживаемости клеток и повреждению ядер в опытах in vitro 53
Используемые агенты 53
Определение чувствительности клеток лимфолейкоза Р388 и Р388ВР 55
Определение чувствительности клеток рака гортани человека НЕр-2 и Нер-2ТР 55
Определение роста опухолей и эффекта противоопухолевых препаратов на их рост 56
Определение МЛУ в клетках лимфолейкоза РЗ88 иР388ВР 56
Определение МЛУ в клетках рака гортани человека НЕр-2 58
Определение активных форм кислорода в клетках лимфолейкоза Р388 и Р388ВР 59
Введение перфторана и создание условий гипероксии 60
8. Статистическая обработка результатов 60
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 61
Часть I. Авермектины - новый класс ингибиторов множественной лекарственной
# устойчивости 61
1.1. Влияние авермектинов на МЛУ клеток лимфолейкоза РЗ 8 8 62
Оценка МЛУ штамма клеток лимфолейкоза Р388, устойчивого к винкристину 62
Действие авермектинов на выживаемость клеток Р388 иР388ВР 66
Модификация противоопухолевого эффекта винкристина на клетках Р388 и Р388ВР авермектинами 66
Действие авермектинов на активность транспортных белков МЛУ 69
Резюме: 71
1.2. Влияние авермектинов на МЛУ клеток НЕр-2 72
Оценка МЛУ штамма клеток НЕр-2ТР, устойчивого к таксолу 72
Действие авермектинов на выживаемость 73
клеток НЕр-2 и НЕр-2ТР 73
Модификация эффекта противоопухолевых препаратов на клетки НЕр-2 и НЕр-2ТР авермектинами 73
Действие авермектинов на активность транспортных белков клеток НЕр-2..75 Резюме: 78
1.3. Противоопухолевые эффекты авермектинов 78
Действие аверсектина С на асцитную опухоль лимфолейкоз Р388 79
Действие аверсектина С на солидную карциному Эрлиха 80
_ 1.3.2.1 Влияние аверсектина С на рост солидной карциномы Эрлиха 80
1.3.2.2. Влияние аверсектина С на большие опухоли карциномы Эрлиха 82
1.3.3. Влияние авермектинаВІ нарост солидной карциномы Эрлиха 82
Резюме: 84
1.4. Усиление противоопухолевых эффектов винкристина авермектинами 84
1.4.1. Действие винкристина в сочетании с авермектинами на солидную карциному
Эрлиха 84
1.4.2. Противоопухолевое действие винкристина в сочетании с авермектинами на
' лимфолейкоз РЗ 88 85
1.4.3. Противоопухолевое действие винкристина в сочетании с авермектинами на
резистентный штамм РЗ88ВР 88
Резюме: 88
Часть 2. Регуляция МЛУ опухолей уровнем их оксигенации 90
2.1. Зависимость МЛУ клеток Р388ВР от срока роста опухоли 90
Резюме: 93
2.2. Изменение активных форм кислорода по мере роста опухолей Р388ВР 93
Резюме: 94
2.3. Влияние увеличения оксигенации опухолей Р3888ВР с помощью гипероксии и
перфторана на МЛУ опухолевых клеток 95
Резюме: 97
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 98
ВЫВОДЫ 101
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 102
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Авер-н - авермектин
АФК - активные формы кислорода
ГАМК - гаммааминомасляная кислота
ДМСО - диметилсульфоксид
ДНК - дезоксирибонуклеїновая кислота
ИЛ - интерлейкин
ЛС- лекарственные средства
МАПК - митогенактивируемая киназа
МЛУ - множественная лекарственная устойчивость
мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота
Пгп - П-гликопротеин
СПЖ- средняя продолжительность жизни
ТМ- трансмембранный домен
ТРО - торможение роста опухолей
DAG - диацилглицерол
EGF - эпидермальный фактор роста
GSH - глутатион
GST- глутатион- S- трансфераза
HIF-1 - гипоксия индуцируемый фактор 1
Insl,4,5P3 -инозитол 1,4,5 трифосфат
JNK - с-Іші-КШ-терминальная киназа
МЕКК -киназа митогенактивируемой киназы
MRP - белок, ассоциированный с множественной лекарственной устойчивостью
MXR - белок устойчивости к митоксантрону
PDGF -фактор роста тромбоцитов
Pins4,5P2 - фосфатидилинозитол 4,5- бисфосфат
РКВ - протеинкиназа В
РКС - протеинкиназа С
PLC - фосфолипаза С
R123- родамин 123
TNF - фактор некроза опухолей
Введение к работе
По данным Всемирной Организации Здравоохранения онкологические заболевания являются одной из самых распространенных причин смерти на Земле. Несмотря на многолетние изучения проблемы рака, терапия онкологических заболеваний сталкивается с рядом трудностей, одной из которых является множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) опухолевых клеток к различным противоопухолевым препаратам.
Устойчивость к лекарственным препаратам может развиваться вследствие блока в опухолевых клетках апоптоза, вследствие особенностей роста опухолей, при которых уменьшается кровоснабжение опухоли и, следовательно, доставка препаратов с кровью. МЛУ также может быть результатом инактивации препарата в клетке, снижения его поступления в клетку и повышения вывода препарата из нее. В последние десятилетия все больше внимания уделяется проблеме повышенного транспорта лекарственных препаратов из опухолевых клеток, в результате которого внутриклеточная концентрация лекарственных средств снижается ниже летального уровня. Откачивают лекарственные препараты из клетки специфические транспортные белки семейства ABC (ATP- binding cassette).
Эти белки, локализованные в цитоплазматической мембране, осуществляют транспорт из клеток широкого ряда биологически важных веществ за счет энергии гидролиза АТФ. К транспортным белкам семейства ABC, ответственным за развитие устойчивости, относят П-гликопротеин, белок MRP1 (multidrug resistance-associated protein 1) и недавно обнаруженный белок MXR (mitoxantrone resistance protein). Эти белки в норме обеспечивают транспорт из клеток в кровь и каналы, образованные эпителием, метаболитов, продуктов распада и ксенобиотиков. Они создают гематоэнцефалический барьер, осуществляют процессы выделения в кишечнике, печени и почках и транспорт из клеток медиаторов, регулирующих иммунитет. Кроме того, сверхэкспрессия генов этих белков была обнаружена во многих опухолевых клетках, причем уровень транспортных белков существенно возрастал после терапии противоопухолевыми препаратами. Особенно важно учитывать роль транспортных белков в лечении острой миелоидной лейкемии,
раках молочной железы и прямой кишки, т.к. именно эти заболевания чаще других сопровождаются развитием устойчивости опухолей.
Субстратами транспортных белков МЛУ являются такие противоопухолевые препараты, как алколоиды бравинка (винкристин, винбластин), антрациклины (даунорубицин, доксорубицин), эпиподофиллотоксины (этопозид), таксол. Более того, показано, что П-гликопротеин транспортирует ингибиторы протеазы HIV-1, препараты, используемые в лечении вируса иммунодефицита человека.
Очевидно, что подавление множественной лекарственной устойчивости и предотвращение ее развития является задачей первоочередной важности для терапии опухолевых заболеваний.
Одним из способов подавления МЛУ является применение ингибиторов транспортных белков, блокирующих транспорт веществ из клеток и повышающих их внутриклеточную концентрацию. Эффективные ингибиторы должны избирательно действовать на опухолевые клетки в малых концентрациях и не быть токсичными для нормальных клеток. Применяемые в настоящее время в клинике ингибиторы имеют существенные недостатки: они малоэффективны, часто обладают побочными эффектами и не снимают МЛУ полностью при клинически достижимых концентрациях. Таким образом, задача подбора высокоспецифичных ингибиторов множественной лекарственной устойчивости до сих пор не решена.
В литературе есть данные об ингибиторной активности в отношении П-гликопротеина препарата ивермектина, синтетического аналога авермектина В 1а. Авермектины - соединения макролидной природы, продукты жизнедеятельности микроорганизмов Streptomyces avermitilis, широко применяются в клинике благодаря своим антипаразитарным свойствам. Данные об ингибиторной активности природных авермектинов в отношении транспортных белков МЛУ отсутствуют.
Другим способом борьбы с МЛУ опухолей могло бы быть подавление экспрессии генов, кодирующих транспортные белки, и снижение их активности воздействием на клеточные сигнальные системы. Однако в настоящее время еще имеется мало информации о регуляции генов МЛУ и роли сигнализации в регуляции активности этих белков. Исследования в этом направлении только начинаются. В литературе существуют данные о зависимости экспрессии генов
МЛУ от концентрации активных форм кислорода, однако, эти данные противоречивы.
Целью настоящей работы явилось исследование подавления и регуляции множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток с помощью ингибиторов транспортных белков и путем изменения уровня активных форм кислорода в опухолевых клетках.
В работе были поставлены следующие задачи:
Изучить влияние авермектинов на множественную лекарственную устойчивость клеток лимфолейкоза Р388 и штамма Р388ВР, устойчивого к винкристину.
Изучить влияние авермектинов на множественную лекарственную устойчивость клеток рака гортани человека НЕр-2 и штамма НЕр-2, устойчивого к таксолу.
Оценить противоопухолевые эффекты авермектинов in vivo.
Исследовать возможность усиления противоопухолевых эффектов винкристина авермектинами in vivo.
Изучить зависимость множественной лекарственной устойчивости клеток Р388ВР от срока роста опухоли.
Оценить изменение уровня активных форм кислорода по мере роста опухолей РЗ 8 8ВР.
Определить влияние увеличения оксигенации опухолей Р3888ВР с помощью гипероксии и перфторана на множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток.
