Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Эндоцитоз в клетках млекопитающих 12
1.1.1. Фагоцитоз 12
1.1.2. Клатрин-зависимый эндоцитоз 13
1.1.2.1. Основные белки, участвующие в формировании клатриновой почки 15
1.1.2.2. Рекрутирование мембранных белков в клатрин покрытые районы 17
1.1.2.3. Отщепление клатрин покрытых пузырьков 17
1.1.2.4. Слияние и сортировка рецепторов в ранних эндосомах 18
1.1.3. Клатрин-независимый эндоцитоз 19
1.1.3.1. Липидные рафты 20
1.1.3.2. Кавеола 21
1.1.3.3. Функции кавеолина-1 23
1.1.3.4. Кавеосомы 25
1.1.4. Rab ГТФ-азы - регуляторы мембранного транспорта 26
1.1.4.1 ГТФ-азный цикл Rab белков 28
1.1.4.2. Эндосомальные Rab белки 30
1. 1.4.2.1. Rab5 - регулятор слияния эндосом 30
1.1.4.2.2. Rab7 и Rab9 в регуляции поздних эндосом 32
1.2. Проникновение вирусов в клетки 33
1.2.1. Клеточная мембрана и вирусные рецепторы 34
1.2.2 Клатрин-зависимый путь проникновения вирусов в клетку 37
1.2.3. Кавеола/рафт-зависимое проникновение вирусов 39
1.2.4. Макропиноцитоз 40
1.3. Вирус венесуэльского энцефаломиелита лошадей 40
1.3.1. Классификация ВЭЛ 42
1.3.2. Структура вируса ВВЭЛ и его проникновение в клетку 44
1.3.3. Выход Альфавирусов из клетки 45
Заключение 47
ГЛАВА 2. Материалы и методы 48
2.1. Материалы 48
2.2. Методы 49
2.2.1. Культура клеток 49
2.2.2.1 Ілазмидьі 49
2.2.2.1. Используемые плазмиды 49
2.2.2.2. Получение конструкций, экспрессирующих оболочечные белки ВВЭЛ штаммов Trinidad donkey и 3908
2.2.2.3. Получение конструкции, кодирующей оболочечный белок вируса Friend-57 ,. MLV, слитый с люциферазой
2.2.2.4. Получение лентивирусных экспрессионных векторов, кодирующих факторы эндоциТОЗНОІ о пути
2.2.2.5. Получение конструкций, кодирующих оболочечный белок VliLZV, слитый с
люциферазой 52
2.2.3. Производство пссвдотииированного MLV 52
2.2.4. Производство псевдотипированного лсптивируса 53
2.2.5. Повышение вирусного титра с помощью бутирата натрия 53
2.2.6. Определение вирусного титра 53
2.2.7. Нейтрализация вируса антителами 53
2.2.8. Использование ингибиторов эндосомального закислення 54
2.2.9. Метод количественного определения слияния вируса с клеткой 54
2.2.10. Определение кинетики слияния вируса с клеткой 55
2.2.11. Мечение вируса [ 5S] метнонином 55
2.2.12. Анализ экспрессии генов играющих роль в эндоцитозе
2.2.13. Удаление холестерина 56
2.2.14. Вертикальный электрофорез белков в гюлиакриламид ном геле в денатурирующих условиях 56
2.2.15. Полусухой электроперенос белков на нитроцеллюлозиую мембрану 57
2.2.16. Иммунохимический анализ белков 57
2.2.17. Статистическая обработка данных 57
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 58
3.1. Количественная оценка проникновения вируса в реальном времени 58
3.1.1. Неснецифическое включение фермента люциферазы в вироплазму 58
3.1.2. Специфическое включение люциферазы в вироплазму с помощью слияния с оболочечным белком "^
3.1.3. Сравнение целостности полученных вирусных частиц 62
3.1.4. Исследование специфичности полученных вирусных частиц на клетках, не содержащих вирусыый реїіентор
3.1.5. Исследование влияния Т471 Iі мутации на слияние вирусных частиц с клеткой... 65
3.1.6. Оценка эффекта ингибиторов в используемой модели слияния 66
3.2. Получение MLV векторов с ВВЭЛ оболочечными белками и их характеристика
3.2.1. Исследование экспрессии и включения оболочечных белков ВВЭЛ в вирусную частицу
3.2.2. Определение инфекционное полученных псевдотипов ВВЭЛ 74
3.2.4. Нейтрализация псевдотипов с помощью ВВЭЛ реактивной сыворотки 75
3.2.5. Ингибирование инфекции с помощью лизосомо і ройных агентов 77
3.2.6. Получение лентивирусных векторов с ВВЭЛ оболочечными белками 78
3.2.7. Определение диапазона клеток, инфицируемых исевдотипом 79
3.3 Слияние альфавирусов с клеточной мембраной gQ
3.3.1. Включение фермента люциферазы в ВВЭЛ псевдотип go
3.3.2. Определение целостности полученного вируса gj
3.3.3. Определение кинетики проникновения вируса 82
3.3.4 Исследование эффекта нейтрализующих антител на проникновение ВВЭЛ псевдотипа ^
3.3.5. Влияние ингибиторов зидосомального чакислепия на проникновение вируса g4
3.3.6. Экспрессия и FACS анали? белков, участвующих в эпдоциточе 85
3.3.7. Влияние Epsl5 ЕА95/295 на поглощение трансферрина и проникновение вируса, gg
3.3.8. Роль ранних и поздних эндосом в проникновении ВЭЛ gg
3.3.9. Зависимость проникновения нссвдотипа ВВЭЛ от холестерина g9
Заключение 91
Выводы 95
- Эндоцитоз в клетках млекопитающих
- Слияние и сортировка рецепторов в ранних эндосомах
- Получение конструкций, экспрессирующих оболочечные белки ВВЭЛ штаммов Trinidad donkey и 3908
- Количественная оценка проникновения вируса в реальном времени
Введение к работе
Борьба с вирусными инфекциями является одной из серьезных проблем современной биологии и медицины. В настоящее время в получении противовирусных препаратов задействованы огромные человеческие ресурсы. Каждый год расширяется список используемых препаратов и способов их действия. Результатом более детального изучения и понимания вирусов и факторов, необходимых для их распространения, явилось добавление к препаратам широкого действия, таким как, например, интерферон, все более и более специфичных препаратов, направленных против конкретного вируса и против конкретного процесса. Например, для лечения ВИЧ используются как специфичные ингибиторы обратной транскриптазы и протеазы, так и ингибиторы проникновения вируса в клетку (Reeves and Piefcr, 2005). Успех лечения во многом определяется нашими знаниями природы вируса, включая особенности геномной организации, биохимического аппарата, а также способа проникновения вируса в клетку хозяина. Последнее гораздо хуже изучено из-за отсутствия количественных методов определения проникновения вируса в реальном времени.
Детальное исследование процессов проникновения вирусов в клетки и выявление факторов, необходимых для этого, имеет огромное значение не только для понимания природы вируса, но и для разработки новых противовирусных препаратов и диагностических методов. К сожалению, существующие методы определения проникновения вирусов имеют множество ограничений и не всегда применимы. Методы, основанные на измерении высвобождения содержимого вируса в клетку, обладают наибольшим потенциалом. Для ретровирусов распространенный мегод основывается на факте, что синтез вирусной кДНК ограничен доступом к дезоксирибонуклеотидам. После проникновения вируса и разборки капсида, вирусная полимераза может получить доступ к dNTPs, тогда синтез будет продолжен. Транскрипты могут быть детектированы с помощью ПЦР, обычно через 4 часа после контакта вируса с клеткой (Mollies el ai, 2000а). Но этот метод не дает ответа на вопрос, в какое время происходит открытие генома и собственно контакт полимеразы с dNTP. Другой метод основан на присоединении фермента р'-лактомазы к VPR белку вируса иммунодефицита человека (Cavrois et al., 2002), который пакуется в ВИЧ частицы во время сборки вируса. Это обеспечивает попадание фермента во внутрь частицы, который высвобождается в клетку после слияния вируса. По на практике этот метод не
обладал достаточной чувствительностью, так как для получения адекватного количества продукта ферментативной реакции требовалось до 12 часов. Для уменьшения времени необходимо от 10 до 100 инфекционных частиц на клетку, что не является физиологичным. Таким образом, задача количественною определения вирусных частиц в клетке-хозяине после инфицирования остается нерешенной.
Вирус венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВВЭЛ) входит в состав семейства Тогавирусов, рода альфавирусов и имеет структуру и геномную организацию сходную с другими альфавирусами, включая Sindbis, Ross River, Eastern Equine Encephalitis и Semliki Forest (Paredes el ui, 2001; Paredes el al., 2005). Наши знания об альфавирусах получены в основном при исследованиях Semliki Forest и Sindbis вирусов, в то время как мало известно о высоко вирулентном ВВЭЛ, особенно о его проникновении в клетку. Гак как существует много примеров, когда родственные вирусы используюг разные пути проникновения, (так, пикорновирусы используют как клатрин-зависимый эндоцитоз, так и кавсола). то необходимо определить, какой из этих механизмов работает у альфавирусов. К тому же было предположено, что аминокислотные различия в оболочечиых белках ВВЭЛ и SFV определяют зависимость слияния от содержания холестерина в мембране, но это никогда не было проверено па клетках млекопитающих. Для оболочечиых вирусов, оболочечные белки вируса связываются со специфичными клеточными рецепторами и определяют клеточный тропизм и путь проникновения в клетки. В настоящее время общепринято, что псевдотипы используют механизм проникновения и путь донора оболочечиых белков, но не реплицируются, что позволяет изучать проникновение в клетки опасных вирусов в лабораториях с низким уровнем защиты. Использование хорошо изученных псевдотипов VSV (рН-зависимый вирус, использует клатрин-зависимый эндоцитоз) и MLV (рН-независимый вирус, не нуждается в эндоцитозе и сливается с плазматической мембраной), позволяет оптимизировать метод измерения проникновения вируса и проверить метод на пригодность и чувствительность.
Целью настоящей работы было изучение условий проникновения вируса ВЭЛ в клетки 293 НЕК человека.
Для достижения цели решались следующие задачи:
Подобрать способ включения в вирусную частицу люциферазы, как наиболее подходящего фермента для определения слияния вируса.
Проверить разработанный метод па псевдотипах VSV и MLV.
Получить псевдотип ВВЭЛ и проверить его функциональность.
Адаптировать разработанный метод к ВВЭЛ псевдотипу.
На основании анализа люциферазной активности определить значение мембранного холестерина и ранних и поздних эндосом при проникновении ВВЭЛ в клетки.
Научная новизна работы
В работе впервые разработан метод специфичного включения фермента люциферазы в вирусную частицу. Было показано, что модифицированный вирус функционален, а люцифераза находится внутри вируса и защищена от контакта с субстратом вирусной мембраной, поэтому фермент может получить доступ к субстрату только после слияния вируса с клеткой.
Впервые разработан метод наблюдения проникновения вируса в клетку в реальном времени. Показано, что связывание вируса является рецептор специфичным, так как положительный сигнал был получен только на клетках, экспрессирующих рецептор. Использование ингибиторов эндосомального закислення доказало пригодность разработанного метода для изучения эффекта ингибиторов на проникновение вирусов, причем эффект специфичен для каждого псевдотипа тестируемого вируса и зависит от используемого оболочечного белка.
Впервые получен ВВЭЛ псевдотип, обладающий высоким титром и несущий на своей поверхности нативныс оболочечные белки ВВЭЛ. Таким образом, псевдотип повторяет путь проникновения вируса дикого типа, что позволяет использовать его для определения факторов, необходимых для проникновения в клетки ВВЭЛ дикого типа. В результате данного исследования показана необходимость наличия функциональных поздних эндосом для эффективного проникновения ВВЭЛ в клетки, а также независимость проникновения ВВЭЛ от мембранного холестерина.
Научно-практическая значимость
Результаты, полученные при изучении способов проникновения вируса ВЭЛ в клетку хозяина, имеют существенное значение для фундаментальной науки. Исследование механизмов транспорта вирусных частиц через клеточную мембрану важно для современной биохимии, изучающей мембранный транспорт. Эта проблема позволяет также подойти к пониманию механизмов инфицирования, что важно для изучения природы самого вируса и вирусного патогенеза. Так. необходимость в функциональных поздних эндосомах говорит о том, что для слияния вирусу нужен
более низкий рН, либо ему необходимы дополнительные, неизвестные факторы, которые присутствуют в поздних эидосомах, такие, как протеазы, корецепторы, или изменение плотности рецептора. Показана независимость проникновения вируса ВЭЛ в клетки от мембраного холестерина, что говорит о наличии принципиальной разницы между такими близкородствеиыми вирусами, как ВВЭЛ и SFV.
Работа имеет также практическое значение, так как разработанный метод определения проникновения вируса в клетки в реальном времени позволяет определить точную кинетику этого процесса и ее изменение под действием различных факторов. Проведение измерений в реальном времени дает возможность выполнения эксперимента в присутствии токсичных ингибиторов на протяжении всего эксперимента. Разработанный метод позволяет также однозначно ответить на вопрос об эффекте ингибиторов на проникновение вируса в клетку. Это его выгодно огличает от классических экспериментов с инфицированием, где ингибитор добавляется в течение определенного времени, после чего удаляется, и вирус может проникать в клетку с задержкой, которой не будет видно на фоне продолжительной инфекции, что может быть причиной ложно негативного результата. Данный метод отражает специфические условия проникновения псевдотипированного вируса в зависимости от используемого оболочечного белка, что позволяет определять ключевые клеточные факторы, необходимые вирусу для инфицирования. Это дает возможность определять мишени для рационально разрабатываемых препаратов, что позволит в будущем создавать эффективные высоко специфичные противовирусные препараты.
Основные положения, выносимые на защиту
Слияние люциферазы светлячка с оболочечным белком вируса обеспечивает специфичное включение фермента в вирусную частицу.
Включение люциферазы приводит к получению вируса с интактной мембраной, выполняющей функцию барьера, предохраняющего фермент от субстрата до момента слияния вируса с клеткой.
Разработанный метод отражает специфичное проникновение вируса в клетку, зависимое от оболочечного белка псевдотипа.
Полученный псевдотип ВВЭЛ содержит оболочечные белки вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей в нативной конформации и проникает в клетки по механизму, специфичному для ВВЭЛ.
Для проникновения вируса ВЭЛ в клетки требуется наличие функциональных поздних эндосом.
6. Для слияния с клеткой ВВЭЛ не нуждается в мембранном
холестерине.
Апробация работы:
Результаты работы были представленим и обсуждены на XXIII конференции Американского общества вирусологии (ASV), Montreal, Canada, 2004; На конференции регионального центра превосходства (RCE) в биозащите и возникающих инфекционных заболеваниях, Galveston, USA, 2004; на XXV конференции Американского общества вирусологии (ASV), Madison, Wisconsin, USA, 2006; на ежегодном коллоквиуме товарищества McLaughlin. Galveston, USA, 2007. Благодарности:
Автор выражает глубокую благодарность заведующей лабораторией молекулярных механизмов канцерогенеза, доктору биологических наук, Гуляевой Людмиле Федоровне и доктору биологических наук, профессору Robert Davey, за руководство работой на всех ее этапах.
Эндоцитоз в клетках млекопитающих
Существует, как минимум, два разных пути проникновения веществ в клетку: фагоцитоз и пиноцитоз, которые объединяются под общим названием эндоцитоз (Silverstein el а!.. 1977; Steinman el al., 1983). К фагоцитозу относят проникновение больших ( 0,5 мкм в диаметре) частиц, которые должны связаться со специфичными рецепторами плазматической мембраны, способными инициировать собственное поглощение обычно с помощью формирования псевдоподий, производных F-актина, которые оборачивают связавшуюся частицу. Пиноцитоз больше известен как эндоцитоз, и обычно относится к образованию меньших ( 0.2 мкм в диаметре) пузырьков, несущих внеклеточную жидкость и макромолекулы, специфично или не специфично связанные с плазматической мембраной. Эндоцитоз необходим для поглощения питательных веществ, для межклеточных взаимодействий, для поддержания плазматической мембраны, эмбриогенеза, обучения и памяти (Olkkonen and Stenmark, 1997; Somsel Rodman and Wandinger-Ness. 2000; Segev, 2001c; Segev, 2001b; Segev, 2001a; Park el al, 2004). Система эндосомальных мембран также обеспечивает дополнительную поверхность для гликозилирования, деградации белков и передачи клеточного сигнала (Ceresa and Schmid, 2000; Di Fiore and Gill, 1999; Di Fiore and De Camilli, 2001; Owen. 2004). Обычно выделяют клатрин-зависимый эндоцитоз (наиболее изучен), кавсола-зависимый эндоцитоз, а также клатрин- и кавеола-независимый эндоцитоз и макроииноцитоз. Рассмотрим механизмы этих видов эндоцитоза.
Способность поглощать крупные частицы обычно ассоциируется с клетками иммунной системы млекопитающих (макрофаги, нейтрофилы). Проникновение стимулируется связыванием частицы с клеточным рецептором, способным передавать фагоцитозный стимул в цитоплазму. Этот стимул приводні к локализированной полимеризации актина в месте прикрепления частицы с последующим выпячиванием псевдоподии, которая обволакивает связавшуюся частицу, формируя фагосому (Greenberg el al, 1990; Greenberg el al, 1991). В макрофагах формирование псевдоподии контролируется взаимодействием между лигандом и рецептором, которое приводит к тому, что размер вакуоли индивидуален для каждой проникающей частицы (Silverstein el al., 1977).
В большинстве случаев фагосомы быстро слипаются с эндосомами и/или с лизосомами, подвергая свое содержимое действию гидролитических ферментов (Kielian and Cohn, 1980; Steinman el al, 1983; Rabinowitz el al, 1992; Desjardins el al, 1994). У млекопитающих фагоцитоз служит первичной линией защиты от микроорганизмов, а также является важным компонентом гуморального иммунного ответа, позволяя процессирование и презентирование бактериальных пептидов антиген специфичным Т-лимфоцитам (Harding and Geuze, 1992; Pfeiferc/с//., 1993).
В процессе эндоцитоза могу і- быть поглощены огромные площади плазматической мембраны. Так, макрофаги способны поглотить более 50% своей поверхности за 1 час (Werb and Cohn, 1972; Steinman el al, 1983). Большинство мембранных белков одинаково подвержены поглощению, в то время как рецептор, который вызывает проникновение, может быть специфично поглощен и деградирован (Meiiman el al., 1983). Таким образом, фагосомы остаются хогя бы частично соединенными с системой эндоцитоза, что способствует восстановлению функции интернализованных белков плазматической мембраны (Muller el al, 1983; Joiner el al, 1990).
В макрофагах Гс рецептор-зависимый фагоцитоз ассоциирован с фосфорилированием тирозина ряда цитоплазматических белков (Greenberg el al, 1993; Greenberg, 1995). Это приводит к рекрутированию киназ src-семейства к цитоплазматическому домену 1;с рецептора с помощью тирозин-содержащего ITAM мотива (Greenberg el al, 1994; Greenberg el al, 1996). Хотя и считается, что макрофаги и другие фагоциты высоко специализированы в захвате крупных частиц, на самом деле, введение ДНК, кодирующей Fc рецептор в обычные, не фагоцитирующие клетки, приводит к фагоциозу (Joiner el al, 1990; Hunter el al, 1994; Greenberg el al, 1996). Более того, фибробласты могут захватывать IgG-нокрытые частицы так же эффективно, как и макрофаги, если в них экспрсссировать src-киназы и Fc рецептор (Greenberg el al, 1996).
Таким образом, при наличии соответствующего рецептора и сигнальных молекул фагоцитоз перестает быть свойством только фагоцитов. Многие клеточные типы могут включать механизмы, характерные для фагоцитоза. Среди разных форм эндоцитоза наиболее детально изученным является клатрин-зависимый эндоцигоз, который характеризуется формированием эндоцитозных пузырьков, покрытых специальным белком клатрииом. Клагрин состоит из грех тяжелых и трех легких цепей, которые образуют "трипожпик". Одной из особенностей ширина является способность полимеризоваться и формировать сетчатую структуру, состоящую из пента- или гексагональных ячеек (рис. 1).
Изначально считалось, что полимеризация клатрина и является той основной силой, которая заставляет плазматическую мембрану изгибаться, выпячиваться и формировать пузырек. Однако более поздние исследования показали, что клатрин не способен обеспечить необходимую силу, чтобы изогнуть мембрану, а обеспечивает лишь механическую поддержку уже изогнутой мембране, поддерживая се в этом состоянии (Nossal. 2001). Кроме тою. к.татрин сам по себе не способен связываться с мембраной, что доказывает участие других адапторных белков в рекрутировании клатрина к поверхности (Aridor and Traub. 2002). В настоящее время известно несколько таких белков. К ним обычно относят белки, которые содержат сайты связывания с липидом фосфатидилинозитол-(4,5)-бифосфатом (PtdIns(4.5)P2). который обогащен в цитоплазматичееком слое плазматической мембраны, либо с клатрином и с сортирующими сигналами внутри цитоплазматических участков трансмембранною груза. Таким образом, для формирования клатрин-покрытых пузырьков необходимо действие адапторных белков, ответственных за выбор специфичного груза на плазматической мембране и рекрутирование структурных и регуляторных компонентов (например, клатрина). которые помогают стабилизировать ранние эндоцитозные комплексы, необходимые для формирования клатрин-покрытых ямок (Owen. 2004).
Слияние и сортировка рецепторов в ранних эндосомах
На сегодня наиболее изученным является клатрип-зависимый эндоцитоз. Открытие специфичных доминантно-негативных мутантов белков, необходимых для функционирования клатрина, включая epsl5 (Benmerah el al, 1999), epsin (Chen et al, 1998), ЛР180 (Ford el al, 2001), позволило показать эндоцитоз ряда молекул при отсутствии функционирующих клатрин-покрытых ямок (Nichols and Lippincott-Schwartz, 2001). Это привело к пониманию, что клатрин-независимый эндоцитоз существует и функционально важен (Conner and Schmid, 2003). Предполагается, что имеется, как минимум, два типа клатрин-независимого эндоцитоза, не считая фагоцитозное поглощение крупных час піц: гак называемый кавеола/липид рафт эндоцитоз, который блокируется специфическим мутантом динамина-2 и макропиноцитоз, который не блокируется специфическим мутантом дииамин-2 (Nabi and Le, 2003).
Липидные рафты представляют собой высоко организованные островки, состоящие из насыщенных липидов и холестерина, которые могут латерально двигаться по плазматической мембране среди более неорганизованных ненасыщенных липидов (Brown and London, 2000). Прямые ацильные цени насыщенных полярных липидов образуют плотную упаковку с молекулами холестерина, формируя жидкие организованные микродомспы (Brown and London, 1998), в то время как изогнутые углеводородные цепи ненасыщенных фосфолинидов не могут упаковываться так плотно и формируют неорганизованное окружение. Благодаря этим свойствам липидные рафты не растворяются в иеионных детергентах и остаются во фракциях с низкой плотностью после градиентного центрифугирования, что часто используется для определения ассоциации молекул с липидными рафгами. Так как эти свойства зависят от концентрации холестерина внутри рафта. в настоящее время используются холестерин-связывающис агенты. Применение таких веществ позволяет специфично разрушать рафты и определять липидиый состав (Foster el ці, 2003), а также выяснять роль рафтов в клеточных процессах (Rothberg el ці, 1990). В рафтах располагаются GPI-заякоренные белки, ацетилированиые белки (например, Src семейство тирозин киназ и Ga субъединицы гетсротримерных G белков), холестерин-связанные и пальмитилированные белки (кавеолипы, Sonic Hedgehog) (Simons and Toomrc, 2000). Некоторые молекулы ассоциируют/диссоциируют от рафтов в зависимости от их активирования, как, например H-Ras (Prior el ці, 2001). Этот факт объясняет, почему Н-Ras- но не K-Ras-зависимая передача сигнала ингибируется с помощью агентов, уменьшающих количество поверхностного холестерина (Roy el ці, 1999).
Считается, что клатрии-иезависимый эндоцитоз связан с липидными рафтами. Это утверждение основывается на нескольких фактах. Во-первых, почти все молекулы, которые поглощаются независимо от клатрина, находятся в липидном рафте, в то время как молекулы, использующие клатрин, как, например, рецептор трансферрина и LDL, не проникают в их состав. (Nichols and Lippincolt-Schwartz, 2001). Во-вторых, снижение содержания холестерина, разрушающее липидные рафты, блокирует поглощение многих молекул, которые поглощаются независимо от клатрип-нокрытых ямок (Lama/e elal, 2001; Nichols and Lippincott-Schwarlz, 2001; Nichols el al., 2001; Di Guglielmo e( al., 2003; Venkatesan el al. 2003). В-третьих, кавеола содержит кавеолин, который связывается с холестерином и не растворим в неионпых детергентах. (Sargiacomo el ai, 1993; Murata el al., 1995). Этот факт привел к предположению, что кавеола является одним из типов липидного рафта (Harder and Simons, 1997).
Кавеола - это специализированные гладкие углубления, обычно 50-70 піп в диаметре, которые впервые были открыгы с помощью электронного микроскопа (Yamada, 1955). Количество кавеол зависит от типа клетки: они отсутствуют в лимфоцитах и в большинстве нейронов, в то время как в мышечных и эндотелиальных клетках они могут занимать до 35% клеточной поверхности (Parton and Richards, 2003). Определяющим свойством кавеолы является наличие белка VIP-21 или кавеолина (Rothberg el al., 1992) и молекул, содержащихся в липидных рафтах, что приводит к нерастворимости в детергенте и зависимости от холестерина (Rothberg el al., 1990). В связи с биохимической гюдобностыо с липидными рафтами кавеолу следует рассматривать как специализированный тип липидных рафтов.
Кавеолин - это белок с молекулярной массой 21 кДа, связывающий напрямую холестерин и жирные кислоті)), в том числе пальмитиновую (Murata el al., 1995; Trigatti el al., 1999). Он формирует виутримембранную петлю длиной 33 аминокислоты, оставляя оба N- и С-концы в цитоплазме (Monier el al., 1995). Известно 3-й его изоформы: кавеолин-1 и кавеолин-2 содержатся в большинстве кавеола-содержащих клетках, в то время как кавеолин-3 ограничен мышечными клетками (Parton, 1996). После синтеза в эндоплазма і ическом ретикулуме кавеолин попадает в транспортные пузырьки, которые направляются к аппарату Гольджи, причем для этого процесса необходимы аминокислоты с 66-ой по 70-ю (IDFED) (Machleidl el al., 2000). При прохождении через аппарат Гольджи кавеолин олигомеризуется и становится нерастворимым в детергенте перед транспортировкой к клеточной поверхности (Lisanti et al, 1993; Monier el al., 1995). Олигомеризация кавеолина стимулирует формирование кавеолы (Fra el ai, 1995).
Получение конструкций, экспрессирующих оболочечные белки ВВЭЛ штаммов Trinidad donkey и 3908
В работе были использованы следующие материалы и реактивы: Бафиломицин А1, моненсин и хлорохин - "Calbiochcm", США. Люцифераза и люциферазный буфер - "Promega", США. Моноклональные антитела против R2 оболочечного белка ВВЭЛ - подарены Dr. John Roehrig (Center for Disease Control and Prevention, Ft. Collins, США). Поликлональные сыворотки №701 и №711, полученные против ВВЭЛ, и неиммунная сыворотка №411 - "АТСС", США. Поликлональная сыворотка rabl, полученная против ВВЭЛ, - подарена Dr. Scott Weaver (UTMB, г. Галвестон, США).
Этиловый спирт, хлорид натрия, хлорид аммония, двузамещенный фосфат натрия, сульфат аммония, гидроокись натрия, уксусная, соляная, глицерин, Трис, DTT (дитиотрейтол), SDS (додецилсульфаг натрия), HRPRS, бычий альбумин, Ponceau S, диметилсульфоксид (ДМСО), Sepliarosc CL-4B колонка, бутират натрия - "Sigma", США. Агароза - "ISC Bioexpress", США.
Этилендиаминтетраацетат (ЭДТА). TRMRD. акриламид. N.N -.метилен бисакриламид, Кумасси голубой R-250 - "Fisher", США. Т4 ДНК полимераза, Taq-полимераза, дезоксинуклеотидтрифосфаты (dNTP) и рестрикционные ферменты - "New Rngland Biolabs", США.
Олигонуклеотиды были синтезированы - "Sigma", США. [33S] метионин - "Amersham". США. Нитроцеллюлозная бумага (0,45 мкм) - "Amersham Biosciences", США. Культуральные среды (DMRM, RPMI 1640, Hanfs F-12 и Leibovitz s R-15), пенициллин и стрептомицин - "Gibco", США. Сыворотка (Fetal Bovine Serum и Horse serum) - "Gemini Byproducts", США. Генетицин (Geneticin) - "Invitrogen", США. Кит для очистки плазмидной ДНК - "Qiagen", США.
Все эксперименты по слиянию вируса проводились на 293 клетках эпителия почки человека. Для получения псевдотина использовались 293 FT клетки (Invitrogen), которые отличаются от 293 клеток повышенным уровнем экспрессии трансфецируемых плазмид. Для определения спектра клеток, которые может инфицировать полученный ВВЭЛ псевдотип использовались клетки печени человека (HUII-7), эпителия легкого человека (А549), нейробластомы человека (SH-SY5Y), нейрона крысы (PC 12), и моноцитоза человека (ТНР-1). Вся культуральная среда содержала пенициллин и стрептомицин. Клетки 293 и Huh-7 культивировались в DMEM с добавлением FBS до конечной концентрации 10%. Клетки 293 FT содержались в той же среде, что и 293, но с добавлением генетицина до конечной концентрации 0.5 мг/мл. Клетки ТНР-1 и РС-12 культивировались в среде RPMI-1640, содержащей 10% FBS и 5% FBS-10% лошадиной сыворотки соответственно. Клетки А549 и SH-SY5Y культивировались в среде Ham s F-12, содержащей 10% FBS.
Плазмида pCDNA3, экспрессирующая оболочечный белок SFV, любезно предоставленная Dr. D. Sanders (Indiana University Medical School, США) и описана (Kahl el al, 2004), была использована в производстве псевдотипов. Плазмида pVSV-G, кодирующая оболочечный белок VSV-G, была приобретена в компании BD Biosciences, США. Плазмида, кодирующая оболочечные белки вируса Эбола, штамм Заир, любезно предоставлена Dr. P. Bates (U. Penn., США). Плазмида pGAG-POL, которая кодирует MLV gag и полимеразу, любезно предоставлена Dr. .1. Cunningham (Harvard Medical School, США). В качестве плазмид, кодирующих маркеры инфекции, были использованы р\/ f3-gal, pi/ EGFP или pFB-Iuc (Stratagene, США). Каждая из них кодировала рМалактозидазу (fi-gal), зеленый флюоресцирующий белок (GFP) или люциферазу светлячка (luc), соответственно, под контролем MLV LTR, а также кодировала упаковочную последовательность вируса. Плазмиды, необходимые для сборки лентивирусных псевдотипов (pLPl, pREV, pLenti6 V5 TOPO), были приобретены в компании Invitrogen. США.
Конструкция ПД95/295 (любезно предоставлена Dr. Benmerah, Cochin Institute, Франция) содержит рекомбннантный ген Cpsl5, в котором отсутствует второй и третий N-концевой EH повтор, необходимые для взаимодействия с АР-2 и формирования клатрин-покрытых ямок. Экспрессия рекомбинантной формы специфично ингибирует клатрин-зависимый эндоцитоз в 293-НЕК. и других клеточных типах (Benmerah et al., 1999). Rab5 и Rab7 необходимы для формирования ранних и поздних эндосом соответственно. Доминантно негативная рекомбинантная форма Rab5, S34N, блокирует формирование ранних эндосом. Постоянно активный мутант Rab5, Q79L, стимулирует аккумулирование ранних эндосом. Обе плазмиды, кодирующие Rab5 S34N и Rab5 Q79L, любезно предоставлены Dr. P. Stahl, Washington University Medical School, США. Rab7 необходим для формирования поздних эндосом и экспрессии мутантной формы, T22N (Dr. Wandinger-Ness, UNM), блокирует этот шаг (Feng el al., 2001). Каждый белок был соединен с GFP для возможности отслеживания экспрессии с помощью флуоресцентной микроскопии.
Все плазмиды были очищены с использованием Qiagen китов или с помощью центрифугирования в градиенте цезия, стандартным методом. Плазмида, содержащая З -часть ВВЭЛ генома от субтипа 1С штамма 3908 (человеческий изолят от 1995 года), ранее была описана (Brault el al., 2002). Плазмида, кодирующая оболочечный белок субтипа 1АВ штамма Trinidad donkey любезно предоставлена Dr. Ilya Frolov (UTMB, США). Гены оболочечных белков ВВЭЛ штамма Trinidad donkey были амплифицированы с помощью ПЦР. Оболочечные белки ВВЭЛ транслируются вместе с С-концом белка вирусного капсида и не содержат кодон инициации в месте соединения. Одна конструкция включала С-копцевую часть RRV капсидного белка как лидерный пептид для оболочечного белка, чтобы подражать нормальному синтезу белка, как было описано ранее (Frolov et al., 1997). Эта конструкция была клонирована в pCDNA3 с использованием BamHl и Xhol рестрикционных сайтов, присутствующих в оригинальном векторе. Во вторую конструкцию был помещен искусственный кодон инициации трансляции после Bam HI сайта (подчеркнут). 1 ыли взяты ираймеры со следующими последовательностями: 5 GATCGGATCCATGTCACTAGTGACCACCATG3 и TGCTGACCAACCAGAAACATAACTCGAGCAT3
Количественная оценка проникновения вируса в реальном времени
Как следует из анализа литературных данных, имеющиеся на сегодняшний день методы изучения проникновения вирусных частиц в клетку-хозяина обладают рядом недостатков и не позволяют детально изучить лот процесс. Поэтому одной из задач данного исследования была разработка высокочувствительного количественного метода измерения слияния вирусной мембраны с клеточной мембраной в реальном времени, в условиях близких к физиологическим. Следует заметить, что такой метод измерения в реальном времени является принципиально важным фактором, так как, во-первых, позволяет достаточно точно изучить кинетику проникновения вируса, во-вторых, выявить факторы, необходимые вирусу для слияния. В последнем случае их часто требуется заблокировать, прибегнув к использованию токсических веществ. В идеале эти вещества должны находиться в клетке на протяжении всего эксперимента, причем, чем больше времени требуется для измерения слияния, тем более токсично будет это вещество, что может привести в итоге к ряду нсспсцифичсских эффектов. В-третьих, блокирование многих факторов не останавливает процесс проникновения вируса, а только замедляет, поэтому измерение в реальном времени является единственной возможностью это заметить.
В данном случае принципиально важным является выбор фермента, включенного в сосгав вирусных частиц, так как он должен отвечать целому ряду требований. Например, он должен отсутствовать в клетках, с которыми сливается вирус, чтобы снизить фоновые значения. Должна существовать также простая и чувствительная система детекции активности фермента в реальном времени. В дополнение к этому, для количественного измерения процесса слияния вирусной частицы с клеткой должна соблюдаться линейная зависимость между интенсивностью сигнала и количеством фермента. Кроме того, в процессе измерения активности фермент не должен быть токсичным, а субстрат не должен проходить сквозь вирусную мембрану. Наиболее подходящим ферментом, удовлетворяющим всем этим условиям, может быть люцифераза.
Люцифераза светлячка — фермент, который реагирует с АТФ. кислородом и люциферином, продуцируя свет. Именно, что этот фермент может быть подходящим инструментом для изучения проникновения вируса в клетку. Это утверждение основывается на следующих фактах. 1. Субстраты реакции ЛТР и кислород присутствуют в клетках в иелимитирующих количествах. 2. Люциферин может быстро и равномерно проникать в живые клетки, возможно с помощью метаболитического транспорта (Craig el al, 1991).
Мы предположили, что если люцифераза светлячка может быть включена в вирион, а затем высвобождена во время слияния вирусной и клеточной мембраны, то это обеспечит прекрасный индикатор проникновения вируса. Для решения этой проблемы было необходимо, в первую очередь, доставить фермент вовнутрь вируса при сохранении целостности вирусной мембраны. В идеале фермент должен свободно диффундировать после слияния и быть независимым от диссоциации и транспорта вирусной сердцевины.
Ранее было показано, что ферменты, такие как Р-галактозидаза, могут неспецифично включаться в состав MLV частиц и быть доставлены в инфицированные клетки (Liu el al, 1996). Мы решили использовать другой подход, заменив р1-галактозидазу на люциферазу, так как люцифераза позволяет увеличить чувствительность. MLV частицы были собраны с помощью одновременной трансфекции клеток 293 FT с плазмидами, кодирующими структурные белки MLV, полимеразу. Friend 57 MLV оболочечный белок и pFB-Luc (пакуемый вектор, экспрессирующий люциферазу). Мы обнаружили, что экспрессия люциферазы достигала максимума в то же время, что и титр вируса. К сожалению, в то время, как люциферазная активность регистрировалась в культуральной жидкости, люцифераза не осаждалась центрифугированием вместе с вирусом, что свидетельствует о том, что она была секретирована или освобождена независимо от вируса (таблица 3). Таким образом, стратегию включения люциферазы в вирус необходимо было изменить.
Специфичное направление чужеродных белков в вирусные частицы было показано для ВИЧ. Так, GFP и р"-лактамаза, соединенная с Vpr белком ВИЧ, могут быть включены в вирус (Cavrois el al., 2002; McDonald el al., 2002). Так как время освобождения Vpr от частиц неизвестно и происходить это может намного позже слияния, мы решили использовать оболочечный белок для направления люциферазы в вирус. Оболочечный белок MLV синтезируется как полипептид, который быстро расщепляется в эндоилазматическом рстикулуме на две субъединицы SU (70 кДа) и ТМ (15 кДа), которая заякоривает комплекс в клеточной и затем в вирусной мембране. Непосредственно до или сразу после отпочковывания от клеточной поверхности ТМ дальее расщепляется вирусной протеазой, высвобождая С-концевой пептид р2с. Ранее было показано, что этот шаг необходим вирусу для инфицирования (Rein el al., 1994), что приводит к глобальным изменениям структуры оболочечного белка (Aguilar el al., 2003). Тогда присоединение белка к С-концу ТМ обеспечило бы новый метод доставки рекомбинантного белка в вирус между мембраной и матриксом. Расщепление белка вирусной протеазой после отпочковывания освободило бы люциферазу, позволив ей диффундировать в клеточную цитоплазму после слияния. Чтобы проверить это предположение, мы сделали две конструкции env-lucl и env-luc2, которые присоединяют Friend 57 MLV оболочечный белок к N-концу люциферазного гена (рис. 4А).
