Введение к работе
Актуальность темы. Одной из фундаментальных задач медицины, биофизики, биохимии, молекулярной биологии и медицинской химии является исследование закономерностей функционирования системы гемостаза человека и, как следствие, возможное предотвращение таких патологических состояний, как инсульты, инфаркт, спонтанный тромбоз и др. Гемостаз является защитной реакцией организма, выражающейся в остановке кровотечения при повреждении стенки сосуда. Он возникает в результате спазма кровеносных сосудов и появления закупоривающего сосуд кровяного сгустка. В гемостатической реакции человека принимают участие окружающая сосуд ткань, стенка сосуда, плазменные факторы свертывания крови и клетки крови, в первую очередь тромбоциты, которые представляют собой безъядерные клеточные структуры неправильной округлой формы диаметром 1-4 мкм. Они образуются в костном мозге путем отщепления от мегакариоцитов. Главной функцией тромбоцитов является образование «белого тромба», закрывающего первичное повреждение стенки сосуда.
Активация тромбоцита может вызываться множеством стимулов, включая химические и механические. Основными физиологическими активаторами считаются коллаген (главный белок внеклеточного матрикса) и тромбин, которые относятся к сильным эффекторам, а также АДФ (аденозиндифосфат, появляющийся из разрушенных клеток сосуда или секретируемый самим тромбоцитами) и тромбоксан Аг (вторичный активатор, секретируемый тромбоцитами). Активаторы, взаимодействуя с соответствующими мембранными рецепторами тромбоцита, способствуют его переходу в активированное состояние, которое характеризуется изменением формы, адгезией, агрегацией, секрецией содержимого гранул, формированием прокоагулянтной поверхности.
В норме мембрана тромбоцита асимметрична, благодаря работе транслоказы, которая АТФ-зависимым образом осуществляет перенос фосфолипидов (фосфатидилсерина и фосфатидилэтаноламина) во внутренний слой мембраны. При активации эта асимметричность нарушается, активируются ферменты, действие которых приводит к выравниванию концентраций фосфолипидов между внешней и внутренней поверхностями мембраны. Это ведет к появлению во внешнем слое мембраны отрицательно заряженного фосфатидилсерина, что способствует сборке прокоагулянтных комплексов, таких как теназный и протромбиназный. [Zwaal R.F.A. et al. 1997]. Было обнаружено, что по данному параметру (уровень фосфатидилсерина на поверхности клетки) тромбоциты разделяются на две группы. Кроме того, в ходе активации тромбоциты секретируют и содержание своих гранул (альфа и плотные
гранулы), что играет важную роль в свертывании крови.
В настоящее время было показано, что сильная физиологическая активация тромбоцитов (например, тромбином в сочетании с коллагеном или конвульксином, агонистом коллагенового рецептора гликопротеина VI) может привести к развитию неоднородности в ответе тромбоцитов. В работе [Alberio L., et al. 2000] впервые было показано, что комбинированная активация тромбоцитов двумя физиологическими агонистами, тромбином и коллагеном, способствовала экспрессии высокого уровня а-гранулярного фактора V на поверхности части тромбоцитов. Они назвали данную фракцию клеток «укутанными» тромбоцитами. Было также доказано, что в данных клетках экспрессируется высокий уровень фосфатидилсерина на поверхности. В работе [Dale G.L., et al. 2002] было показано, что помимо а-гранулярного фактора V на поверхности «укутанных» тромбоцитов экспрессируются и другие а-гранулярные белки (фибриноген, фактор фон Виллебранта, тромбоспондин, фибронектин и аг-антиплазмин). Таким образом, новая обнаруженная субпопуляция тромбоцитов, названная «укутанными» тромбоцитами, характеризуется высоким уровнем фосфатидилсерина и альфа-гранулярных белков на своей поверхности.
В ходе изучения свойств новой фракции тромбоцитов, было определено, что предшественника данной субпопуляции «укутанных» тромбоцитов не существует и доля этих клеток зависит только от условий активации. [Alberio L, et al. 2000; London F.S. et al. 2004; Panteleev M.A. et al. 2005]. Было показано возможное участие коллагеновой рецептор-связанной молекулы FcRy, митохондриальной поры в формирование «укутанных» тромбоцитов. [Jobe S.M. et al. 2005; Remenyi G. et al. 2005]
Важным и пока не разрешенным вопросом в исследовании свойств «укутанных» тромбоцитов остаются механизмы, приводящие к их образованию.
Тромбин, а также тромбин с коллагеном или конвульксином, активируют тромбоцит, приводя к секреции гранул, с выделением тромбоксана Аг и АДФ. АДФ, как и тромбоксан Аг, являются физиологическими активаторами тромбоцитов. Выброс последних важен для формирования и развития тромба при повреждении. Однако их возможная роль в формировании «укутанных» тромбоцитов не совсем понятна. Предполагая, что АДФ через свои адренергические рецепторы, а тромбоксан Аг через собственный рецептор участвуют в активации тромбоцитов. Они активируют различные сигнальные пути, которые приводят к активации гликопротеина ПЬ/Ша, агрегации, а также секреции.
В работе [Dale G.L. et al. 2002] было показано, что альфа-гранулярные белки являются субстратами для трансглутаминаз тромбоцитов (тканевая трансглутаминаза и фактор ХШа), ферментов, катализирующих образование є-(у-глутамил)-лизиновьіх сшивок. Результаты экспериментов с антителами к тканевой трансглутаминазе и
фактору ХШа показали, что обе трансглутаминазы присутствуют на поверхности «укутанных» тромбоцитов, а использование ингибиторов трансглутаминаз приводит к блокированию образования «укутанных» тромбоцитов. Это свидетельствует о возможной роли данных ферментов (фактор ХШа и тканевая трансглутаминаза) в формировании «укутанных» тромбоцитов [Dale G.L. et al. 2002].
Существуют данные, предполагающие, что ведущую роль в формировании «укутанных» тромбоцитов может играть фактор ХШа. [Сох A., D Devine. 1994; Dale G.L. et al. 2002; Kulkarni S., et al. 2004] Однако, в работе [Jobe S.M. et al. 2005] было продемонстрировано, что мыши дефицитные по фактору ХШа не имели трудностей в образовании «укутанных» тромбоцитов. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что фактор ХШа не является необходимым для образования «укутанных» тромбоцитов, и предполагают, что другая клеточная трансглутаминаза, а именно тканевая трансглутаминаза, может компенсировать отсутствие фактора ХШа. Вопрос о роли данных ферментов до сих пор открыт.
«Укутанные» тромбоциты являются очень интересным и важным подклассом тромбоцитов. Имея высоко прокоагулянтную поверхность, они способны поддерживать протромбиназную активность. Есть указания на то, что «укутанные» тромбоциты могут быть критическим звеном, как в нормальном гемостазе, так и при тромбозе. Однако, их точное значение в физиологии и патофизиологии, а также механизмы формирования такой гетерогенности тромбоцитов при активации неизвестны. Поэтому изучение сигнальных механизмов, ведущих к формированию данной субпопуляции тромбоцитов очень важно.
Цель работы: Экспериментальное исследование механизмов формирования гетерогенности тромбоцитов при их активации in vitro.
Задачи исследования:
Определение роли секреции тромбоцитов в образовании «укутанных» тромбоцитов
Исследование внутриклеточных путей сигнализации, регулирующих формирование гетерогенности тромбоцитов при их активации
Определение роли тканевой трансглутаминазы и фактора ХШа в формировании гетерогенности тромбоцитов
Научная новизна. В работе показано, что на образование «укутанных» тромбоцитов влияет АДФ, секретируемый из плотных гранул тромбоцитов, через адренергический рецептор P2Y12. Установлено, что в формировании гетерогенности тромбоцитов участвуют внутриклеточные пути сигнализации, идущие от рецептора P2Y12 и связанные с действием аденилатциклазы, фосфоинозитид-3-киназы и Src-тирозинкиназы. Установлено, что фактор ХШа и, особенно, тканевая трансглутаминаза
вносят существенный вклад в формирование гетерогенности тромбоцитов при их активации.
Научно-практическое значение. Данная работа является фундаментальным исследованием, позволяющим понять механизмы формирования гетерогенности тромбоцитов крови человека при их активации, а также предполагаемую роль «укутанных» тромбоцитов. Результаты данной работы могут быть полезны как для понимания происходящих процессов тромбообразования, так и для создания на основе имеющихся знаний новых методов антитромботической терапии.
Положения, выносимые на защиту:
АДФ из плотных гранул регулирует формирование гетерогенности тромбоцитов человека.
Сигнализация от АДФ, регулирующая образование «укутанных» тромбоцитов, идет через пуринэргический рецептор P2Y12.
Пути внутриклеточной сигнализации, ведущие к формированию «укутанных» тромбоцитов: аденилатциклаза, фосфоинозитид-3-киназа и Src-тирозинкиназа.
Показано, что тканевая трансглутаминаза и фактор ХШа участвуют в формировании гетерогенности тромбоцитов крови человека при их активации.
Структура диссертации. Диссертация изложена на 101 странице машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 — обзора литературы, главы 2 — описания материалов и методов, главы 3 — описание экспериментальных результатов, главы 4 — обсуждения результатов), выводов и библиографического указателя, включающего 99 источников. Работа выполнена на базе Учреждения Российской Академии Медицинских наук Гематологический Научный Центр РАМН в лаборатории физической биохимии системы крови (зав. лабораторией проф., д.б.н. Атауллаханов Ф.И.).
Апробация работы состоялась 16 сентября 2009 года на заседании проблемной комиссии "Биохимия, биофизика и реология крови" в Учреждении Российской Академии Медицинских наук Гематологический Научный Центр РАМН. Материалы диссертации докладывались на 11-й и 12-й Международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука ХХІвека» (Пущино, 29 октября - 2 ноября 2007 года, 10 - 14 ноября 2008 года); на 33rd FEBS Congress & 11th ШВМВ Conference (Athens, 28 June - 3 July 2008); 53rd Annual Meeting Society of Thrombosis and Haemostasis Research (Vienna, February 04 - 07, 2009).
Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 7 публикациях. Статей в рецензируемых журналах: 3; публикациях в трудах конференций и съездов: 4
