Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Исследование функциональных свойств рековерина, содержащего реконструированный Ca^2+ - связывающий центр EF4 Ваганова Светлана Алексеевна

Исследование функциональных свойств рековерина, содержащего реконструированный Ca^2+ - связывающий центр EF4
<
Исследование функциональных свойств рековерина, содержащего реконструированный Ca^2+ - связывающий центр EF4 Исследование функциональных свойств рековерина, содержащего реконструированный Ca^2+ - связывающий центр EF4 Исследование функциональных свойств рековерина, содержащего реконструированный Ca^2+ - связывающий центр EF4 Исследование функциональных свойств рековерина, содержащего реконструированный Ca^2+ - связывающий центр EF4 Исследование функциональных свойств рековерина, содержащего реконструированный Ca^2+ - связывающий центр EF4 Исследование функциональных свойств рековерина, содержащего реконструированный Ca^2+ - связывающий центр EF4 Исследование функциональных свойств рековерина, содержащего реконструированный Ca^2+ - связывающий центр EF4 Исследование функциональных свойств рековерина, содержащего реконструированный Ca^2+ - связывающий центр EF4 Исследование функциональных свойств рековерина, содержащего реконструированный Ca^2+ - связывающий центр EF4
>

Данный автореферат диссертации должен поступить в библиотеки в ближайшее время
Уведомить о поступлении

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - 240 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Ваганова Светлана Алексеевна. Исследование функциональных свойств рековерина, содержащего реконструированный Ca^2+ - связывающий центр EF4 : Дис. ... канд. биол. наук : 03.00.04 : Пущино, 2004 138 c. РГБ ОД, 61:05-3/109

Содержание к диссертации

Введение

CLASS Обзор литератур CLASS ы 8

1. Общая схема зрительной трансдукции 8

1.1. Строение глаза, сетчатки и фоторецепторных клеток 8

1.2. Морфология и состав наружных сегментов палочек 14

1.3. Передача зрительного сигнала 18

1.4. Восстановление темнового состояния фоторецепторной клетки. 19

2. Рековерин 22

2.1. Тканевая и клеточная локализация 23

2.2. Ген и первичная структура 24

2.3. N-концевое ацилирование 25

2.4. Са2+-связывающие центры рековерина '. 25

2.5. Са2+-зависимое взаимодействие рековерина с фоторецепторными мембранами 29

2.6. Ортологи и гомологи рековерина 32

3. Родопсинкиназа 40

3.1. Ген и тканевая локализация родопсинкиназы 41

3.2. Характеристика доменов родопсинкиназы и посттрансляционные модификации 42

3.3. Взаимодействие родопсинкиназы с родопсином и ее активация. 44

3.4. Участки фосфорилирования родопсина родопсинкиназой 49

3.5. «Фосфорилирование родопсина с высоким выходом» 51

4. Рековерин как Са2+-сенсор родопсинкиназы 53

Материалы и методы 57

1. Материалы и реактивы 57

2. Выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток 57

3. Мутагенез с помощью полимеразной цепной реакции 58

4. Отбор мутантных клонов 59

5. Секвенирование ДНК 59

6. Экспрессия рековерина и его мутантов в клетках E.coli 60

7. Выделение рекомбинантного рековерина дикого типа и его мутантных форм 60

8. Приготовление кальциевых буферов и измерение [Са ]free 62

9. Определение количества кальция, связанного с рековерином 62

10. Выделение наружных сегментов палочек сетчатки 63

11. Получение отмытых мочевиной фоторецепторных мембран 64

12. Связывание рекомбинантного рековерина и его мутантных форм с отмытыми мочевиной фоторецепторными мембранами 65

13. Выделение родопсинкиназы 65

14. Определение активности родопсинкиназы 66

15. SPR-спектроскопия 67

15.1. Приготовление и иммобилизация липосом 67

15.2. Измерение связывания рековерина и его мутантных форм с SPR-чипом. Обработка экспериментальных данных 68

16. Аналитические процедуры 69

16.1. Определение концентрации белков 69

16.2. SDS-электрофорез в полиакриламидном геле 70

16.3. Электрофорез ДНК в агарозном геле 70

Результаты и их обсуждение 71

1. Получение мутантов рековерина, модифицированных по четвертому Са2+-связывающему центру (EF+4) и одновременно с нарушенной Са2+ -связывающей способностью у EF2 (EF-2+4) и EF3(EF-3+4) 72

1.1. Клонирование мутантов рековерина EF+4, EF-2+4 и EF-3+4 72

1.2. Экспрессия мутантов рековерина EF+4, EF-2+4 и EF-3+4 76

1.3. Выделение мутантов рековерина EF+4, EF-2+4 и EF-3+4 77

2. Связывание ионов кальция мутантами рековерина, модифицированными по четвертому Са -связывающему центру...78

2.1. Мутант EF+4 79

2.2. Мутант EF-2+4 81

2.3. Мутант EF-3+4 82

3. Са2+-зависимое взаимодействие мутантов рековерина, модифицированных по четвертому Са2+-связывающему центру, с фоторецепторными мембранами 87

4. Са2+-зависимое ингибирование родопсинкиназы мутантами рековерина, модифицированными по четвертому Са2+-связывающему центру 93

5. Изучение взаимодействия мутантов рековерина по четвертому Са2+-связывающему центру с иммобилизованным липидным бислоем методом SPR-спектроскопии 99

5.1. Принцип метода SPR-спектроскопии 100

5.2. Применимость метода SPR-спектроскопии для изучении взаимодействия мутанта рековерина EF+4 с иммобилизованным липидным бислоем 101

5.3. Изучение зависимости взаимодействия мутанта EF+4 с липидным бислоем, иммобилизованным на SPR-чипе, от концентрации ионов кальция и белка 104

5.4. Кинетика диссоциации мутантов EF+4, EF-2+4 и EF-3+4 из комплекса с липидным бислоем, иммобилизованным на SPR-чипе. 109

Выводы 120

Список литературы 122

Введение к работе

Нейрональные кальциевые сенсоры (NCS, neuronal calcium sen- sors) образуют семейство EF-hand-содержащих Са -связывающих белков, как правило, высокоспецифичных для нервных клеток. Эти белки выполняют регуляторную роль в отношении различных внутриклеточных белков-мишеней таких, как: протеинкиназы, гуанилат-циклазы, аденилатциклазы и ионные каналы. Типичным представителем семейства NCS является рековерин, высокоспецифичный для нейронов сетчатки. Рековерин участвует в Са -зависимой регуляции зрительной трансдукции, являясь Са2+-сенсором родопсинкиназы -фермента, десенситизирующего фотоактивированный родопсин путём его фосфорилирования. Общим свойством представителей семейства NCS является наличие в их структуре четырех потенциальных Са -связывающих центров типа EF-hand. При этом в большинстве случаев Са2+-связывающий центр EF1 не способен координировать катионы, поскольку нарушена его каноническая последовательность. Молекула рековерина, помимо нефункционального центра EF1, содержит в своей структуре Са2+-связывающий центр EF4, который также не способен связывать ионы кальция: таким образом, в его молекуле только два Са -связывающих центра, а именно EF2 и EF3, координируют ка-тион. Наличие активного четвертого Са -связывающего центра в структуре молекулы белка характерно почти для всех представителей семейства NCS, что свидетельствует о необходимости центра EF4 для нормального функционирования белков этого семейства. Однако, поскольку ранее не было продемонстрировано влияние активного четвертого Са +-связывающего центра молекулы рековерина на его функциональные свойства, мы попытались ответить на этот вопрос в настоящей работе, используя мутантные формы белка с «восстановленной» способностью координировать катион центром EF4.

Морфология и состав наружных сегментов палочек

Морфология наружного сегмента палочки (НСП) весьма своеобразна. НСП имеет цилиндрическую форму и по диаметру примерно соответствует внутреннему сегменту палочки. У человека диаметр НСП составляет 2 мкм, длина его равна 40-60 мкм, объем 1,6 х 10 3 л; у быка соответствующие параметры НСП составляют 2 мкм, 7-Ю мкм, 2,7 х 10"н л, у лягушки 5-7 мкм, 35-50 мкм, 1 х 10 12 л [4].

Хотя НСП не содержат обычных клеточных органелл, они обладают характерной структурой. Их можно уподобить замкнутому мешку, образованному внешней (плазматической) клеточной мембраной, в который помещена стопка из сотен или даже тысяч (в зависимости от вида животного) уплощенных замкнутых структур, называемых фото-рецепторными дисками. Фоторецепторные диски образуются у основания НСП как впячивание плазматической мембраны, причем внутреннее пространство вновь образованных дисков еще сообщается с внеклеточным пространством. Позднее диски как бы отпочковываются от плазматической мембраны, превращаясь в замкнутые структуры, и становятся независимыми как от нее, так и друг от друга. Тем самым наружная поверхность плазматической мембраны оказывается внутренней поверхностью дисков, а их просвет как бы ведет свое происхождение от внеклеточного пространства (заметим, что наружные сегменты колбочек по своему строению принципиально отличаются от НСП тем, что «колбочковые диски» представляют собой складки плазматической мембраны и их внутреннее пространство сообщается с внеклеточной средой) [1, 2]. Диски расположены друг над другом стопкой и их края имеют разрезы, или инциссуры, направленные от периферии к центру, которые придают дискам дольчатый вид. Разрезы образуют как бы желобки, идущие вдоль НСП, и в этих желобках помещаются микротрубочки, берущие начало в аксонеме у основания наружного сегмента.

Подавляющая часть мембран НСП - это мембраны фоторецеп-торных дисков, на плазматическую мембрану приходится всего лишь 1-5% общей массы мембран НСП [5, 6]. Число фоторецепторных дисков на один наружный сегмент, как уже было сказано, может варьировать: в НСП человека их содержится около 1000, быка - 500, лягушки - 2000.

Фоторецепторные клетки, будучи нейронами, подчиняются известному правилу, гласящему, что нервные клетки не восстанавливаются. Однако это правило не распространяется на палочковые диски, которые в течение всей жизни палочки претерпевают непрерывное обновление, происходящее следующим образом. По мере образования у основания НСП и отпочковывания от плазматической мембраны фоторецепторные диски постепенно перемещаются в направлении верхушки сегмента. Одновременно на их место приходят новые диски, поступающие со стороны цилии. В конечном счете старые диски отшелушиваются с конца НСП, фагоцитируются клетками пигментного эпителия, после чего деградируют под действием его лизосомальнои системы. Процесс обновления фоторецепторных дисков происходит непрерывно и с высокой скоростью. Так, у лягушек ежедневно обновляется до 80 дисков на НСП [1].

Состав НСП также необычен, Фоторецепторные диски - главный структурный элемент НСП - построены почти исключительно из белков и липидов (около 60 и 40% общей массы мембран соответственно). Углеводов в НСП немного - лишь 4% их общего сухого веса. В цитоплазме НСП, заполняющей узкие просветы между дисковыми мембранами и зазоры между внешними краями дисков и плазматической мембраной, главный компонент - это белки [1,3].

Липидный состав фоторецепторных мембран характеризуется малым количеством холестерина и большим содержанием двойных связей, что в совокупности обусловливает низкую вязкость и высокую лабильность этих мембран. Тем не менее их состав даже более кон сервативен, чем у менее текучих биологических мембран из некоторых жизненно важных органов.

Белковый состав НСП уникален. В зависимости от поведения белков в гипотонической среде (в растворе с концентрацией соли около 10 мМ) они разделяются на интегральные мембранные и экстрагируемые. Интегральные мембранные белки НСП остаются в связанном с мембранами состоянии даже после их интенсивной экстракции. Таких белков около 70% (общего количества белков в НСП), причем их основная доля - около 95% - приходится на зрительный пигмент родопсин [7]. Экстрагируемые белки НСП проигрывают интегральным мембранным белкам по общей массе, зато они намного богаче по номенклатуре: первых в НСП порядка 70 типов, вторых, включая родопсин, немногим более 10. Больше всего в экстрагируемой фракции G-белка трансдуцина, количество которого примерно в 10 раз меньше по сравнению с родопсином. Далее следует белок аррестин - его в НСП в несколько раз меньше, чем трансдуцина. Еще несколько белков представлено в 10-100 раз меньшем количестве, чем трансдуцин. Среди них функционально наиболее важные - фосфодиэстераза циклического GMP (cGMP-фосфодиэстераза), родопсинкиназа, гуанилилциклаза, рековерин и активатор гуанилил цикл азы. Молярное соотношение фосфодиэстераза : трансдуцин : родопсин выглядит как 1 : 10 : 100 [8]. Именно интегральный мембранный рецептор родопсин и названные выше экстрагируемые белки служат компонентами молекулярной машины, обеспечивающей в НСП, которые выполняют функции световой антенны, т.е. восприятие, передачу, усиление, регуляцию и выключение зрительного сигнала [3,9].

Выделение рекомбинантного рековерина дикого типа и его мутантных форм

Экспрессию рековерина и его мутантов проводили по методу, описанному в работе [173]. Штаммы-продуценты рековерина и его мутантные формы выращивали в сходных, описанных ниже условиях. Культуральная среда LB содержала ампициллин (50 цг/мл.), а также дополнительно в случае миристоилированных форм - канамицин (50 цг/мл.). В случае получения миристоилированных форм за 20 минут перед добавлением ИГПТ в культуральную среду также добавляли миристиновую кислоту до конечной концентрации 5 цг/мл. Отобранную отдельную колонию выращивали в течение ночи при 37С, ночную культуру разводили в соотношении 1:100 культуральной средой LB и выращивали при 37С до поглощения Абоо 0,6 ОЕ, после чего добавляли ИГПТ до конечной концентрации 0,1 мМ. Через 3 часа клетки собирали центрифугированием, ресуспендировали в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl рН 8,0, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и замораживали при -20С.

Выделение рекомбинантного рековерина дикого типа и его мутанти ых форм.

Выделение рековерина дикого типа, а также мутантов EF+4, EF-2+4 и EF-3+4 проводили следующим образом. Клетки E.coli лизи-ровались в процессе замораживания и размораживания клеточной суспензии в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 100 мМ NaCl и 1 мМ ЭДТА, в присутствии лизоцима (10 цг/мл) для разрушения клеточных стенок. При выделение как миристоилированного, так и немиристоилированного рековерина дикого типа и его мутантов (EF+4, EF-2+4 и EF-3+4), клеточный дебрис отделяли от растворимых белков центрифугированием (10000 rpm, 15 мин.). Фракцию растворимых белков подвергали дробному фракционированию сульфатом аммония. Высаливанию рековерина наблюдалось в диапазоне 70-90% насыщения сульфатом аммония. Осадок белка растворяли в буфере А, содержащем 50 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 100 мМ NaCl, 10 мМ СаС12} и наносили на колонку с фенил-сефарозой (Pharmacia). Образование гидрофобного кармана у рековерина при высоких концентрациях кальция определяет его способность взаимодействовать с фенил-сефарозой. Элюцию рековерина и его мутантных форм проводили буфером Б, содержащим 50 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 100 мМ NaCl, 10 мМ EGTA. Присутствие в буфере ЭГТА вызывает изменение конформа-ции белка и, следовательно, разрушение комплекса между гидрофобным карманом и носителем. Для дополнительной очистки и концентрирования препаратов рековерина применяли анионообменную хроматографию на колонке MonoQ HR10/10 (Pharmacia) в 40 мМ Трис-НС1, рН 8,0, в линейном градиенте концентрации NaCl от 0 до 300 мМ. Чистота полученных препаратов рековерина, по данным SDS-электрофореза, была более 98 %.

Выделение мутантов рековерина EF-2, EF-3 проводили по следующей методике. Клетки E.coli лизировались путем замораживания и размораживания клеточной суспензии в том же буфере, что и в случае рековерина дикого типа, однако, лизоцим при этом не добавлялся. Клеточные стенки отделялись от растворимых белков центрифугированием (10000 rpm, 25 мин.), супернатант фильтровался через фильтр 0,45 мкм. и наносился на гельфильтрационную колонку 25X900 мм с носителем Superose 12 prep.grade (Pharmacia). Для проведения хроматографии использовался следующий буфер: 40 мМ Трис-НС!, рН 8,0, 50 мМ NaCl, 2 мМ меркаптоэтанол. Скорость элюции 2 мл/мин., объ ем собираемых фракций 2 мл. Фракции, содержащие целевой белок, тестировались электрофорезом и объединялись. Объединенные фракции разбавляли в 10 раз водой и для дальнейшей очистки и концентрирования применяли анионообменную хроматографию на колонке MonoQ HR10/10 (Pharmacia) в 40 мМ Трис-HCl, рН 8,0, в линейном градиенте концентрации NaCl от 0 до 300 мМ.

Приготовление кальциевых буферов и измерение [Са ]free.

Кальциевые буферы были приготовлены на основе 2 мМ рас-твора ЭГТА (для получения [Са ]free в диапазоне 10 - 500 нМ) либо 3 мМ раствора Вг2ВАРТА (для получения [Ca2+]fyce в диапазоне 0,5 - 28 цМ). Величины [Ca2+]free в буферных растворах рассчитывали с помощью программы "Webmaxc 2.10" (Стэндфордский университет); правильность рассчитанных соотношений Са2+/ Вг2ВАРТА при [Ca2v]free выше 1 цМ проверяли с помощью Са -чувствительного электрода (World Precision Instruments, Inc.).

Определение количества кальция, связанного с рековерином.

Примеси ионов кальция, присутствующие в буферных растворах и препаратах рековерина, удаляли с помощью Са2+-адсорбирующего носителя Chelex-100. Связывание Са с рековерином и его мутантны-ми формами определяли методом ультрафильтрации, который включал следующие стадии. В верхний отсек концентратора Centricon-10 (задерживает белки размером свыше 10 к Да) помещали 0,5 мл 50 или 100 цМ раствора рековерина в 20 мМ HEPES буфере, рН 7,5, содержащем 100 мМ NaCl и 1 мМ ДТТ, в который были добавлены 10 цл 0,2 мМ раствора 45СаСЬ (0,4 - 0,5 цКюри). Пробы центрифугировали (1 мин, 7000 об/мин) в настольной центрифуге "Beckman", модель TJ-6, из нижнего и верхнего отсеков концентратора отбирали по 15 цл раствора и измеряли радиоактивность этих растворов методом жидко-стносцинтилляционного счёта. Далее в верхний отсек концентратора, в котором присутствовал задержанный фильтром белок, добавляли 15 (лл 0,2 мМ раствора нерадиоактивного СаС , после чего пробы вновь центрифугировали. Процедуру добавления раствора нерадиоактивного СаСЬ и центрифугирования повторяли несколько раз таким образом, чтобы расчетная величина [Ca2+]free достигала примерно цМ (при более высоких значениях [Са ]free ошибка эксперимента значительно возрастает).

Получение мутантов рековерина, модифицированных по четвертому Са2+-связывающему центру (EF+4) и одновременно с нарушенной Са2+ -связывающей способностью у EF2 (EF-2+4) и EF3(EF-3+4)

При получении мутанта EF+4 мы применили методику олиго-нуклеотид-направленного мутагенеза с помощью ПЦР, стратегию ме-гапраймера (см. «Материалы и методы», раздел 3), поскольку in vitro система мутагенеза оказалась неэффективной, что было обусловлено большим количеством вводимых замен. Для «восстановления» Са2+-связывающей способности центра EF4, потребовалось введение пяти точечных мутаций (G160D, К161Е, K162N, D165G и K166Q) (рис. Иг).

В качестве матрицы для ПЦР использовалась плазмида pL2p26 [182]. В первой ПЦР использовались следующие праймеры: № 2 - му-тагенизирующий олигонуклеотид: 5 - dGGATTCTTTGACGAGAAT-GATGATGGTCAACTTACAG - 3 ; № 3 - комплиментарный области матрицы за терминатором трансляции кДНК рековерина: 5

При этом вводимые замены превращали сайт рестриктазы Hindi в сайт рестриктазы Ncol. В результате реакции синтезировался фрагмент (около 180 и.о.), который впоследствии применялся в качестве мегапраимера во второй ПЦР. Матрицей для второй ПЦР служила плазмида pL2p26, обработанная рестриктазой Tagl, которая рестрицирует ДНК в области, расположенной между праймерами 2 и 3. Олигонуклеотид (№ 1), использованный во второй ПЦР, имеет структуру: 5" - dGATCTGAAATT-С А АСА A AG А А - 3\ — комплиментарную области Ssp А:

Фрагмент (около 800 п.о.), полученный в ходе ПЦР-реакции, обрабатывался рестриктазой Ncol и клонировался в вектор pETlld, также обработанный Ncol. Введение мутации подтверждалось определением нуклеотидной последовательности гена.

Ранее, методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза по системе Sculptor in vitro, предложенной фирмой Amersham, нами были получены следующие мутантные формы рековерина [183]: 1) EF-2, в котором произведены замены остатка глутаминовой кислоты на глу-тамин (E85Q), что привело к потере способности координировать ионы кальция центром EF2 (рис. 116); 2) EF-3 с аналогичной заменой в центре EF3 (E121Q) (рис. 11 в). При выборе аминокислотных остатков, по которым были произведены замены, мы исходили из того, что мо-дификация остатков, локализованных в Z-позициях С а -связывающих петель EF-hand структур, приводит к почти 1000-кратному снижению аффинности этих структур к ионам кальция [184, 185]. По данным методов кругового дихроизма, флуоресценции и тепловой денатурации, указанные аминокислотные замены не вызывают заметных изменений вторичной и третичной структур рековерина [186]. Клонирование мутантных форм рековерина EF-2+4 (рис. 11д) и EF-3+4 (рис. 11е) проводили по схеме, представленной на рис. 12.

В качестве матрицы для получения мутантов EF-2+4 и EF-3+4 была использована мутантная форма рековерина EF+4, обработанная рестриктазой Bglil. Рестрикционный фрагмент, содержащий в своем составе участок гена с мутацией в четвертой Са -связывающей петле и вектор pETlld, лигировали с BgRl-Bglll фрагментами гена рековерина из мутантных форм EF-2 и EF-3 с мутациями во втором и третьем С а +-связывающих центрах соответственно. Затем лигазной смесью трансформировали клетки E.coli, штамм XL-II. Выделенную после трансформации плазмидную ДНК клонов, содержащую мутантную к ДНК рековерина, проверяли на правильность ориентации клонированного фрагмента с помощью рестрикционного анализа. Структуру полученной конструкции подтверждали анализом ее нуклеотидной последовательности.

При получении немиристоилированных мутантов EF+4, EF-2+4 и EF-3+4, экспрессию мутантных генов рековерина проводили в векторе pETI Id. Отобранной плазмидой трансформировали клетки E.coli, штамм В834 (DE3), содержащий в составе хромосомы РНК-полимеразу фага Т7 под контролем ас-промотора, который обеспечивает высокий уровень биосинтеза белка.

В отличие от природного рековерина, основная доля которого в фоторецепторной клетке N-ацилирована, рекомбинантный рековерин и его мутантные формы не были модифицированы, так как клетки E.coli не содержат собственной N-миристоилтрансферазы. С целью получения миристоилированных мутантов рековерина нами была проведена коэкспрессия в клетках E.coli генов рековерина и N-миристоилтрансферазы из Saccharomyces cerevisae. N-миристоилтрансфе-раза катализирует ковалентное присоединение миристиновой кислоты с образованием амидной связи с N-концевым остатком глицина у бел ков с сигнальной последовательностью GXXXS/T [187]. Коэкспрессия мутантных генов рековерина и N-миристоилтрансферазы достигалась при совместной трансформации клеток E.coli, штамм В834 (DE3) плазмидой pETlld с мутантными генами рековерина, и плазмидой рВВІЗІ, содержащей ген N-миристоилтрансферазы дрожжей [188]. Условия экспрессии мутантных генов рековерина подробно описаны в главе «Материалы и методы», раздел 6.

Изучение взаимодействия мутантов рековерина по четвертому Са2+-связывающему центру с иммобилизованным липидным бислоем методом SPR-спектроскопии

Принцип метода SPR-спектроскопии заключается в следующем (рис. 23). На поверхности специального SPR-чипа происходит взаимодействие двух лигандов, один из которых иммобилизован на поверхности чипа, другой - находится в подвижной фазе, в растворе, контактирующем с поверхностью чипа с иммобилизованным лиган-дом. На поверхность SPR-чипа падает монохроматический, р-поляризованный пучок света. Поверхность чипа (обычно золото или серебро) способна поглощать свет, падающий под определенным углом (так называемое явление поверхностного плазмон-резонанса).

Связывание лиганда с поверхностью чипа меняет его поглощающие свойства, что приводит к изменению резонансного угла поражения, который регистрируется спектрометром. Таким образом можно определить количество лиганда связавшегося с поверхностью SPR-чипа, которое выражается в относительных единицах связывания (resonance units, RU). Величина сигнала, равная 1 RU, соответствует изменению угла резонанса на 10 4 градуса, что означает увеличение концентрации лиганда на поверхности SPR-чипа на 1 пикограмм/мм . Концентрация связанного лиганда может быть измерена при величинах SPR-сигнала, не превышающих 30000 RU [190]. Графики зависимости относительных единиц связывания от времени (сенсограммы), регистрируемые SPR-спектрометром, позволяют наблюдать в реальном времени взаимодействие лигандов, один из которых иммобилизован на чипе, другой - находится в контактирующей с ним растворимой фазе. Обработка сенсограмм с помощью специальной программы позволяет определить кинетические параметры, характеризующие взаимодействие лигандов.

Применимость метода SPR-спектроскопии для изучении взаимодействия мутанта рековерина EF+4 с иммобилизованным липидным бислоем.

Для исследования связывания мутанта EF+4 с иммобилизованным фосфолипидным бислоем методом SPR-спектроскопии нами была разработана система «рековерин-искусственная фосфолипидная мембрана», которая может рассматриваться как модель взаимодействия белка с фоторецепторной мембраной. В этой системе искусственный липидный бислой, идентичный липидному составу фоторецеп-торных мембран (подробнее о составе см. «Материалы и методы», раздел 15.1), образует однородную поверхность на SPR-чипе и присутствует в неподвижной фазе в течение хода эксперимента (рис. 24). Мутантная форма рековерина находится в составе растворимой фазы, подвижной относительно иммобилизованного липидного бислоя; растворимой фазой служит тот же буфер, что и при изучении связывания мутантов рековерина с отмытыми мочевиной фоторецепторными мембранами (см. «Материалы и методы», раздел 12).

Ранее было показано [63], что только миристоилированная форма рековерина способна взаимодействовать с липидным бислоем как в присутствии, так и в отсутствие ионов кальция. В то же время неми-ристоилированный рековерин практически не взаимодействует с иммобилизованным липидным бислоем, и эффект ионов кальция в этом случае слабо выражен. Таким образом, поведение рековерина при связывании с липидным бислоем аналогично тому, которое наблюдается при его связывании с фоторецепторными мембранами (см. «Результаты и их обсуждение», раздел 3). Поэтому, дальнейшее изучение связывающих параметров было проведено нами только для миристоили-рованного мутанта рековерина EF+4. Поскольку, как было сказано выше (см. «Результаты и их обсуждение», раздел 2), «восстановление» Са -связывающей способности центра EF4 в рековерине дикого типа (мутант EF+4) не оказывает влияния на свойство центров EF2 и EF3 координировать катионы, мы предположили, что взаимодействие этого мутанта с липидным бислоем будет таким же, как и в случае реко-верина дикого типа.

Похожие диссертации на Исследование функциональных свойств рековерина, содержащего реконструированный Ca^2+ - связывающий центр EF4