Введение к работе
Актуальность проблемы
В процессе метаболизма растений в кислородной атмосфере, неизбежно образуются активные формы кислорода (АФК). К таким формам кислорода относятся: синглетный кислород ('02), супероксидный анион-радикал (02"), гидроксильный радикал ('ОН), пероксид водорода (Н202). АФК образуются во всех компартментах клетки - цитоплазме, хлоропластах, митохондриях, пероксисомах и на наружной стороне плазмалеммы (Foyer, Noctor, 2009). Предполагается, что основным источником АФК в растениях на свету является фотосинтетическая электрон-транспортная цепь (ФЭТЦ) хлоропластов. При взаимодействии триплетных молекул кислорода с молекулами хлорофиллов в триплетном состоянии возникают молекулы синглетного кислорода. В результате переноса электрона на кислород от компонентов ФЭТЦ (реакция Мелера) происходит образование супероксидного анион-радикала (02"), который при последующем восстановлении или дисмутации превращается в перекись водорода - Н202. АФК имеют высокую реакционную способность и могут повреждать внутриклеточные компоненты. В настоящее время АФК рассматривают не только как деструктивные молекулы, но и как важные сигнальные молекулы, играющие роль первичных и вторичных сигналов в системе клеточной регуляции.
Система регуляции с участием АФК контролируется процессами их образования и утилизации. Многие, если не все, внешние воздействия смещают баланс между двумя этими процессами, что сказывается как на стационарной концентрации разных видов АФК, так и на окислительно-восстановительном состоянии основных низкомолекулярных компонентов антиоксидантной системы - аскорбата и глутатиона (Mittler et al., 2004). Обнаружены протеинкиназы, факторы транскрипции и фосфатазы, активность которых напрямую регулируется АФК (Desikan, 2001).
В настоящее время считается доказанным участие АФК в процессах апоптоза, запрограммированной гибели клеток (Gadjev, 2008). Было показано участие АФК в протекании защитных реакций, таких как образование поперечных связей между гликопротеинами клеточной стенки, реакции гиперчувствительности (Thordal-Christensen et al., 1997; Wojtaszek, 2007) и системной устойчивости (Ryals et al., 1996). Имеются данные о совместном
Принятые сокращения АФК- активные формы кислорода; ФЭТЦ- фотосинтетическая электрон-транспортная цепь; BSA - бычий сывороточный альбумин; DCF - дихлороф-луоресцеин; DCMU - 3-(3,4-дихлорфенил)-1,1-диметилмочевина (диурон); FDA - флуоресцеин диацетат; H2DCF-DA - дигидродихлорофлуоресцеин диацетат; H2DCF - дигидродихлорофлуоресцеин.
действии АФК с абсцизовой кислотой при закрытии устьиц (Zhang et al., 2001) и с ауксином в гравитропической реакции корня (Joo et al., 2001).
До сих пор нет однозначных данных о скорости образования и количестве разных АФК в клетках растений in vivo. На свету в хлоропластах по разным источникам в норме до 30% электронов, проходящих по ФЭТЦ, переносится на кислород с образованием 02~ и затем Н202. Скорость дисму-тации молекул О*" супероксиддисмутазами близка к скорости их поступления в каталитический центр в процессе диффузии (2Х109 M'V1). Все молекулы 02~, появляющиеся в строме хлоропластов, преобразуются в Н202 супероксиддисмутазами, находящимися в большом количестве на поверхности тилакоидных мембран (Asada, 2000). Н202 обладает меньшей реакционной способностью, более длительным временем жизни и способна перемещаться на большее расстояние от места своего образования, чем другие АФК. Для предотвращения деструктивного действия Н202 в хлоропластах и в целой клетке действуют несколько антиоксидантных систем. Основными компонентами антиоксидантной системы хлоропластов являются аскорбат и аскорбатпероксидазы, растворимые и мембраносвязанные (Asada, 1999). Передача сигнала может происходить рядом с местом образования Н202 в мембране или строме хлоропласта, но Н202 может также выйти из хлоропластов и инициировать сигнальные пути в цитоплазме. Молекулы Н202, образованные в разных компартментах клетки, могут инициировать разные сигнальные пути (Mullineaux, 2006).
В связи с малым временем жизни АФК в клетке в присутствии анти-оксидантов, не существует надежных методов определения их концентрации в живых клетках (Queval et al., 2007, Swanson et al., 2011). Исследования процессов, в том числе процессов метаболизма АФК, происходящих в зеленых клетках растений, с помощью микроскопии с применением цветных и флуоресцентных красителей затруднены тем, что эти клетки содержат вещества как поглощающие свет, так и способные флуоресцировать, прежде всего, хлорофилл. Поэтому в качестве объектов чаще используют клетки и ткани растений не содержащие хлоропластов, такие как корни и эпидермис. Большинство исследований с использованием цветных или флуоресцентных индикаторов АФК показывают относительное количество АФК до и после воздействия. В настоящей работе предпринята попытка наблюдения динамики образования АФК в зеленых, фотосинтезирующих клетках листьев растений в процессе освещения.
Цель и задачи работы
Основная цель работы - выяснить динамику образования и распределения Н202 в фотосинтезирующих клетках высших растений на свету. В ходе выполнения диссертационной работы решали следующие задачи:
1. Разработать методические приемы измерения в протопластах и хлоропластах листьев высших растений светоиндуцированной динамики
флуоресценции DCF, продукта реакции красителя H2DCF-DA с пероксидом водорода.
-
Установить, какие процессы, помимо реакции H2DCF-DA с пероксидом водорода, влияют на уровень флуоресценции DCF и ее динамику.
-
Измерить кинетику продукции Н202 в протопластах и выявить процессы, влияющие на распределение Н202 между хлоропластами и цитоплазмой.
-
В опытах с протопластами, выделенными из листьев мутантов араби-допсиса с нарушенным биосинтезом аскорбата выявить роль этого антиок-сиданта в метаболизме Н202 в хлоропластах in vivo.
Научная новизна работы
Разработаны методические приемы наблюдения в реальном времени светоиндуцированного образования Н202 внутри протопластов фотосин-тезирующих клеток растений с помощью конфокальной микроскопии. Показана возможность применения прижизненного флуоресцентного красителя H2DCF-DA для сравнительных исследований динамики образования Н20, в протопластах и выявлены ограничения этого метода. Впервые показана динамика образования Н202 в компартментах живых растительных клеток и обнаружены свидетельства выхода образующейся на свету Н202 из хлоропластов. Подтверждена ведущая роль аскорбат-пероксидазной системы клетки в утилизации Н202, образующейся в хлоропластах при освещении.
Практическая значимость работы
Разработанные методические подходы, позволяющие изучать динамику накопления и распределения перекиси водорода, основной АФК фотосинтезирующих клеток листьев, в процессе освещения, могут быть использованы для оценки устойчивости растений разных видов и сортов, к неблагоприятным изменениям окружающей среды, воздействию патогенов, гербицидов, удобрений. Они могут применяться при разработке способов направленной регуляции фотосинтеза. Результаты работы могут быть также использованы в лекциях и практических занятиях по ботанике, биохимии и физиологии растений, экологии.
Апробация работы
Основные положения работы представлены на годичном собрании общества физиологов России (г. Екатеринбург, 2008 г.), 19-х Пущинских чтениях по фотосинтезу и Всероссийской конференции "Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах" (г. Пущино, 2009 г.), Всероссийской научной конференции "Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды" (г. Иркутск, 2009 г.), 14-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (г. Пущино, 2010 г.), 10-й
международной конференции по активным формам кислорода и азота в растениях (г. Будапешт, Венгрия, 2011 г.)
Публикации
По теме диссертационной работы опубликовано 9 печатных работ, из них 4 статьи в реферируемых журналах, включая международные.
Структура диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, разделов, где представлены основные результаты и их обсуждение, заключения, выводов и списка цитируемой литературы.
Похожие диссертации на Исследование методом конфокальной микроскопии динамики светозависимой продукции H2O2 в протопластах фотосинтезирующих клеток высших растений
